核桃凋落葉分解對豌豆生長及抗性生理的影響

高 洪

(涼山州林業調查規劃設計院，四川 西昌 615000)

自20世紀70年代以來，全球人口劇增，資源過度消耗，人類面臨著生態環境惡化、土地資源減少的緊迫形勢，環境和發展成為當今國際上的兩大重要論題。作為具有可持續發展特點的土地利用和經營方式，農林復合系統日益受到人們的重視[1]。果樹具有較高的經濟價值，深受農民喜愛，果農間作成為了農林復合系統的主要模式之一[2]。但是農林復合系統中植物之間普遍存在著相互影響的現象，其主要現象之一就是化感作用，其影響著復合系統的生態功能和經濟效益，近年來已成為世界各國科學家重視的一個新研究領域[3]。

核桃(Juglan regia)又名胡桃，屬胡桃科(Juglandaceae)核桃屬(Juglans)植物。核桃具有營養價值高、木材珍貴等優點，已成為廣大農民造林的首選樹種之一[4]。但是多項研究表明[5-11]，核桃的葉、果皮及根皮分泌釋放的次生代謝物質及衍生物對林下作物可能具有毒害作用。核桃分泌釋放的化感物質主要由黃酮和酚類組成[12,13]。人們對化感的研究起步雖早，但是前期的研究方法基本停留在采用浸提液進行室內發芽試驗和幼苗期生長的測定上。近年來，出現了盆栽試驗的生物測試方法[14,15]，即通過盆栽試驗，讓凋落葉在種植有作物的土壤中自然分解，觀察其在分解過程中對受體作物生長、生理的影響，從而了解其產生的效果并探討其作用機理，具有一定的實踐意義，是迄今為止更接近生產實踐的一種實驗生態學研究方法。本試驗擬采用常見作物豌豆(Pisum sativum)作為受體，通過盆栽試驗探討核桃凋落葉在自然分解過程中對豌豆生長的影響，初步了解核桃對豌豆的化感作用，分析核桃與豌豆的種間關系，以期為核桃與豌豆以及類似作物林農復合種植模式的發展與合理經營提供理論依據和技術參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供體材料

供試核桃凋落葉取自四川省涼山州西昌市郊區十年生核桃當年凋落葉。

1.1.2 受體材料

供試豌豆為適宜當地的同1株長勢優良的豌豆。

1.1.3 栽植土壤與容器

選擇當地農田砂壤土，每盆用土10kg，播種前將土壤與凋落葉碎末均勻混合，再裝入口徑30cm、高度30cm的塑料盆缽。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設計

本試驗采用盆栽的方法進行，具體方法是按設計的凋落葉量，將凋落葉碎末與土壤均勻混合裝盆，在其中播種豌豆。

采用野外隨機4m×4m樣方調查的方法，推算得到本試驗所用盆缽盆口面積的核桃林地面積上每年約凋落80g核桃凋落葉，故以80g每盆作為基本施入量。并采用0.5倍、1倍和2倍處理，即凋落葉用量分別為40g、80g和160g，對照T0不施凋落葉，各凋落葉處理和T0均設5盆重復。

播種時，將處理好的豌豆種子點播于盆中，保證每盆種子數量基本相同并且在盆中分布均勻，覆土2cm，澆透水。待豌豆發芽后進行常規的田間管理。

1.2.2 指標測定及方法

本試驗的播種時間為10月25日，播種30d后對全部豌豆進行破壞性取樣，測定每盆平均株高、主根長及其生物量，并每盆隨機取新鮮葉片1g測定其抗性生理指標。其中，超氧化物歧化酶(SOD)活性測定采用氮藍四唑法[16]；過氧化物酶(POD)活性測定參照愈創木酚法[17]；過氧化氫酶(CAT)活性測定參照紫外分光光度法[18]；丙二醛(MDA)與可溶性糖(SS)含量測定采用硫代巴比妥酸加熱顯色法[17]；脯氨酸(Pro)含量測定采用電位滴定法[17]；可溶性蛋白(SP)含量測定采用考馬斯亮藍G250法[17]。

1.2.3 數據處理分析

用Willamson和Richardson[19]提出的敏感指數RI為衡量指標對核桃凋落葉對豌豆的化感效應進行度量，即：

RI=1-C/T(當T≥C時)或RI=T/C-1(當T

式中，T為處理值；C為對照值；RI>0表示促進作用，RI<0表示抑制作用，RI的絕對值代表化感作用強度的大小。

利用SPSS 17.0(SPSS Inc.,USA)分別對數據進行One-way ANOVA分析，如果差異顯著(P<0.05)，再用LSD進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 核桃凋落葉在土壤中分解對豌豆形態指標的影響

由表1可知，各核桃凋落葉處理豌豆的株高、地上部分鮮重、地下部分鮮重均顯著低于對照(T0)，不同凋落葉處理之間形態指標的差異不明顯。

表1 不同量核桃凋落葉處理對豌豆形態指標的影響

2.2 核桃凋落葉在土壤中分解初期對豌豆3種抗性指標及MDA含量的影響

表2 不同量核桃凋落葉量處理對豌豆的抗氧化酶系統的影響

根據表2可知，凋落葉在土壤中分解降低了豌豆葉片SOD、CAT活性，各凋落葉處理SOD、CAT活性均顯著(P<0.05)低于T0，出現了T0>T1>T2>T3的現象；各凋落葉處理POD活性顯著(P<0.05)低于T0，各處理之間差異不明顯且無明顯變化趨勢。綜合化感指數來看，SOD活性化感指數為-0.135～-0.340，POD活性化感指數為-0.350～-0.452，CAT活性化感指數為-0.312～-0.430，由此可推斷SOD活性下降程度低于POD、CAT活性。受到核桃凋落葉分解的作用后，豌豆葉片MDA含量呈現上升趨勢，見表3，表明豌豆已經受到傷害。

表3 不同量核桃凋落葉量處理對豌豆的MDA含量的影響

2.3 核桃凋落葉在土壤中分解對豌豆3種滲透調節物質的影響

由表4可知，各凋落葉處理的脯氨酸(Pro)、可溶性糖(SS)2種滲透調節物質的含量均高于對照(T0)，且各凋落葉處理與T0之間差異均達到顯著水平(P<0.05)，同時出現了各處理之間差異不顯著(P>0.05)的現象。各凋落葉處理SP含量與Pro、SS表現相反，各凋落葉處理SP含量均呈現低于T0的現象，且差異顯著(P<0.05)。總體來看，各凋落葉處理呈現出Pro和SS下降，SP上升的趨勢。

表4 不同量核桃凋落葉處理對豌豆的3種滲透調節物質的影響

3 討論

早在1937年，Molish就提出了植物在生長或腐爛過程中釋放出對鄰近植物生長有干擾作用的次生代謝物為化感物質的觀點，并發現了核桃樹葉可釋放出后被命名為胡桃醌的5-羥基萘醌，其對草本和禾本科(Poaceae)植物有劇毒作用。本研究結果表明，核桃凋落葉在土壤中分解對豌豆的化感作用非常明顯。孫墨龍[20]等利用GC-MS氣質聯用儀鑒別出核桃楸樹葉中有醌類、酚類、脂類、酮類等物質，其中醌類、酚類等大多數物質均被證實對植物、微生物和昆蟲具有不同程度的作用。“腐爛釋放”是化感物質進入環境的主要途徑之一[21]，在生產過程中是常見的，同時也是可以避免的。許多化感物質被釋放到土壤后并未溶解，受到土壤中的微生物、土壤酶等物質影響后形成新的化感物質[15,22]。如，核桃葉中含有的羥基胡桃苷在土壤中會轉化為胡桃醌。由此推斷，本試驗中豌豆的形態和生理所受到的影響是核桃凋落葉自身所含的化感物質以及在土壤中衍生的化感物質共同作用的結果。

在本試驗中，核桃凋落葉的分解造成了豌豆葉片3種保護酶(SOD、POD、CAT)活性的降低，同時膜脂過氧化產物MDA含量上升。這是因為當植物受到脅迫時，其體內的O2-、H2O2等ROS(活性氧)含量將會增加，而積累的具有強氧化性的ROS首先攻擊膜系統，膜脂脂肪酸中的不飽和鍵被過氧化，即使細胞發生膜脂過氧化，損傷細胞產生MDA[23]。植物通過長期進化，建立起來一套針對ROS的防御系統。ROS作為一種有害物質的同時也作為一種脅迫信號，刺激植物體內抗逆基因的表達，使3種保護酶活性被誘導升高，其中SOD可歧化O2-成H2O2，POD和CAT則均能使H2O2分解成無毒的H2O和O2，從而阻止或降低ROS對膜的傷害。但是當脅迫強度過高時，ROS積累過于迅速，酶活性自身受到抑制甚至鈍化將導致無法有效清除ROS和保護細胞[15,24]。綜合來看，核桃凋落葉分解產生的化感物質對豌豆產生的影響已經超出了豌豆保護酶系統可以調控的范圍，豌豆已經受到比較明顯的傷害。本試驗結果與Lu Z G等對小麥[25]的研究結果一致。但并未出現Zhang F J等對水稻[26]，ZUO S P等對土豆(Solanum tuberosum)[27]，張維昊對藻類[28]的研究發現的現象。也并未出現李鋒民等[29]、金瑞等[30]研究所發現的低促高抑現象。這可能是因處理方式和時間不同所致。

當植物受到水分脅迫，滲透調節物質如脯氨酸(Pro)、可溶性糖(SS)、可溶性蛋白(SP)將被大量誘導合成。這些滲透調節物質具有維持細胞正常膨壓的功能，除此之外，Pro還可以螯合單線態氧高效清除羥自由基從而清除活性氧以及保護蛋白質、生物膜、亞細胞結構，進而保護植物細胞免受逆境脅迫傷害[31,32]。作為細胞滲透調節的主要貢獻者，SS對脅迫下的細胞結構還具有保護作用[33]。本試驗發現，各處理Pro、SS含量明顯高出T0，SP含量低于T0。這可能是因為抗氧化物酶系統代謝紊亂，導致細胞內H2O2大量積累，先激活Pro合成的谷氨酸途徑再激活鳥氨酸途徑，同時抑制Pro降解途徑，促進滲透調節物質Pro積累量增大[34]。Pro的積累誘導了SS加速合成[35]。逆境條件下，植物體內由于蛋白質等大分子化合物降解成為了SS等物質[36]，SS含量上升，水分脅迫使蛋白質的合成受到抑制[37]，蛋白酶活性的提高加快了蛋白質的水解，同時RNA轉錄和翻譯受到抑制，造成SP含量減少[39]。這與朱慧等對幾種牧草[38]、楊梅對杉木[39]、陳紹莉對茄子(solanum melongena)[40]的研究結果基本一致，與薛金輝[41]發現的Pro含量下降的研究結果不一致。這可能是因為不同物種對化感物質的響應、承受程度的不同所導致。此次試驗并未體現出明顯的濃度依賴，且各項指標隨凋落葉施入的變化趨勢，在各次測定中的差異較以往差異大[15]。這可能是因為將凋落葉粉碎后加入土壤，加速了化感物質的釋放且凋落葉釋放的化感物質大多不溶于水，從而導致各處理土壤溶液中的主要有毒物質均處于飽和狀態，差異不大。又因粉碎加速了化感物質的釋放和分解，所以3次測定各項指標隨凋落葉的施入的變化趨勢差異較其它研究大。

本研究結果表明，核桃凋落葉在土壤中分解過程中顯著抑制了豌豆株高、根長、地上部分鮮重、地下部分鮮重。這與安玉艷等[42]的研究結果基本一致。這可能是因為化感作用造成豌豆吸收和運輸水分的能力降低。為了滿足水分的需求，將生長中心向根系轉移，以便從土壤中吸收更多的水分用以維持生存。

4 結論

綜合各項研究結果表明，核桃凋落葉在土壤中分解，初期對豌豆造成的脅迫其能夠通過自身保護系統進行調節，但是當核桃凋落葉分解到中后期，化感物質對豌豆細胞膜脂造成了較嚴重的損害，可能進一步影響豌豆對水分等營養物質的吸收和運輸，生長受到抑制。所以核桃對豌豆具有明顯的化感抑制效應，從而推斷豌豆不適于與核桃進行間作。