基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的甲潑尼龍治療腹膜纖維化作用機(jī)制研究*

蔡家駒，戴衛(wèi)波，吳惠妃，葉秋明，蕭俊祺

（廣東省中山市中醫(yī)院，廣東 中山 528400）

腹膜纖維化（PF）為長(zhǎng)期腹膜透析（PD）患者的主要和嚴(yán)重并發(fā)癥，是導(dǎo)致PD 失敗的主要原因［1］，目前仍缺乏有效的防治措施。甲潑尼龍（MP）屬糖皮質(zhì)激素，具有抑制結(jié)締組織中成纖維細(xì)胞增生及膠原合成的作用，可用于治療以增生為主的慢性炎癥，如肺間質(zhì)纖維化［2］。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可借助分子生物學(xué)和相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)信息，從組織水平預(yù)測(cè)藥物對(duì)疾病治療作用的機(jī)制［3］。本研究中采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，通過(guò)構(gòu)建并分析化學(xué)成分－疾病－作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，從整體上揭示MP 治療PF 多靶點(diǎn)、多途徑的作用機(jī)制，為進(jìn)一步探討MP 治療PF 的療效提供參考。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 運(yùn)用數(shù)據(jù)庫(kù)和工具

數(shù) 據(jù) 庫(kù) ：PubChem（https：／ ／pubchem.ncbi.nlm.nih.gov ／），Swiss Target Prediction （http：／ ／www. swisstargetprediction.ch ／），GeneCards（https：／ ／www.GeneCards.org ／）， OMIM（https：／ ／omim.org ／）， STRING v11.0（http：／ ／String － db.org ／）。工具：Bioconductor（http：／ ／www.Bioconductor.org ／），R v3.6.3 軟 件 （https：／ ／www.r－ project.org ／），Cytoscape v3.7.2 軟件（http：／ ／Cytoscape.org ／）。

1.2 化學(xué)成分作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

通過(guò)PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索MP 的化學(xué)結(jié)構(gòu)，并以sdf 格式保存其 2D 結(jié)構(gòu)，然后將 sdf 文件導(dǎo)入Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫(kù)中，限定研究物種為人類（Homospiens），查詢MP 的潛在作用靶點(diǎn)信息。

1.3 疾病靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

以“Peritoneal Fibrosis”作為關(guān)鍵詞，在 GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)和OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)中分別檢索，查找與PF 相關(guān)的基因，合并相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)，刪除重復(fù)和假陽(yáng)性基因，獲得PF 的作用靶點(diǎn)信息數(shù)據(jù)集。

1.4 化學(xué)成分－疾病－作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

采用編程軟件R v3.6.3 編寫命令代碼，分別導(dǎo)入1.2 與1.3 項(xiàng)下所得相關(guān)靶點(diǎn)信息文件，并繪制 Venn圖，獲得MP 靶點(diǎn)基因和PF 靶點(diǎn)基因交集文件，用于網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析。

1.5 化學(xué)成分－疾病－作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和分析

根據(jù) 1.4 項(xiàng)下的作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果，使用Cytoscape 3.7.2 軟件構(gòu)建化學(xué)成分－疾病－作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，節(jié)點(diǎn)代表藥物、疾病及作用靶點(diǎn)；邊分別用作連接藥物與作用靶點(diǎn)、疾病與作用靶點(diǎn)，體現(xiàn)化學(xué)成分－疾病－作用靶點(diǎn)間的聯(lián)系。

1.6 蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和分析

利用 STRING v11.0 數(shù)據(jù)庫(kù)導(dǎo)入 MP 和 PF 的共同靶點(diǎn)基因文件，限定研究物種為人類（Homosapiens），搜索獲得PPI 網(wǎng)絡(luò)，并以tsv 格式文件導(dǎo)出。將該文件中node1，node2，Combined score 信息分別導(dǎo)入 Cytoscape v3.7.2 軟件，構(gòu)建 PPI 網(wǎng)絡(luò)，然后利用該軟件的插件Network Analyzer 分析網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，獲取節(jié)點(diǎn)度（degree）、介數(shù)中心性（BC）、緊密中心性（CC）等網(wǎng)絡(luò)信息。

1.7 靶點(diǎn)生物功能注釋分析

Bioconductor 是一個(gè)通過(guò)應(yīng)用編程軟件R 對(duì)高通量基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和解釋的工具。首先加載Bioconducter 的Clusterprofiler 包，然后導(dǎo)入作用靶點(diǎn)的基因數(shù)據(jù)并運(yùn)行代碼，對(duì)化學(xué)成分－疾病－作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中的基因進(jìn)行基因本體（GO）功能注釋，以及京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析，設(shè)定P ＜0.01 為有顯著性，將結(jié)果分別以柱狀圖和氣泡圖形式呈現(xiàn)，并根據(jù)富集因子值分析核心通路的富集程度，展示MP 治療PF 的作用通路。

2 結(jié)果

2.1 化學(xué)成分靶點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果

利用Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫(kù)合并重復(fù)數(shù)據(jù)后，共收集到MP 的潛在靶點(diǎn)100 個(gè)。其中，核受體占26.7%，分泌蛋白占 20.0%，酶占 13.3%。詳見圖 1。MP占比居前10 位的作用靶點(diǎn)基因見表1。

圖1 MP 潛在靶點(diǎn)分類Fig.1 Classification of potential targets of MP

表1 MP 占比前10 位作用靶點(diǎn)基因Tab.1 Top 10 MP target genes

2.2 PF 靶點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果

檢索GeneCards 和OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)，合并數(shù)據(jù)并剔除重復(fù)靶點(diǎn)后，共獲得2 104 個(gè)PF 疾病靶點(diǎn)基因。靶點(diǎn)類型主要為蛋白質(zhì)（Protein Coding）和 RNA 基因（RNA Gene）。按相關(guān)性得分大小列出前10 位靶點(diǎn)基因，詳見表2。

表2 PF 相關(guān)性居前10 位的作用靶點(diǎn)基因Tab.2 Top 10 PF target genes

2.3 化學(xué)成分－疾病－作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果

將MP 及PF 各自的作用靶點(diǎn)信息導(dǎo)入編程軟件R，通過(guò)繪制Venn 圖，共獲得65 個(gè)共同靶點(diǎn)基因（見圖2）。分別為白細(xì)胞介素6（IL－6）、表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）、絲裂原活化蛋白激酶 1（MAPK1）、絲裂原活化蛋白激酶 3（MAPK3）、絲裂原活化蛋白激酶 14（MAPK14）、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR），以及TJP1，ALOX12，SOD2，CCNE1，MUC1，RAB7A，HBB，DICER1，NR3C1，AR，ADAM17，GLUL，GPBAR1，SHBG，PGR，CYP19A1，HSD11B2，NOS2，ADORA3，ESR2，PTGS1，CDC25A，PRKCA，MPO，TKT，CA12，CDK1，CREBBP，XIAP，RBP4，MAP3K5，JAK1，MAP2K1，SLC5A1，HLCS，ALPL，GRK2，CNR1，EIF2AK3，JAK2，PTPN11，ERBB2，ERBB4，PARP1，ADK，MAP3K8，SLC18A3，ALOX5，CDK2，KIT，F(xiàn)LT3，PIM1，KDR，MAP2K2，PIK3CA，ALK，ADORA1，OPRM1，TTR。

圖2 65 個(gè)共同靶點(diǎn)基因的Venn 圖Fig.2 Venn diagram of 65 common target genes

2.4 化學(xué)成分－疾病－作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)分析

使用 Cytoscape v3.7.2 軟件導(dǎo)入 MP 與 PF 的共同靶點(diǎn)基因，建立化學(xué)成分－疾病－作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖（見圖 3）。

圖3 化學(xué)成分－疾病－作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖Fig.3 PPI network diagram of ingredient－disease－target

2.5 PPI 網(wǎng)絡(luò)分析

將 MP 與 PF 的共同靶點(diǎn)基因?qū)?STRING v11.0數(shù)據(jù)庫(kù)中，獲取一個(gè)包含65 個(gè)節(jié)點(diǎn)和383 條邊的PPI網(wǎng)絡(luò)（見圖 4）。采用 Cytoscape v3.7.2 軟件分析其拓?fù)湫再|(zhì)，一般認(rèn)為節(jié)點(diǎn)度（degree）值不低于所有節(jié)點(diǎn)度2 倍中位數(shù)的節(jié)點(diǎn)，即對(duì)整個(gè)網(wǎng)絡(luò)具有重要貢獻(xiàn)意義。65 個(gè)共同靶點(diǎn)中，degree 值大于中位數(shù)（degree ＝ 12）2 倍的靶點(diǎn)共有 8 個(gè)（見表 3）。

表3 PPI 網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果（degree ＞ 24）Tab.3 Results of PPI network analysis（degree ＞ 24）

圖4 65 個(gè)共同靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)分析圖Fig.4 PPI network diagram of 65 common target

2.6 GO 功能注釋及KEGG 通路富集分析結(jié)果

為進(jìn)一步闡明MP 對(duì)PF 的作用機(jī)制，利用Bioconductor 輸入代碼，對(duì)化學(xué)成分－疾病－作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中的65 個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行GO 功能注釋，結(jié)果共獲得53 個(gè)條目，其中具有顯著意義（P ＜ 0.01）的有 19 條。由圖 5 和圖 6 可見，MP 靶點(diǎn)主要富集在 protein serine／threonine kinase activity（GO：0004674），protein tyrosine kinase activity（GO：0004713），phosphatase binding（GO：0019902），transmembrane receptor protein tyrosine kinase activity（GO：0004714），transmembrane receptor protein kinase activity（GO：0019199），steroid binding（GO：0005496），heme binding（GO：0020037），protein phosphatase binding（GO：0019903），tetrapyrrole binding（GO：0046906），hormone receptor binding（GO：0051427）等生物過(guò)程中。此外，通過(guò)KEGG 分析富集到MP 與PF 治療靶點(diǎn)相關(guān)的基因通路共 10 條（圖 7 和圖 8），具有顯著意義（P ＜0.01）的有7 條，包括 MAPK signaling pathway（hsa04010），EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance（hsa01521），Rap1 signaling pathway（hsa04015）， Ras signaling pathway（hsa04014），ErbB signaling pathway（hsa04012），Endocrine resistance（hsa01522），Platinum drug resistance（hsa01524）等。

圖5 65 個(gè)共同靶點(diǎn)的GO 分析結(jié)果柱狀圖Fig.5 A bar chart of GO enrichment analysis of 65 common targets

圖6 65 個(gè)共同靶點(diǎn)的GO 分析結(jié)果氣泡圖Fig.6 A bubble chart of GO enrichment analysis of 65 common targets

圖7 65 個(gè)共同靶點(diǎn)的KEGG 通路富集分析結(jié)果柱狀圖Fig.7 A bar chart of KEGG enrichment analysis of 65 common targets

圖8 65 個(gè)共同靶點(diǎn)的KEGG 通路富集分析結(jié)果氣泡圖Fig.8 A bubble chart of KEGG enrichment analysis of 65 common targets

3 討論

本研究中通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，利用多個(gè)在線數(shù)據(jù)庫(kù)，收集到100 個(gè)不重復(fù)的MP 作用靶點(diǎn)，并預(yù)測(cè)到2 104 個(gè)不重復(fù)的PF 疾病靶點(diǎn)，通過(guò)繪制Venn 圖得到65 個(gè)共同靶點(diǎn)基因，并以此構(gòu)建了化學(xué)成分－疾病－作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，獲得了1 個(gè)具有65 個(gè)節(jié)點(diǎn)和383 條邊的PPI 關(guān)系網(wǎng)絡(luò)；網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示，在65 個(gè)作用靶點(diǎn)中，degree 值大于 24 的靶點(diǎn)有 8 個(gè)，包括 IL－6，MAPK3，MAPK1，EGFR，mTOR，MAPK14 等；此外，通過(guò)GO 功能注釋和KEGG 富集分析，對(duì)65 個(gè)共同靶點(diǎn)基因進(jìn)行了分析，并根據(jù) P ＜0.01 確定了 19 條 GO 分析信息及7 條作用通路，如蛋白絲氨酸／蘇氨酸激酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性、MAPK 信號(hào)通路和EGFR 信號(hào)通路等。

IL－6 是一種多效性細(xì)胞因子，能刺激細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)增生，參與炎性反應(yīng)。IL－6 可由成纖維細(xì)胞、間皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞生成。在PD 過(guò)程中，腹腔會(huì)局部產(chǎn)生IL－6，且在產(chǎn)生腹膜炎時(shí)明顯升高［4－5］。經(jīng)常性炎性反應(yīng)可激活適應(yīng)性免疫反應(yīng)，使基質(zhì)中的細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)生改變，從而導(dǎo)致纖維化和慢性炎癥［6］。上皮間質(zhì)分化（EMT）是指上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細(xì)胞的生物學(xué)過(guò)程，在慢性炎癥和多種纖維化疾病中發(fā)揮重要作用［7］。研究證實(shí)，IL－6通過(guò)激活JAK2／STAT3 信號(hào)通路，誘導(dǎo)人腹膜間皮細(xì)胞（HPMC）發(fā)生 EMT，最終引起 PF［8］。糖皮質(zhì)激素具有明顯的抗炎作用，可抑制腫瘤壞死因子－α（TNF－α），IL －6，IL －8 等多種炎性細(xì)胞因子生成。因此，MP 可能通過(guò)調(diào)控IL－6 起到抑制PF 的作用。

mTOR 是位于磷脂酰肌醇3 激酶 ／絲氨酸激酶（PI3K／AKT）通路下游的一種重要的絲氨酸／蘇氨酸激酶，在細(xì)胞內(nèi)作為功能性亞基參與mTORC1 和mTORC2 2 種復(fù)合體的形成。mTORC1 可被生長(zhǎng)因子、氨基酸、氧、能量等激活，通過(guò)影響mRNA 翻譯，蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核苷酸的合成，細(xì)胞自噬等生物過(guò)程調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝［9］。mTORC2 的功能主要體現(xiàn)在細(xì)胞存活、遷移等方面［10］。研究顯示，PI3K －AKT － mTOR 信號(hào)通路的異常與多種纖維化性疾病有關(guān)，如肺纖維化［11］、腎臟纖維化［12］等。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β1（TGF － β1）是公認(rèn)的強(qiáng)致纖維化因子。近年來(lái)有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，HPMC 在 TGF － β1的刺激下，mTOR 信號(hào)通路活化及纖維化改變，提示mTOR 信號(hào)通路也參與到 PF 的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中［13］。據(jù)此推測(cè)，調(diào)控mTOR 通路可能是MP 治療PF 的一個(gè)重要途徑。

根據(jù)KEGG 通路富集分析結(jié)果，MAPK 通路富集基因最多，如PPI 網(wǎng)絡(luò)分析中dgree 值較高的靶點(diǎn)MAPK3（ERK1），MAPK1（ERK2），MAPK14（p38α）均屬 MAPK家族成員。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路主要有細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK1／2）、Jun 氨基末端激酶（JNK）和 p38 3 條通路。ERK1 ／2 通路可調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化，JNK 和p38 通路在炎癥與細(xì)胞凋亡等應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。研究顯示，ERK1／2 和p38 信號(hào)通路均參與了 PF 的發(fā)病過(guò)程［14－17］，兩者在 TGF － β1致HPMC 細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度表達(dá)中起調(diào)控作用［15－17］。因此，MP 可能通過(guò)作用于 MAPK 通路中的 ERK1／2 和 p38信號(hào)通路，實(shí)現(xiàn)對(duì)PF 的調(diào)控。

EGFR 是一種具有酪氨酸激酶活性的受體，受表皮生長(zhǎng)因子（EGF）和TNF－α 等配體的激活后，通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)將有絲分裂的信號(hào)從細(xì)胞表面?zhèn)鞯郊?xì)胞核內(nèi)，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化等生理過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)，PD患者的 HPMC 表達(dá) EGFR 及其配體 EGF［18］，EGFR 信號(hào)通路的激活參與了 HPMCs 的 EMT 過(guò)程［19］，給予 EGFR 阻斷劑后可減少 PF 程度［19－20］。由此推測(cè)，MP 可能也通過(guò)干擾EGFR 信號(hào)通路的激活機(jī)制而起到抑制PF 的作用。

綜上所述，采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，通過(guò)構(gòu)建化學(xué)成分－疾病－作用靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)MP 可能具有抗 PF 的作用，其作用機(jī)制與 IL －6，mTOR，EGFR，MAPK 通路等相關(guān)。