酶法提取杜仲葉活性成分的研究*

陳書明，陳 瑋

（三門峽市生物技術重點實驗室，三門峽職業技術學院，河南 三門峽 472000）

杜仲是我國特有樹種[1]，2018年納入藥食兩用物質管理，引發了新一輪的杜仲食用熱潮。杜仲葉中含有大量的活性成分如杜仲膠、綠原酸等[2-5]，2005版中國藥典將綠原酸定為評估杜仲品質的重要指標參數[6-7]。常規的提取方法因存在活性成分提取率低和有機物殘留問題，導致用杜仲葉開發精純性保健產品困難。隨著人們養生意識的加強，精純性保健品因其更好的功效將被越來越多的人選擇。

本項目以杜仲葉為原料，粉碎后通過添加復合酶制劑來提高提取物中活性成分含量、減少杜仲葉提取物中的青氣和酸澀味道，以期為杜仲葉活性成分精純產品的商業化生產提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

杜仲葉，靈寶帥華牧業有限責任公司提供；綠原酸標準品，中國食品藥品鑒定院產品；中性蛋白酶（酶活≥40萬 U/g）、果膠酶（酶活≥120萬 U/g）、纖維素酶（酶活≥1萬U/g）、單寧酶（酶活≥10萬 U/g），佳味源實業有限公司產品；其它化學試劑均為分析純或化學純。

1.2 儀器與設備

LH-08B連續流粉碎機，長沙市中勝制藥機械廠（湖南）；HA-4數顯恒溫水浴鍋，江西金壇市榮華儀器制器有限公司；UV-1100紫外可見分光光度計，上海美譜達儀器有限公司；德國賽多利斯MA150型電子水分分析儀，上海右一儀器有限公司；HA-4數顯恒溫水浴鍋，江西金壇市榮華儀器制器有限公司。

1.3 方法與步驟

1.3.1 提取工藝流程

杜仲葉→干燥→粉碎→酶解浸提→過濾去渣→測定活性成分含量

1.3.2 操作要點

（1）7月份采摘杜仲葉片，晾曬3～4 d后240℃殺青[8-9]。

（2）殺青處理后的杜仲葉片，粉碎機粉碎為粉末，然后過篩，根據粉末顆粒粗細分為六個等級，Ⅰ級為0～20目、Ⅱ級為20～40目、Ⅲ級為40～80目、Ⅳ級為80～120目、Ⅴ級為120～160目、Ⅵ級為160目以下。然后立即置于自封袋，在陰涼處遮光保存；

（3）以杜仲葉粉末質量計，纖維素酶、果膠酶、單寧酶、蛋白酶用量均設0.05%、0.10%、0.15%、0.20%4個梯度。制成杜仲葉與水質量比為1∶50的混合液，35℃、45℃、55℃水浴加熱60 min，同時做3組平行試驗。

（4）水浴后的樣液加1.5倍沸水，趁熱減壓過濾。

（5）對濾液進行水浸出物含量測定和綠原酸含量測定。

1.3.3 水浸出物含量測定

參照GB/T 8305-2013《茶水浸出物測定》。

按以下公式計算茶水浸出物含量：

式中：m0為樣品質量，單位為g；m1為干燥后茶渣質量，單位為g；ω為樣品干物質含量 （質量分數），單位為%。

1.3.4 綠原酸含量測定[10-11]

繪制標準曲線 精密稱取綠原酸標準品10 mg，用50 mL 95%乙醇溶解,轉移到200 mL容瓶量，加95%乙醇定容, 混勻。 吸取 1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、3.50、4.00 mL，分別置于 10 mL 容量瓶中，加95%乙醇到刻度，混均。330 nm處測定吸光度。以溶液的吸光度為縱坐標，綠原酸的濃度為橫坐標做綠原酸標準曲線圖。如圖1所示。

圖1 綠原酸的標準曲線圖

線性回歸得到計算公式為：y=0.496x（y為吸光度，x 為濃度）R2=0.999。

1.3.5 含水量測定

按照MA150型電子水分分析儀要求，把不同粉碎粒度的杜仲葉樣品分別鋪平放進水分分析儀樣品盤中，當顯示器中的質量數值恒定時停止處理，記錄數據，并繪制樣品不同含水量圖（見圖2）。

圖2 粉碎度對粉末含水量的影響

1.3.6 葉綠素含量測定

分別取各級杜仲葉粉末各2 g加乙醇20 mL，攪拌均勻，用乙醇沖洗玻璃棒，避光靜置30 min。過濾，用滴管吸取乙醇，沖洗濾紙及濾渣，直至無綠色為止，然后用棕色容量瓶定容至100 mL，搖勻。取葉綠素提取液在波長665 nm、645 nm和625 nm處測其吸光度，以95%乙醇作為空白對照。記錄數據，計算公式為:

根據葉綠素含量繪制樣品粒度與葉綠素含量圖（見圖3）。

圖3 粉碎度對水浸出物含量的影響

1.4 正交試驗設計

在單因素試驗之后，將蛋白酶用量（A）、果膠酶用量（B）、纖維素酶用量（C）、單寧酶用量（D）作為考察因素，以綠原酸浸出量為考察值，設計L9（34）正交設計試驗，正交設計因素和水平見表1，得到復合酶提取杜仲葉活性成分的最佳配比。

表1 正交試驗因素和水平 %

2 結果

2.1 杜仲葉片粉碎度對其營養成分的影響

2.1.1 粉碎度對粉末形態及含水量的影響

通過觀察，發現在Ⅰ級粉末中能見到大量杜仲膠，粉末之間由杜仲膠粘連在一起，在Ⅱ級粉末中能見到少量杜仲膠與粉末粘連現象，其他的粉末均無粘連現象；葉片的梗相對于葉片質地較硬，粉碎后一般為1～2 mm的小段存留在Ⅰ級中粉末中。

由圖2可知，樣品粉碎級別與含水量成負相關。粉碎度越大，其含水量越低。因此可推測干燥后的整片杜仲葉含水量可能大于10%。一般綠茶含水量超過8%就會霉變，杜仲葉含水量超過10%仍然不會變質，這可能是可能由于杜仲的某種特定成分使然，也可能由于其內含物質非常豐富，結合水含量多，自由水含量少，水活度低，當水活度小于0.6時，霉菌、細菌、酵母菌、乳酸菌等無法成活。

2.1.2 粉碎度對水浸出物含量的影響

圖3顯示，葉片粉碎度與水浸出含量之間呈“W”型，Ⅲ級粉碎度時水浸出物含量最大，此級對應的是40～80目。Ⅳ級、Ⅵ級粉碎度和Ⅲ級差異不大，但是研究過程中發現粉碎度越大，過濾難度越大，操作誤差越大。另外，因為水浸出物含量越高，杜仲速溶茶產率越高，因此，最佳粉碎度為40～80目。

2.1.3 粉碎度對濁度的影響

杜仲葉中含有一定量的蛋白質、單寧酸果膠物質和多酚等成分，它們與水中的鈣、鎂、鐵等結合會形成混濁物和沉淀物，從而影響杜仲葉浸出液的濁度。杜仲葉浸出液中所含的這類物質提取時浸出量越大其濁度值越大。

由圖4可知，85℃條件下，隨著粉碎度增加濁度呈先降低、后升高的趨勢，Ⅵ級粉碎度時濁度最高；55℃條件下呈先降低、后升高、再降低的趨勢，Ⅴ級濁度最大；25℃條件下呈先降低、后升高、再保持不變的趨勢，Ⅲ級粉碎度的濁度最大。除Ⅵ級外，55℃時濁度值大于同級別的25℃和85℃。由圖4可知，就濁度而言最佳的粉碎度Ⅴ級，最佳溫度55℃。在55℃下，會導致蛋白質的變性引起酶制劑的失活，因此，生產中如果添加酶制劑，需要適當降低溫度。

圖4 粉碎度與濁度之間的關系

2.1.4 粉碎度對葉綠素含量的影響

由圖5可知，隨著葉片粉碎度的增加葉綠素a、葉綠素b及總葉綠素呈上升趨勢。Ⅵ級時葉綠素a、葉綠素b及總葉綠素最大。因為葉綠素是形成綠茶色澤的重要成分，因此其浸出量越多越好。然而它是一種很不穩定的物質，在光和熱的條件下易分解，失綠而變褐，形成脫鎂葉綠素。因此，提取過程中要考慮提取溫度。

圖5 葉片粉碎度與葉綠素含量之間的關系

研究過程中也發現，當提取溫度分別為35℃、45℃、55℃時，55℃條件下，提取液能保持色澤較好的綠色，這可能是因為在該溫度下能使茶湯變色的酶失活導致的。因為在綠茶中，茶多酚的保留量較多，其易被多酚氧化酶氧化，生成醌類化合物，導致色澤變褐。

2.1.5 粉碎度對綠原酸含量的影響

圖6顯示，隨著葉片粉碎度的增加綠原酸含量呈先上升、后降低、再上升趨勢。Ⅵ級時綠原酸含量最大。因此對于浸提綠原酸而言，Ⅵ級粉碎度是其最佳粉碎度。

圖6 葉片粉碎度與綠原酸含量之間的關系

2.2 酶制劑對綠原酸浸出量的影響

2.2.1 蛋白酶對綠原酸浸出量的影響

圖7顯示，35℃條件下，隨蛋白酶添加量增加綠原酸浸出量呈先升高、后保持不變的趨勢；45℃條件下呈逐漸上升趨勢；55℃條件下呈先升高、后降低趨勢，添加量為0.05%時浸出量最高，為37.04 mg/g。除0.05%添加量外，蛋白酶添加量相同時，酶解溫度越高，綠原酸浸出量越低，這可能是高溫破壞了浸出的綠原酸。由圖7可知，當蛋白酶的最佳使用條件是溫度45℃，添加量0.20%。

圖7 蛋白酶對綠原酸浸出量的影響

2.2.2 單寧酶對綠原酸浸出量的影響

圖8顯示，35℃、45℃、55℃條件下，與對照組相比添加單寧酶能有效提高綠原酸浸出量，但是各添加量的改變對綠原酸浸出量的影響不明顯。由圖8可知，單寧酶最佳使用條件為溫度35℃，添加量為0.05%。

圖8 單寧酶對綠原酸浸出量的影響

2.2.3 纖維素酶對綠原酸浸出量的影響

圖9顯示，35℃酶解溫度下，綠原酸浸出量隨著纖維素酶添加量增加呈逐漸升高趨勢，添加量為0.20%時浸出量為37.49 mg/g，與對照相比，處理組高于對照組。45℃酶解溫度下，綠原酸浸出量隨著纖維素酶添加量增加呈先升高、后降低趨勢，55℃酶解溫度下，處理組綠原酸浸出量隨著纖維素酶添加量增加呈逐漸降低趨勢，均低于對照。除對照組外，同等酶添加量下各處理組綠原酸浸出量隨溫度升高而降低。由圖9可知，纖維素酶最佳使用條件為溫度35℃，添加量0.20%。

圖9 纖維素酶對綠原酸浸出量的影響

2.2.4 果膠酶對綠原酸浸出量的影響

由圖10可知，35℃、45℃和55℃酶解溫度下，綠原酸浸出量隨著果膠酶添加量增加呈先升高、后降低趨勢，添加量為0.05%時浸出量最高。除0.05%外，同等果膠酶添加量下溫度越高綠原酸浸出量越低。由圖10可知，45℃時0.05%果膠酶添加量綠原酸浸出量最多，為32.16 mg/g。因此，果膠酶最佳使用條件為溫度45℃，添加量0.05%。

圖10 果膠酶對綠原酸浸出量的影響

2.2.5 復合酶制劑對綠原酸含量的影響

在單因素試驗結果基礎上，進行正交試驗。因為酶制劑間存在相互促進作用，正交試驗時酶制劑的添加量不高于單因素時的最佳添加量，試驗設計和試驗結果見表2。

表2 正交試驗結果

根據表2的極差分析結果可知，復合酶制劑對杜仲葉提取效果的因素主次排序為：A＞C＞D＞B，即蛋白酶＞纖維素酶＞單寧酶＞果膠酶，其最佳試驗方案是A2B2C3D3。試驗過程中發現，使用復合酶制劑處理時，酶解后過濾難度比單一酶制劑（除果膠酶外）略大。

按照蛋白酶0.18%、果膠酶0.03%，纖維素酶0.20%、單寧酶0.05%進行驗證試驗，杜仲葉綠原酸浸出量為41.28 mg/g，是對照組的1.69倍，說明該復合酶制劑能提高杜仲葉中綠原酸的提取率。

3 結論

（1）粉碎度對杜仲葉各成分的影響。研究發現，對水浸出物而言最佳的粉碎度為40～80目，對濁度而言55℃Ⅴ級濁度最大，Ⅵ級時葉綠素a、葉綠素b及總葉綠素最大，Ⅲ級粉碎度是黃酮的最佳粉碎度，對綠原酸而言Ⅵ級粉碎度是其最佳粉碎度。隨著粉碎度的增加，浸提時的操作難度逐漸增加，操作誤差增大，因此確定杜仲葉的最佳粉碎度為40～80目。

（2）酶制劑對綠原酸含量的影響。在單因素試驗基礎上進行正交試驗，試驗表明復合酶制劑對杜仲葉提取效果的因素主次排序為：蛋白酶＞纖維素酶＞單寧酶＞果膠酶，其最佳試驗方案是A2B2C3D3。按照蛋白酶0.18%、果膠酶0.03%，纖維素酶0.20%、單寧酶0.05%進行試驗，杜仲葉綠原酸浸出量為41.28mg/g，是對照組的1.69倍，說明該復合酶制劑能提高杜仲葉中綠原酸的提取率，并且過濾難度不大，能較好地適應企業生產。復合酶處理后的杜仲葉提取液位黃綠色，有杜仲葉特有的清香味、無青味，口感柔和且無澀味，符合人們對飲品的要求。