鴉膽子苦醇對人非小細胞肺癌H1299 細胞輻射增敏作用研究?

張 芳，楊蓉佳，付朝霞

1 華池縣人民醫院，甘肅 華池745600；2 甘肅省人民醫院

從天然產物中篩選輻射增敏藥物成為癌癥放射治療研究的熱點［1］。近年來，一種源于苦木科植物鴉膽子種子的活性提取物——鴉膽子苦醇（brusatol，BRU）逐漸進入了研究人員的視野，因為BRU 能夠抑制核轉錄因子2（nuclear transcription 2，Nrf2）的表達，產生抗腫瘤和抗氧化應激等作用［2］。腫瘤細胞通過Nrf2途徑產生輻射耐受性是目前癌癥放療的棘手問題，而BRU 對Nrf2 具有抑制作用，無疑為癌癥的放療以及輻射聯合藥物治療研究提供了新契機，國內學者首次證實BRU可通過抑制Nrf2 而增加腫瘤細胞的輻射敏感性，是一種潛在天然增敏藥物［3］。然而BRU 聯合輻射通過何種途徑抑制Nrf2 表達，進而誘導腫瘤細胞凋亡至今尚未闡明。本研究探討BRU抑制Nrf2以及增加非小細胞肺癌H1299細胞輻射敏感性的可能途徑，揭示BRU聯合輻射誘導H1299細胞凋亡的內在機制。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器二甲基亞砜（dimethyl

sulfoxide，DMSO，批號：08371）、BRU 和4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，批號：C0065，美國Sigma 公司提供）；細胞增殖檢測試劑盒（Cell Counting Kit-8，CCK-8，批號：C0038）、細胞凋亡檢測試劑盒（Annexin V-FITC/PI，批號：C1062S）和胞內活性氧檢測試劑盒（Reactive Oxygen Species Assay Kit，批號：S0033S，碧云天公司提供）；PI3K（Tyr458，批號：4292）、PI3K（Tyr458，批號：17366）、Akt（Ser473，批號：9272）、Akt（Ser473，批號：4060）、p70S6K（Thr389，批號：9202）、p70S6K（Thr389，批號：97596）由美國Cell signal 公司提供；其他抗體（美國Abcam 公司）；DMEM培養基和胎牛血清（美國Gibco公司），其他試劑均由國內公司提供。流式細胞儀（德國默克密理博公司）；凝膠成像系統（美國Protein sample 公司）；酶標儀（上海閃譜生物科技有限公司）；電泳儀、電泳槽（美國Biorad公司）；激光共聚焦顯微鏡（德國Zessi公司）。

1.2 細胞人非小細胞肺癌H1299 細胞在含10%胎牛血清DMEM 培養液中，在37℃、含5%CO2培養箱中培養，細胞生長密度達到80%時傳代，取對數期細胞開展實驗。

1.3 實驗方法

1.3.1 CCK-8 法檢測細胞活性 調整H1299 細胞密度為1.5×104個/孔，接種于96孔板。培養24 h后，加入經培養液稀釋的不同濃度BRU，繼續培養2、6、12、24、48 h，收樣。設定酶標儀吸光值為450 nm，測定各孔吸光值（A），根據細胞增殖抑制實驗得出BRU的IC50，根據公式計算抑制率。

抑制率（%）=［A450（陰性）-A450（給藥）］/［A450（陰性）-A450（空白）］×100%

1.3.2 BRU 抑制Nrf2 表達的最佳作用時間 用IC50的BRU 處理H1299 細胞2、4、6、12、24、48 h 后，收集細胞，提取全蛋白，定量、變性后用12% SDSPAGE 凝膠電泳分離蛋白質，經轉膜、封閉、一抗4℃過夜和二抗孵育，用化學發光法顯色，用凝膠成像系統拍照記錄，分析灰度值。

1.3.3 輻射增敏實驗 將細胞分為對照組、BRU組（IC50）、X 射線組（2 Gy）和BRU 聯合X 射線組（BRU+2 Gy）。其中BRU組和BRU+2 Gy組用100 nmol/L（IC50）的BRU 預處理24 h。調整H1299 細胞密度為5×104個/mL，接種于6孔板，細胞經100 nmol/L的BRU 預處理24 h，采用醫用直線加速器提供的X 射線一次性照射細胞，劑量均為1 Gy/min，室溫條件下照射劑量為2 Gy，照射24 h后收細胞樣。

1.3.4 胞內活性氧實驗 調整細胞密度為1×105個/mL，將細胞重懸浮于含有10μmol/LDCFH-DA的無血清培養基中，37°C孵育20 min，再用無血清培養基洗3 次，經流式細胞儀檢測細胞熒光強度，平均熒光強度值（mean fluorescence intensity，MFI）代表ROS含量。

1.3.5 細胞凋亡實驗 調整細胞密度為1×105個/mL，將細胞重懸浮于預冷的結合緩沖液，加入5 μL Annexin V-FITC 和5 μL PI 輕輕混勻后室溫避光孵育15 min，經流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.3.6 平板克隆形成實驗 以每孔200 個細胞密度接種于6 孔板，同時設無藥對照組，每組3 個重復，在37°C、5%CO2條件下持續培養14 天。經洗滌、甲醇固定、吉姆薩（Giemsa）染色后，晾干、拍照，計算肉眼可見的集落數。

克隆形成率（%）=（克隆集落數/接種細胞數）×100%

1.3.7 蛋白表達分析 細胞經處理后用蛋白裂解液提取總蛋白，用BCA 蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度后，用10%和12%SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，并經轉膜、封閉、孵一抗和二抗后，用化學發光法檢測蛋白條帶，最后用Protein sample 凝膠成像儀拍照并計算蛋白灰度值。

1.3.8 Nrf2 蛋白免疫熒光定位 將每組經細胞爬片處理的蓋玻片用PBS 清洗3 次，用0.2%的Triton X-100 透化細胞10 min，PBS 清洗3 次，每次5 min，用5%的BSA 封閉細胞30 min，經一抗4℃過夜和熒光二抗孵育。用終濃度為0.5μg/mL 的DAPI染色10 min，PBS清洗3 次，將蓋玻片置于載玻片，用抗淬滅封片劑封片，用激光共聚焦顯微鏡觀察拍照。

1.4 統計學方法用SPSS 19.0軟件分析數據，計量資料以±s表示，采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 BRU對H1299細胞和Nrf2表達的抑制作用從6 h開始細胞生長呈時間和劑量依賴性被抑制，在12、24 和48 h 的IC50值 分 別 是350.2、102.4 和100.9 nmol/L，表明100 nmol/L左右的BRU可以顯著抑制H1299 細胞增殖，因此選用該濃度作為研究濃度。100 nmol/L的BRU作用H1299細胞6、12、24和48 h后，Nrf2表達不具有時間依賴性，BRU處理后24 h，Nrf2 的表達最低，因此，選取24 h 作為以下研究的時間點。見圖1。

圖1 BRU對H1299細胞和Nrf2表達的抑制作用

2.2 各組H1299 細胞克隆存活能力與對照組相比，BRU 組（P＜0.05）、2 Gy 組（P＜0.01）和BRU+2 Gy組（P＜0.001）H1299細胞的克隆形成率降低；與2 Gy 組相比，BRU+2 Gy 組細胞形成率差異具有統計學意義（P＜0.01）。見圖2。

圖2 各組H1299細胞克隆存活能力

2.3 各組H1299 細胞凋亡情況與對照組相比，BRU 組（P＜0.01）、2 Gy 組（P＜0.001）和BRU+2 Gy組（P＜0.001）細胞凋亡率升高；2 Gy 與BRU+2 Gy組細胞凋亡率比較差異有統計學意義（P＜0.001）。見圖3。凋亡率（%）=（R4+R5）/R1×100%，R1=1000。

2.4 各組H1299細胞胞內ROS情況與對照組相比，BRU 組（P＜0.05）、2 Gy 組（P＜0.05）和BRU+2 Gy 組（P＜0.01）MFI 升高；2 Gy 組與BRU+2 Gy 組MFI比較差異有統計學意義（P＜0.01）。見圖3。

圖3 各組H1299細胞胞內ROS含量及H1299細胞凋亡率

2.5 BRU 聯合X 射線抑制H1299 細胞PI3K/Akt/Nrf2/HO-1信號通路與對照組相比，BRU組（p-PI3K，P＜0.05；p-Akt，P＜0.01；p-p70S6K，P＜0.05）、2 Gy組（P＜0.01）和BRU+2 Gy 組（P＜0.001）的磷酸化PI3K、Akt 和p70S6K 水平降低（圖4B）；BRU 組Nrf2（P＜0.001）、HO-1（P＜0.001）和NQO-1 表達降低（圖4D）；BRU+2 Gy組Nrf2（P＜0.001）、HO-1（P＜0.01）和NQO-1（P＜0.01）表達降低（圖4D）；2 Gy組Nrf2、HO-1 和NQO-1 表達升高（圖4D），說明2 Gy 劑量的X 射線照射會使H1299 細胞Nrf2 表達升高，產生抗氧化應激作用；BRU 組和BRU+2 Gy 組細胞核中Nrf2 的核位移程度減弱（圖5），2 Gy 組細胞核中Nrf2的核位移程度增強（圖5）；2 Gy組與BRU+2 Gy組磷酸化PI3K（P＜0.05）和Akt（P＜0.05）水平比較差異具有統計學意義（圖4B），Nrf2（P＜0.001）、Keap1（P＜0.05）、HO-1（P＜0.01）和NQO-1（P＜0.01）的表達降低。

圖4 各組H1299細胞PI3K/Akt/Nrf2/HO-1信號通路相關蛋白表達情況

圖5 各組H1299細胞線粒體凋亡情況

2.6 各組H1299 細胞線粒體凋亡情況與對照組相比，BRU組（P＜0.05）、2 Gy組（P＜0.05）和BRU+2 Gy 組Apaf-1（BRU 組P＜0.01；2 Gy 組P＜0.01；BRU+2 Gy組P＜0.001）、bax/bcl-2（BRU組P＜0.01；2 Gy組P＜0.01；BRU+2 Gy組P＜0.01）、cytochrome C（BRU 組P＜0.05；2 Gy 組P＜0.01；BRU+2 Gy 組P＜0.001）和cleaved-caspase 3的表達升高（BRU組P＜0.05；2 Gy組P＜0.05；BRU+2 Gy組P＜0.001）（圖6B）；2 Gy 組與BRU+2 Gy 組Apaf-1（P＜0.05）、bax/bcl-2（P＜0.05）和cleaved-caspase 3（P＜0.001）比較差異有統計學意義。見圖6。

圖6 各組線粒體凋亡通路蛋白表達情況

3 討論

從中醫藥提取的天然產物在抑制腫瘤方面具有獨特優勢，因此，從天然產物對腫瘤細胞的作用機制入手，探討天然產物聯合放療對腫瘤組織的作用方式和途徑，對促進中醫藥發展具有重要意義［4］。有研究［5］表明，BRU能夠通過抑制Nrf2表達有效抑制多種腫瘤細胞增殖，誘導腫瘤細胞凋亡，是具開發價值的天然抗腫瘤藥物之一。有研究［6］發現，輻射可以抑制PI3K/Akt/Nrf2 信號通路，誘導腫瘤細胞ROS 含量升高，誘導腫瘤細胞凋亡，這對理清BRU通過抑制Nrf2增加腫瘤細胞輻射敏感性研究提供了思路。本研究以p53 缺失具有輻射耐受性的人非小細胞肺癌H1299 細胞為研究對象，從PI3K/Akt/Nrf2信號通路出發探討BRU的輻射增敏作用，揭示其內在分子機制。

本研究結果表明，BRU 對H1299 細胞生長和Nrf2 蛋白表達具有抑制作用。BRU 對H1299 細胞生長的抑制作用具有時間和劑量依賴性，經IC50處理的H1299 細胞，Nrf2 表達呈時間依賴性。表明BRU可通過抑制Nrf2表達從而抑制細胞增殖，y該結果與文獻報道一致［7-8］。BRU 或X 射線都能抑制H1299 細胞增殖、促進凋亡，研究結果與文獻報告一致［3］。而BRU聯合X射線能夠更好抑制H1299細胞增殖、促進凋亡，提示BRU 可增強H1299 細胞輻射敏感性，進而提高放療療效。

Nrf2 是一個轉錄因子，在控制氧化反應中發揮關鍵作用，對抑制炎癥反應和細胞蛋白酶以及維持線粒體功能具有重要作用［9］。正常狀況下，只有小部分Nrf2 進入細胞核啟動轉錄，大部分Nrf2 與Keap1 結合形成復合物，便于被泛素蛋白酶體降解［10-11］。Nrf2被認為是重要的細胞保護因子之一，腫瘤細胞Nrf2 的異常激活，與癌癥的藥物治療和輻射耐受性有關，目前研究人員還未就Nrf2 的調控機制達成一致［12］。有研究［13］發現，PI3K/Akt 信號通路是腫瘤細胞重要的存活通路，該通路的激活能夠增加腫瘤細胞蛋白合成，參與調節細胞增殖、遷移、凋亡等過程，PI3K/Akt 信號通路已被證實與多種癌癥的發生、轉移、惡化等過程相關。相關研究［14］證實Nrf2是Akt的靶蛋白之一，Akt 或其上游PI3K 被抑制均可抑制Nrf2 活性，這為揭示BRU 輻射增敏作用的內在分子機制提供了契機。

本研究結果表明，BRU 能抑制PI3K 和Akt 磷酸化水平，降低Nrf2 及其下游蛋白表達，在2 Gy組和BRU+2 Gy 組都能觀察到相似結果，表明BRU可通過抑制PI3K/Akt信號通路抑制Nrf2活性，增加H1299 細胞的輻射敏感性。Nrf2 表達降低使H1299細胞抗氧化能力減弱，一方面使ROS含量升高，誘發DNA 損傷應答，激活ROS 下游凋亡信號通路，誘導細胞凋亡［15］，本研究中BRU 組、BRU+2 Gy組和BRU+2 Gy 組高ROS 含量和細胞凋亡率能夠證明這一過程；另一方面，Nrf2 活表達降低能夠減少其靶蛋白Bcl-2表達，導致Bax/Bcl-2比例失衡，激活Apaf-1，釋放細胞色素c，活化Caspase-3，激活線粒體凋亡通路［16］，導致H1299 細胞凋亡，本研究中線粒體凋亡途徑的Western blotting 結果能夠證明這一過程。

綜上所述，BRU 通過抑制PI3K/Akt/Nrf2 信號通路增強H1299細胞的輻射敏感性，該結果為BRU的輻射增敏作用機制研究提供了依據。