外源物質處理對大果櫸扦插苗抗寒性的影響

霍 靜，白京凡，喬 虹，白晉華，郭紅彥

(山西農業大學 林學院，北方功能油料樹種培育與研發山西省重點實驗室，山西 太谷 030801)

大果櫸(Zelkovasinica)又名小葉櫸、抱櫸，為榆科櫸屬的一種落葉喬木[1]，是第三世紀溫帶森林孑遺物種[2]，也是山西省珍惜的鄉土樹種[3]。大果櫸較喜光、喜溫暖濕潤氣候，耐干旱、貧瘠，常生長在石灰巖發育的山地鈣質土壤上，在我國主要分布于甘肅、陜西、四川北部、湖北西北部、河南、山西南部和河北等地[4-5]。在大果櫸的栽培繁育過程中，低溫是限制其生長與分布的主要環境因素[3]。

低溫作為重要的非生物脅迫因子，對植物生長發育有重要影響，會造成植物新陳代謝等生理過程的紊亂，使生物膜和細胞結構遭受損傷[6-8]。關于林木抗寒性的研究已有諸多報道，在楊樹、楨楠、梨、核桃等植物[9-12]抗寒性的研究中發現，植物的抗寒性與相對電導率、MDA和可溶性蛋白含量等指標的變化具有一定相關性。研究表明，噴施外源物質能有效影響和控制植物的生長發育及對低溫脅迫的適應性[13]，低溫來臨前施用一定濃度的生長調節劑、CaCl2均可提高植物的抗寒性，緩解植物的低溫傷害[14]。PP333是一種高效、低毒的植物生長調節劑，能延緩生長、控制形態建成、提高植物抗性[15-16]；Ca2+不僅是植物生長發育所必需的礦質元素,且參與植物生長發育的調節過程，在細胞內逆境信號的轉導和植物對逆境的調節適應過程中發揮著重要作用[17]。目前，有關櫸屬植物抗寒性方面的研究引起人們的重視，經外源物質處理的大果櫸幼苗對低溫的生理響應尚未見報道。本研究根據大果櫸栽培過程中遇到的實際問題，探索不同濃度PP333與CaCl2處理對大果櫸抗寒性的影響，以期為提高大果櫸幼苗抗寒性提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為山西農業大學林學院苗圃中扦插的當年生大果櫸盆栽苗。于2018年3月底，選取生長基本一致、無病蟲害、直徑8 mm的大果櫸枝條剪成10 cm的插穗，以每缽一根的標準，分別插于裝有珍珠巖與草炭(比例為1∶1)、規格為10 cm×10 cm的營養缽中，日常管理使溫室內保持70%的濕度。待生根后將整株幼苗移栽到21 cm×21 cm的營養缽內，栽培基質為田土和營養土1∶1混合，基質約占營養缽體積的80%，每盆1株，置于室外，進行常規的澆水養護，緩苗至生長健壯后噴施外源物質、進行低溫脅迫。

1.2 試驗設計

試驗選用PP333和CaCl2處理大果櫸幼苗，設置對照(清水)、PP333(0.1%、0.15%)和CaCl2(20、25 mmol/L)共5個處理。于2018年8月15日早上8：00，將大果櫸盆栽苗分成5組，每個處理20株，進行葉面噴施，以葉面滴水為宜，每隔5 d噴1次，共處理3次。

于2018年10月中旬，隨機選取不同處理苗木的1年生枝條，每個處理選6株，每株采3個側枝，共90個枝條；將采集的枝條用濕報紙包裹帶回實驗室進行人工模擬低溫處理，設置4、-10、-15℃ 3個溫度梯度，各溫度均放不同處理采自不同植株的枝條6個，每個溫度30個枝條，低溫處理12 h。在4℃環境下解凍，分別取每個處理不同溫度條件下的枝條基部起第4～6位的葉片混勻、用于生理指標的測定，每個指標均重復測定3次。

2018年11月至2019年2月，統計自然越冬過程中不同處理大果櫸枝條的凍害級別，每月1次，共4次。

1.3 指標測定

光合色素含量采用乙醇浸提比色法[18]，可溶性蛋白含量按照G-250考馬斯亮藍法測定[19]，相對電導率采用電導法測定[20]，丙二醛含量采用硫代巴比妥酸法測定[19]。

參照李瑞雪[21]田間凍害調查法的標準對冬季不同處理大果櫸扦插苗的凍害等級進行統計，并在此基礎上稍有改動，共分為6級，依次為：0級，枝條無受凍現象；1級，枝條受凍比例<20%；2級，枝條受凍比例<40%；3級，枝條受凍<60%；4級，枝條受凍比例<80%；5級，幾乎所有枝條或整株幼苗凍死。

1.4 抗寒性綜合評價方法

參照玉蘇甫·阿不力提甫等[22]的方法，運用相關性分析和隸屬函數法對大果櫸的抗寒性進行綜合分析。隸屬函數值的計算方法如下：

如果指標與抗寒性為正相關，Zij=(Xij-Ximin)/(Ximax-Ximin)

如果指標與抗寒性為負相關，Zij= 1-(Xij-Ximin)/(Ximax-Ximin)

式中，Zij為第i個處理第j個指標的抗寒隸屬函數值；Xij為第i個處理第j個指標的測定值；Ximin和Ximax分別為各指標的最小值和最大值；后求出各處理的平均隸屬度進行比較。

1.5 數據處理

采用SPSS17.0、Excel2003進行數據處理和作圖，結合LSD與Duncan法進行方差分析與多重比較，各指標間采用Spearman系數進行相關性分析。

2 結果與分析

2.1 對低溫脅迫下大果櫸光合色素的影響

不同處理的大果櫸幼苗光合色素含量隨溫度降低均呈現出逐步下降的趨勢；與對照相比，噴施外源物質可不同程度減緩低溫脅迫下大果櫸光合色素的降解。在相同溫度條件下，經P1、P2、C1、C2處理的大果櫸葉片中葉綠素a含量、葉綠素b含量、葉綠素總量、類胡蘿卜素含量均高于對照；P2處理的大果櫸葉綠素a、葉綠素總量與對照相比差異顯著；C1、C2處理后的4個色素含量均顯著高于對照，且20 mmol/L CaCl2時達到峰值，處理效果最好。-15℃時，20 mmol/L CaCl2處理的大果櫸幼苗光合色素含量分別比對照高8.15、1.64、9.79、1.36 mg/g(圖1)。

注：不同小寫字母表示相同溫度不同處理間差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示相同處理不同溫度間差異顯著(P<0.05)。CK、P1、P2、C1、C2分別表示對照，0.1% PP333，0.15% PP333，20 mmol/L CaCl2，25 mmol/L CaCl2。下同。

2.2 對低溫脅迫下大果櫸可溶性蛋白含量的影響

相同低溫條件下，與對照相比，不同外源物質處理均可促進大果櫸葉片中可溶性蛋白含量的積累，延緩低溫脅迫下可溶性蛋白含量的減少。PP333處理后的可溶性蛋白含量隨濃度的增加而增加，CaCl2處理的大果櫸葉片中可溶性蛋白含量隨濃度的升高而降低，且CaCl2處理后的可溶性蛋白含量均高于PP333；其中，C1、C2在各溫度下的可溶性蛋白含量均顯著高于對照。不同低溫環境下，C1處理后的大果櫸幼苗可溶性蛋白含量比對照分別顯著增加7.34、8.59、6.19 mg/g，C2處理后的分別顯著提高5.26、5.19、5.07 mg/g，以20 mmol/L CaCl2促進效果最好(圖2)。

圖2 不同處理對低溫脅迫下大果櫸可溶性蛋白含量的影響Fig.2 Effects of different treatments on soluble protein content of Z.sinica

2.3 對低溫脅迫下大果櫸相對電導率的影響

研究結果表明(圖3)，各處理對不同低溫下大果櫸葉片的相對電導率均有顯著影響，與 CK相比，噴施外源物質不同程度降低了大果櫸葉片的相對電導率、減小了隨溫度降低各處理大果櫸幼苗相對電導率的上升幅度。在相同溫度條件下，P1、P2處理的大果櫸相對電導率均低于對照、但差異不顯著，C1、C2處理后大果櫸的相對電導率均顯著低于對照。2種外源物質分別以P2、C1處理效果較好；C1處理可顯著減緩相對電導率的增加，且對-15℃脅迫后大果櫸幼苗相對電導率的影響最大，與CK相比顯著降低35.75%。

圖3 不同處理對低溫脅迫下大果櫸相對電導率的影響Fig.3 Effects of different treatments on relative conductivity of Z.sinica

2.4 對低溫脅迫下大果櫸丙二醛含量的影響

不同低溫環境下，經外源物質處理的大果櫸幼苗MDA含量均低于對照，各處理在-10℃時的MDA含量與對照相比均差異顯著，分別降低30.69%，34.38%，60.09%，36.30%。PP333處理的大果櫸MDA含量隨濃度增加而降低，P2處理的MDA含量在-10℃、-15℃時與CK相比差異顯著；經C1、C2處理后的大果櫸MDA含量在不同溫度下均顯著低于對照。不同處理大果櫸的MDA含量均隨溫度降低而不斷上升，從-10℃～-15℃，PP333處理與對照組的大果櫸幼苗MDA含量均顯著升高，C1、C2處理的大果櫸MDA含量升高不顯著，且C1處理后的大果櫸MDA含量在不同溫度下均最低、隨溫度降低其上升幅度最小(圖4)。

圖4 不同處理對低溫脅迫下大果櫸丙二醛含量的影響Fig.4 Effects of different treatments on MDA content of Z.sinica

2.5 不同處理對大果櫸幼苗越冬過程中凍害程度的影響

在自然越冬過程中，大果櫸幼苗有不同程度的凍害現象。與對照相比(表1)，噴施外源物質均可不同程度減緩大果櫸幼苗的受凍害情況。2018年11月，不同處理大果櫸幼苗均沒有發生凍害現象。2018年12月，部分處理的大果櫸幼苗枝條開始出現凍害，且隨時間推移，受凍害程度不斷加深。到2019年2月，對照組大果櫸幼苗受凍害最嚴重、凍害級別達5級；經P1和P2處理的大果櫸幼苗凍害級別分別為4級、3級；經CaCl2處理的大果櫸幼苗耐寒力較好，噴施20 mmol/L CaCl2的大果櫸受凍害程度最低，凍害級別為1級。

表1 自然越冬過程中各處理大果櫸的凍害級別Table 1 Freezing damage levels of Z.sinica during the natural over wintering process

2.6 大果櫸各抗寒指標之間的相關性

對不同處理大果櫸幼苗各生理指標與凍害級別之間的相關性分析結果(表2)表明，光合色素、可溶性蛋白含量與凍害級別呈極顯著負相關，其值越高，凍害程度越低，抗寒性越強；相對電導率、MDA含量與凍害級別呈極顯著正相關，其值越高，凍害程度越嚴重，抗寒性越弱。

表2 大果櫸各抗寒指標間的相關系數Table 2 Correlation coefficients among cold resistance indexes of Z.sinica

2.7 不同處理對大果櫸幼苗抗寒性影響的綜合評價

對不同濃度PP333、CaCl2處理大果櫸幼苗的各項生理指標進行隸屬函數分析，綜合評價各處理對低溫脅迫下大果櫸抗寒性的影響。外源物質對大果櫸抗寒性影響的綜合評價值均高于對照(表3)，低溫下各處理的隸屬函數值排序依次為C1>C2>P2>P1>CK，與自然越冬后不同處理大果櫸凍害級別所反映出的結果相一致，以20 mmol/L CaCl2緩解大果櫸低溫傷害的效果最好。

表3 不同處理對大果櫸抗寒性影響的綜合評價Table 3 Comprehensive evaluation of the effects of different treatments on cold resistance of Z.sinica

3 討論

3.1 對低溫脅迫下大果櫸幼苗光合色素的保護作用

光合作用為植物生長、發育提供所需的物質和能量，是植物生長發育的基礎。低溫對植物光合色素產生、光系統活性及光合能量代謝等一系列過程都有不同程度的影響[23]。具體表現為，低溫脅迫會抑制光合作用反應中酶活性的水平，破壞葉綠體雙層膜結構，引起光合色素降解[24]，導致光合能力下降，進而影響植物的其他生理代謝過程[13-14,25]。本研究發現，在低溫脅迫下，經PP333、CaCl2處理后的大果櫸幼苗葉片葉綠素和類胡蘿卜素含量有所提高，說明適宜濃度的外源PP333和CaCl2對大果櫸葉綠素的結構和功能具有一定的保護作用，在遭遇低溫脅迫時仍能夠維持其結構與功能、發揮正常的生理作用，這與于永暢等[26]對國蘭、孫兵等[27]對楨楠和閩楠抗寒性的研究結果相一致。可能原因是外源物質起到調節植物細胞的作用，最終減少低溫對葉綠體的破壞，在促進光合色素合成的同時，保護光合色素的結構，使細胞內光合色素的含量維持在一個較高水平。

3.2 對低溫脅迫下大果櫸幼苗的滲透調節作用

可溶性蛋白是廣泛存在于植物細胞液中能夠調控滲透壓的物質之一[28]，在植物細胞中含量的高低與植物抗寒性之間有著密切的關系[14]。研究表明，噴施適當濃度的外源物質可誘導植物體內產生并積累一定量的可溶性蛋白，進而增加植物細胞滲透壓、減緩細胞內水分損失，以增強植株對低溫的抵抗力[14,29]。可溶性蛋白含量的上升還能降低植物細胞液的冰點，從而提高植物對低溫的耐受力[27]。本研究發現，低溫脅迫前用PP333、CaCl2處理后的大果櫸幼苗，其可溶性蛋白含量均顯著升高，說明經外源物質處理的大果櫸幼苗在低溫脅迫下可通過自身的調節能力而自發產生某種對低溫脅迫的適應機制，積累一定的蛋白含量，緩解低溫脅迫帶來的傷害，這與梁永富等[30]關于生長調節劑對低溫脅迫下酸橙影響的研究結果相一致，且可溶性蛋白含量與大果櫸抗寒性呈正相關，其含量越高，抗寒性越強。

3.3 對低溫脅迫下大果櫸幼苗細胞膜的保護作用

在低溫環境下，植物敏感和最易傷害的部位是細胞膜[31]。植物處于逆境時，其體內活性氧代謝失調致使細胞膜被破壞、透性增加，細胞內溶質向胞間滲漏，從而導致植物的電導率增加[13]，嚴重時還會發生膜脂過氧化作用。相對電導率是反映細胞膜透性大小的指標，其值越大，說明受脅迫后細胞膜的透性越大[14,32]；MDA是反映生物膜過氧化程度的指標，其含量多少可以體現細胞膜受傷害的程度[6,32]，MDA含量積累越多，膜系統受傷害越嚴重，MDA含量與植物抗寒性呈負相關性[22,33]，本研究中MDA和相對電導率與大果櫸幼苗凍害級別呈極顯著正相關的結果與此相一致。噴施PP333、CaCl2可顯著減緩大果櫸幼苗在低溫脅迫下葉片中MDA含量和相對電導率的上升，且隨溫度降低CaCl2處理的大果櫸幼苗MDA含量升高不顯著，說明經CaCl2處理后大果櫸幼苗的細胞膜系統在低溫脅迫下受害程度較低。總之，葉面噴施外源物質可以減少活性氧的產生，降低膜脂過氧化的程度，有效抵御低溫對大果櫸幼苗的傷害，從而提高了大果櫸幼苗的抗寒性，這與王麗特等[24]關于4種化學調控劑對煙草幼苗耐冷性、周偉權等[34]對庫爾勒香梨抗寒性的研究結果相類似。

3.4 大果櫸幼苗抗寒性的綜合評價

植物各抗寒性指標間有一定的相關性[22,33,35]。本研究結果表明，低溫脅迫下大果櫸幼苗的凍害級別與其相對電導率、MDA含量呈極顯著正相關，與光合色素、可溶性蛋白含量呈極顯著負相關；在低溫脅迫下，大果櫸幼苗相對電導率、MDA含量越低，葉綠素、可溶性蛋白含量越高，其受凍害程度越低，抗寒性越強。采用單一指標評價植物的抗寒性不具有代表性，應采用多個指標對其抗寒能力進行綜合評價[22,34-35]。本研究運用模糊數學的隸屬函數法能較全面地反映不同處理大果櫸幼苗的抗寒性強弱，平均隸屬度越大，表明抗寒能力越強，反之抗寒能力越弱[21-22]。結合自然越冬后各處理凍害級別和抗寒性綜合評價結果可知，經PP333、CaCl2處理后的大果櫸幼苗在低溫脅迫條件下其抗寒能力均有所提高，以20 mmol/L CaCl2處理的抗寒性效果最好，可為今后大果櫸生產提供可靠的依據。

4 結論

低溫是影響大果櫸生長的重要環境因子之一，在大果櫸栽培過程中應采取相應抗寒措施降低大果櫸樹苗的低溫傷害，以確保其正常越冬。本研究發現，在低溫來臨之前，葉面噴施PP333、CaCl2均能夠減緩低溫脅迫下大果櫸幼苗光合色素的下降趨勢，促進可溶性蛋白的積累，降低細胞膜的相對電導率和MDA含量，并最終提高低溫脅迫下大果櫸幼苗的抗寒性。不同處理對大果櫸抗寒性影響的隸屬函數綜合評價結果與自然越冬后凍害級別的統計結果相一致，以20 mmol/L CaCl2處理的大果櫸幼苗抗寒效果最好。