黃芪注射液對(duì)病毒性心肌炎患者外周血NLRP3 炎性小體表達(dá)的影響?

謝紅英，羅曉麗，盧 慧

1 陸軍軍醫(yī)大學(xué)（第三軍醫(yī)大學(xué)）大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所心血管內(nèi)科，重慶400042；2 中交二航局第二工程有限公司衛(wèi)生所

病毒性心肌炎是由嗜心肌性病毒引起的心肌局限性或彌漫性炎性病變，導(dǎo)致炎性細(xì)胞向該部位聚集，過(guò)度的炎癥反應(yīng)可進(jìn)一步損傷心肌細(xì)胞，影響心功能。病毒性心肌炎患者機(jī)體炎癥水平升高，主要表現(xiàn)為腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factorα，TNF-α）和白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）等。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋 白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors family pyrin domain containing 3,NLRP3）是炎癥反應(yīng)的重要組成部分，可激活及放大下游炎癥反應(yīng)，參與眾多炎癥性疾病如器官缺血再灌注損傷、慢性病毒性肝炎、急性病毒性心肌炎等的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程［1-3］。目前病毒性心肌炎尚無(wú)特效治療方法，但相關(guān)研究［4］顯示中成藥物的輔助治療具有一定療效，特別是以黃芪注射液為代表的中成藥物可提高臨床療效，但具體機(jī)制尚不明確。因此，本研究通過(guò)探討黃芪注射液對(duì)病毒性心肌炎患者外周血NLRP3 炎性小體及相關(guān)通路的影響，為闡明該藥物的作用機(jī)制提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料將2015年8月至2018年8月于陸軍軍醫(yī)大學(xué)在坪醫(yī)院就診的病毒性心肌炎患者160 例，根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為觀察組和對(duì)照組各80例。觀察組中男43例，女37例；年齡22～65歲，中位年齡43.3 歲；病程（6.10±1.20）天。對(duì)照組中男42 例，女38 例；年齡24～66 歲，中位年齡44.2 歲；病程（5.96±1.12）天。兩組患者基線資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。該研究獲醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)并征得患者書(shū)面知情同意。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)符合病毒性心肌炎診斷與治療指南［5］。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn)1）有冠心病、感染性心內(nèi)膜炎及心臟瓣膜病者；2）存在自身免疫性疾病和免疫缺陷者；3）惡性腫瘤患者。

1.4 設(shè)備及試劑熒光定量PCR儀（美國(guó)Biorad公司）；人淋巴細(xì)胞分離液（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：Histopaque-1077）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara公司，批號(hào)：RR037A）、實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒（Takara公司，批號(hào)：DRR820A）；人血清IL-1β試劑盒（中國(guó)博士德公司，批號(hào)：EK0392）和IL-18酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒（中國(guó)博士德公司，批號(hào)：EK0864）。

1.5 治療方法對(duì)照組予常規(guī)治療：抗病毒、維生素C 片、極化液、輔酶Q10 膠囊等。觀察組在常規(guī)治療基礎(chǔ)上加用黃芪注射液（哈爾濱圣泰生物制藥，國(guó)藥準(zhǔn)字Z23020820，規(guī)格：2 mL/支）20 mL，加入250 mL 的5%葡萄糖注射液（科倫藥業(yè)股份公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H51020636，規(guī)格：250 mL/袋）靜脈滴注，每日1次，連續(xù)2周。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）分離方法 分別取兩組患者入院后12 h 和治療2 周后靜脈血3 mL，置于EDTA 抗凝管，按照1∶1 比例與人外周血淋巴細(xì)胞分離液混勻后離心，分離PBMCs，將1 mL Trizol加入PBMCs中混勻后備用。

1.6.2 炎性小體NLRP3 及Caspase-1 mRNA 水平qRT-PCR 檢測(cè) 運(yùn)用Trizol 法提取兩組PBMCs 總RNA，測(cè)定RNA 濃度，然后按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。其中qPCR 引物由上海生工公司設(shè)計(jì)合成，NLRP3 上游引物：5’-CATGAGTGCTGCTTCGACAT-3’，下游引物：5’-GCTTCAGTCCCACACAGA-3’；Caspase-1上游引物：5’-ATCGCTTTCTGCTCTTCCAC-3’，下游引物：5’-TCCTCCACATCACAGGAACA-3’；內(nèi)參GAPDH上游引物：5’-AGACAGCCGCATCTTCTTGT-3’，下游引物：5’-CTTGCCGTGGGTAGAGTCAT-3’。依據(jù)TaKaRa公司提供的熒光定量PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)建立20μL反應(yīng)體系，反應(yīng)條件：預(yù)變性，95℃120 s，95℃5 s，60℃30 s，40 個(gè)循環(huán)；溶解曲線：95℃15 s，60℃1 min，95℃30 s，60℃15 s。以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算各組相應(yīng)基因的ΔΔCT 值，以目的基因的量為定量結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.6.3 外周血細(xì)胞因子（IL-1β、IL-18）及心肌損傷標(biāo)志物（cTnI、CKMB）檢測(cè) 取兩組患者入院后12 h 和治療2 周后清晨空腹靜脈血4 mL，離心后收集上清，采用ELISA 法測(cè)定外周血IL-1β、IL-18水平。采用LX-20全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定心肌肌鈣蛋白I（cardiac troponin I,cTnI）和肌酸激酶同工酶MB（creatine kinase isoenzymes-MB,CKMB）水平。

1.6.4 療效判定及不良反應(yīng) 根據(jù)病毒性心肌炎治療效果標(biāo)準(zhǔn)分為臨床治愈、顯效、有效及無(wú)效［5］。記錄患者治療期間不良反應(yīng)發(fā)生情況，包括惡心嘔吐、頭痛、腹部不適等。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 19.0 分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以±s表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床療效觀察組臨床治愈、顯效、有效、無(wú)效及總有效分別為40 例（50.0%）、16 例（20.0%）、17例（21.3%）、7例（8.7%）及73例（91.3%），對(duì)照組分別為32例（40.0%）、12例（15.0%）、20例（25.0%）、16 例（20.0%）及64 例（80.0%），總有效率觀察組高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 外周血NLRP3 mRNA、Caspase-1 mRNA及IL-1β和IL-18水平治療后兩組患者外周血NLRP3 mRNA、Caspase-1 mRNA 及IL-1β和IL-18 水平均較治療前降低，觀察組降低更明顯（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 兩組患者治療前后外周血NLRP3、Caspase-1 mRNA及IL-1β和IL-18水平比較（±s）

表1 兩組患者治療前后外周血NLRP3、Caspase-1 mRNA及IL-1β和IL-18水平比較（±s）

注：*表示與治療前比較，P＜0.05；#表示與對(duì)照組治療后比較，P＜0.05

組別對(duì)照組觀察組例數(shù)80 80時(shí)間治療前治療后治療前治療后NLRP3 mRNA 0.99±0.07 0.78±0.10*0.98±0.06 0.59±0.11*#Caspase-1 mRNA 1.02±0.10 0.75±0.12*1.03±0.09 0.60±0.08*#IL-1β（pg/mL）38.10±6.20 28.20±5.16*39.60±4.50 23.26±4.80*#IL-18（pg/mL）39.50±5.10 27.90±5.40*40.80±6.05 22.51±4.60*#

2.3 心肌損傷標(biāo)志物水平治療后兩組患者血清CKMB、cTnI 水平均較治療前降低，觀察組降低更明顯（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 兩組患者治療前后心肌損傷標(biāo)志物水平比較（±s）

表2 兩組患者治療前后心肌損傷標(biāo)志物水平比較（±s）

注：*表示與治療前比較，P＜0.05；#表示與對(duì)照組治療后比較，P＜0.05

組別對(duì)照組觀察組例數(shù)80 80時(shí)間治療前治療后治療前治療后CKMB（U/L）26.60±3.58 19.40±4.10*27.50±4.51 14.20±3.62*#cTnI（μg/L）0.72±0.08 0.45±0.05*0.75±0.07 0.36±0.06*#

2.4 不良反應(yīng)發(fā)生情況治療期間對(duì)照組出現(xiàn)惡心嘔吐1 例、頭痛1 例、腹部不適1 例，觀察組出現(xiàn)惡心嘔吐2 例、頭痛1 例、腹部不適1 例，兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

病毒性心肌炎發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其可能與病毒或其毒素直接損傷心肌細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或壞死，同時(shí)心肌細(xì)胞釋放大量自身抗原。機(jī)體通過(guò)固有免疫，激活Toll樣受體2，進(jìn)而促進(jìn)外周血單核細(xì)胞分泌IL-12、IL-1β、TNF-α，聚集于受損的心肌局部，在局部形成炎癥反應(yīng)，發(fā)揮免疫應(yīng)答作用［6］。由免疫炎性體介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)已參與了多種炎癥性疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。NLRP3 是由胞漿內(nèi)多種蛋白質(zhì)組成的復(fù)合體，其含有凋亡相關(guān)微粒蛋白、Caspase-1 等，是天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分［7］。機(jī)體NLRP3活性通常處于抑制狀態(tài)，當(dāng)NLRP3 受外在刺激被激活時(shí)，活化的Caspase-1隨后激活I(lǐng)L-1β和IL-18，產(chǎn)生炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)。相關(guān)研究［8］顯示，NLRP3炎性小體參與了病毒性心肌炎的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，抑制NLRP3 炎性小體激活，可抑制下游炎性通路的級(jí)聯(lián)放大，改善病毒性心肌炎大鼠心功能。

目前，病毒性心肌炎的治療尚無(wú)特效方法，臨床常對(duì)癥支持治療。相關(guān)研究［9］顯示，中醫(yī)輔助治療該病有較好的臨床效果。中醫(yī)認(rèn)為病毒性心肌炎發(fā)病源于氣陰兩虛，治療強(qiáng)調(diào)益氣養(yǎng)陰活血化瘀。有研究顯示黃芪注射液可提高病毒性心肌炎患者臨床療效［10］，但相關(guān)機(jī)制尚未闡明。黃芪注射液富含黃芪皂苷，具有益氣固表、養(yǎng)心通脈等作用，可清除自由基，降低炎癥反應(yīng)，改善心肌缺血缺氧狀態(tài)［11-12］。作為炎癥反應(yīng)的重要組成部分，NLRP3 炎性小體可啟動(dòng)炎性通路的激活及級(jí)聯(lián)放大。NLRP3 炎性小體的激活參與了眾多炎癥性疾病發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，通過(guò)抑制NLRP3 炎性小體的激活，可提高疾病治療效果及預(yù)后［13］。本研究結(jié)果顯示，黃芪注射液可降低外周血NLRP3 炎性小體水平，抑制下游炎性通路的級(jí)聯(lián)放大，抑制炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步減輕心肌損傷，降低患者心肌損傷標(biāo)志物CKMB 和cTnI 水平，提高臨床療效，同時(shí)不增加不良反應(yīng)發(fā)生率。

綜上所述，NLRP3 炎性小體參與了病毒性心肌炎的炎癥反應(yīng)，黃芪注射液可抑制NLRP3 炎性小體激活，降低炎癥反應(yīng)，提高臨床療效。但本研究存在一定局限性，如入選病例相對(duì)較少，下一步需加大樣本量，采取多中心聯(lián)合的方式探討黃芪注射液對(duì)病毒性心肌炎外周血NLRP3 炎性小體表達(dá)的影響。