兩款酶聯(lián)免疫吸附試劑盒檢測玉米嘔吐毒素的性能評價(jià)

何詠怡，古汶玉，鄧常繼，湯敏兒，鐘國才，陳 威*

（廣東省糧食科學(xué)研究所,廣州 510000）

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（Deoxynivalenol）又稱為嘔吐毒素 （vomitoxin），主要是禾谷鐮刀菌（Fusarium.graminearum）和黃色鐮刀菌（Fusarium.culmorum）等真菌產(chǎn)生的次生代謝物，具有急性毒性、胃腸道毒性、肝毒性、免疫毒性、發(fā)育毒性、生殖毒性、神經(jīng)毒性和核糖體毒性[1]。玉米是我國第一大糧食作物[2]，由于其基質(zhì)是霉菌生長繁殖理想溫床，玉米經(jīng)常面臨鐮刀菌屬等霉菌污染的風(fēng)險(xiǎn)[3]，Yan等最近發(fā)表調(diào)查結(jié)果顯示2017年中國玉米樣品中嘔吐毒素的檢出率甚至接近100%[4]。據(jù)此，為了及時(shí)制定預(yù)防和控制嘔吐毒素污染策略和保障糧食安全提供支撐，定時(shí)篩查玉米中嘔吐毒素含量十分必要。

目前嘔吐毒素的檢測方法主要基于免疫分析、色譜分析和質(zhì)譜分析原理[5]。基于色譜和質(zhì)譜分析的方法主要包括高效液相色譜法、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等，上述方法準(zhǔn)確性高，但樣品處理方法復(fù)雜且耗時(shí)、需要昂貴的儀器設(shè)備和專業(yè)的操作人員[6]。免疫學(xué)方法基于抗原和抗體反應(yīng)，其中基于熒光極化免疫分析和化學(xué)發(fā)光酶免疫分析的方法檢測靈敏度高，但檢測結(jié)果穩(wěn)定性差；利用膠體金免疫層析可在現(xiàn)場快速篩查，但其不能高通量檢測[7-8]。與上述方法相比，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）具有靈敏度高、重復(fù)性和再現(xiàn)性佳、低成本和高通量的優(yōu)點(diǎn)，是最常用的篩查方法[5,9]。隨著國家糧食安全戰(zhàn)略全面實(shí)施，將對嘔吐毒素檢測試劑盒質(zhì)量提出更高的標(biāo)準(zhǔn)。為此，本文從靈敏度、基質(zhì)效應(yīng)、回收率、重復(fù)性和與仲裁方法一致性等方面，對比兩款市售嘔吐毒素ELISA試劑盒的檢測性能，為試劑盒的選取和提高檢測結(jié)果準(zhǔn)確性提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

本試驗(yàn)選取玉米樣品為黑龍江2019年產(chǎn)玉米。嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)品購于國家糧食和物資儲備局科學(xué)研究院（編號：GBW(E)100304）。試驗(yàn)用水為超純水，甲醇和乙腈為色譜純（德國默克）。測評使用的兩款國產(chǎn)嘔吐毒素ELISA檢測試劑盒生產(chǎn)批號 （生產(chǎn)批次）為 20200825和Z2J00G07。

1.2 儀器與設(shè)備

BLH-560K高速全自動(dòng)錘式旋風(fēng)磨 （浙江伯利恒儀器設(shè)備有限公司）；2-16PX離心機(jī) （德國西格瑪）；MixPlus渦旋震蕩儀（合肥艾本森科學(xué)儀器有限公司）；Multiskan FC酶標(biāo)儀 （賽默飛世爾科技公司）；1260高效液相色譜儀配備紫外檢測器（安捷倫科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 ELISA檢測玉米嘔吐毒素含量

玉米中嘔吐毒素ELISA檢測的樣品處理和檢測方法按照試劑盒說明書嚴(yán)格執(zhí)行。

樣品處理方法：準(zhǔn)確稱取5±0.01 g粉碎樣品于50 mL離心管中，加入25 mL超純水，200 r/min下渦旋10 min，4 000 r/min離心5 min，收集上清液并以1:4比例使用超純水稀釋后用于檢測嘔吐毒素含量。

檢測步驟：加入50 μL標(biāo)準(zhǔn)品或樣本至微孔中，依次加入50 μL酶標(biāo)物和抗試劑，25℃下避光反應(yīng)15 min后，甩干板內(nèi)液體，加入洗滌液洗滌4次。充分拍干孔內(nèi)液體后，立即加入100 μL底物液，25℃下避光反應(yīng)5 min后加入50 μL終止液，在酶標(biāo)儀雙波長（450/630 nm）模式下檢測。

1.3.2 高效液相色譜法檢測玉米嘔吐毒素含量

參照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的測定》（GB 5009.111-2016）中的免疫親和層析凈化高效液相色譜法驗(yàn)證玉米樣品嘔吐毒素含量。液相色譜條件：C18柱（25cm×4.6 mm×5 μm），柱溫 35 ℃，流動(dòng)相為水-甲醇-乙腈（體積比為 70:15:15），流速為 0.8 mL/min，進(jìn)樣體積為50 μL，檢測波長為218 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢出限和定量限

利用兩款試劑盒檢測經(jīng)液相色譜驗(yàn)證為陰性的玉米樣品測定試劑盒檢出限和定量限，試劑盒檢出限為樣本的檢測平均值加上3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差，定量限為樣本的檢測平均值加上10倍標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果如表1。兩款試劑盒說明書中標(biāo)識檢出限分別為200 μg/kg 和 250 μg/kg，GB 5009.111-2016 酶聯(lián)免疫吸附篩查法中檢出限和定量限分別為200 μg/kg和250 μg/kg，兩款試劑盒的檢出限和定量限等值見表1，其限量值小于說明書標(biāo)識值和國家標(biāo)準(zhǔn)值，靈敏度均符合檢測要求，且A試劑盒靈敏度更高。ELISA試劑盒的檢出限一定程度上受樣品基質(zhì)的影響而改變[10]，這可能是玉米樣品檢測限低于說明書標(biāo)識值原因之一。

表1 試劑盒A和試劑盒B的檢出限和定量限 μg/kg

2.2 基質(zhì)效應(yīng)

試劑盒A檢測含量相當(dāng)于0、200、700、2 100和7 000 μg/kg的標(biāo)準(zhǔn)品；試劑盒B檢測含量相當(dāng)于0、250、750、2 250 和 6 750 μg/kg 的標(biāo)準(zhǔn)品；同時(shí)分別使用試劑盒A和試劑盒B檢測陰性樣品基質(zhì)溶液配制的含量相當(dāng)于 0、200、800、2 000 和 7 000μg/kg的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品；以嘔吐毒素濃度為橫坐標(biāo)，吸光值比值（B/B0）作為縱坐標(biāo)，繪制兩款試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線和基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）并計(jì)算曲線IC50（表2）。

圖1 兩款嘔吐毒素ELISA試劑盒測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線和基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線

表2 兩款嘔吐毒素ELISA試劑盒IC50

由于樣品中色素、淀粉、蛋白質(zhì)和脂肪等物質(zhì)可能會(huì)阻礙抗原和抗體結(jié)合，使免疫分析敏感性下降，最終影響檢驗(yàn)的準(zhǔn)確性[7]。兩款試劑盒檢測所獲標(biāo)準(zhǔn)曲線和基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線幾乎重疊（圖1），標(biāo)準(zhǔn)曲線IC50和基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線IC50差異不大 （表2），表明在200～7 000 μg/kg濃度范圍內(nèi)兩款試劑盒對玉米嘔吐毒素的檢測受基質(zhì)干擾較少。此外，從圖1可以看出試劑盒B的測量結(jié)果線性范圍 （200～7 000 μg/kg）較試劑盒 A（200～2 100 μg/kg）廣，選擇試劑盒 B檢測嘔吐毒素含量大于2 100 μg/kg的玉米樣品有助于獲得更準(zhǔn)確結(jié)果。

2.3 回收率

分別使用兩款試劑盒檢測含量相當(dāng)于500和1800 μg/kg的陰性玉米基質(zhì)的嘔吐毒素加標(biāo)樣品，每個(gè)濃度重復(fù)3次，兩款試劑盒加標(biāo)回收率結(jié)果見表3，試劑盒A和試劑盒B的回收率分別為83.1%～92.4%和83.8%～107.4%，回收率的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在3.0%～3.4%和5.9%～8.3%。回收率可在一定程度上反映檢測方法的準(zhǔn)確性，一般要求回收率在70%～140%之間[11]，上述結(jié)果表明兩款試劑盒均符合檢測要求，且試劑盒B回收率更高。

表3 兩款嘔吐毒素ELISA回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.4 重復(fù)性

分別使用兩款試劑盒檢測含量為500 μg/kg和3 352 μg/kg樣品，每個(gè)樣品重復(fù)3次，結(jié)果見表4，試劑盒A變異系數(shù)和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為4.1%～4.5%和7.0%～9.4%，試劑盒B變異系數(shù)和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.0%～3.2%和5.1%～7.4%。一般要求重復(fù)測量變異系數(shù)小于10%，GB 5009.111-2016規(guī)定兩次ELISA試劑盒重復(fù)測量結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)偏差不得超過25%，即兩款試劑盒重復(fù)性符合國家標(biāo)準(zhǔn)要求。

表4 兩款嘔吐毒素ELISA試劑盒重復(fù)性結(jié)果

ELISA洗板可去除未結(jié)合的酶標(biāo)物，同時(shí)消除非特異吸附的蛋白質(zhì)等的干擾[6,11]，洗滌不充分可能導(dǎo)致吸光值升高。兩款試劑盒檢測流程的洗板過程的洗滌液添加量和洗板時(shí)間不同 （試劑盒A為250 μL洗滌液，洗滌間隔10 s；試劑盒 B為 300 μL洗滌液，洗滌間隔30 s）可能是B試劑盒重復(fù)性高于A試劑盒的原因之一。此外，樣品提取液及ELISA試劑盒的酶標(biāo)物和抗試劑溶液粘稠，反向取液不易產(chǎn)生氣泡，采用反向取液加入上述試劑可減少相對誤差，提高檢測的重復(fù)性[12]。

2.5 與仲裁方法一致性

兩款嘔吐毒素ELISA試劑盒法和免疫親和層析凈化高效液相色譜法對10個(gè)玉米樣品的檢測結(jié)果見表5，試劑盒A和試劑盒B測定與液相測定值正確度范圍分別在63.86%～104.90%和76.45%～117.55%；利用配對t檢驗(yàn)法對兩款試劑盒測定值與液相色譜法測定值的顯著性分析獲得tD分別為0.75（試劑盒A）和0.94（試劑盒B），兩款試劑盒的tD小于t0.05,10（2.23），表明兩款試劑盒測定值與液相色譜測定值間無顯著性差異。

表5 兩款嘔吐毒素ELISA試劑盒和高效液相色譜法對玉米樣品檢測結(jié)果

以液相色譜法測定值作為橫坐標(biāo)，試劑盒測定值作為縱坐標(biāo)繪制線性關(guān)系圖（圖2）,試劑盒A和試劑盒B回歸直線相關(guān)系數(shù)分別為0.99068和0.98656，說明兩款試劑盒測定值與液相色譜法測定值相關(guān)性良好。盡管上述結(jié)果表明兩款試劑盒測定值與液相色譜法測定值一致性良好，但從單個(gè)樣品測定值看，兩款試劑盒存在假陰性檢測結(jié)果（樣品7和樣品8），為減少誤判，建議可對處于臨界值樣品多次檢測，及進(jìn)一步結(jié)合高效液相色譜法確定。

圖2 兩款嘔吐毒素試劑盒和高效液相色譜法對玉米樣品檢測值相關(guān)性

3 結(jié)論

兩款市售試劑盒測試均能夠在30 min內(nèi)完成10個(gè)以上樣品的檢測，檢測靈敏度高，樣品基質(zhì)干擾少，回收率和重復(fù)性能滿足檢測要求，并且與高效液相色譜法檢測值一致性良好。在使用ELISA試劑盒檢測時(shí)，采用反向取液和充分洗板有助于提高檢測重復(fù)性；為提高檢測準(zhǔn)確性，對于標(biāo)準(zhǔn)限量值附近檢測值的樣品建議進(jìn)行多次重復(fù)測量和利用高效液相色譜法檢測。