聚焦網絡藥理學：黃芩苷治療急性牙周炎的效應機制研究?

顧 磊，廖 維，周建萍

1 重慶市消防救援總隊醫院口腔科，重慶401122；2 陸軍醫科大學附屬第二醫院新橋醫院麻醉科；3 重慶醫科大學附屬口腔醫院正畸科

急性牙周炎是以牙周支持組織炎癥為主的一種常見疾病，主要表現為患者牙組織周圍出現不同程度的疼痛及腫脹，臨床多采用中西醫結合的治療方法［1］。急性牙周炎屬中醫學“牙痛”范疇，多由熱盛所致而以清熱立法［2］，黃芩為最重要的清熱藥之一，是急性牙周炎臨床處方中的常用藥，如楊靖靖等［3］自擬三黃健齒湯，張文娟等［4］自擬牙周敗毒飲等均重用黃芩，并且取得了顯著療效，此外如黃連解毒湯、普濟消毒飲等治療急性牙周炎的常用古方也多用黃芩以清熱，黃芩苷既是黃芩的主要成分之一，也是使用黃芩的一些處方中發揮療效的主要活性物質之一，如徐田等［5］認為黃芩苷是黃連解毒湯中最重要的化合物成分。然而，中藥及其化合物具有多靶點、多通路藥效特點，現階段與黃芩苷效應機制相關的動物研究、細胞研究等仍缺乏系統研究，導致與黃芩苷藥效多靶點作用機制的認識存在一定的差距［6-9］，因此采用網絡藥理學方法從整體、系統的角度闡述藥物、靶點和疾病之間的關系［10-11］，直觀呈現藥物靶點網絡［12］，有助于理解藥物的多藥理學及其對生物網絡的影響，以提高臨床療效［13］。本研究利用藥物靶點預測、蛋白質-蛋白質相互作用（proteinprotein interaction，PPI）網絡構建、拓撲篩選等網絡藥理學方法，揭示黃芩苷治療急性牙周炎的作用機制，明確其藥用價值，為黃芩苷治療急性牙周炎藥效機制的定位和產生協同作用的潛在蛋白靶點的確定提供研究方法。

1 材料與方法

1.1 黃芩苷化合物信息收集黃芩苷化合物信息來自NCBI pubchem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）和ZINC數據庫（http：//zinc.docking.org/）［14-15］。黃芩苷吸收、分布、代謝和排泄（ADME）篩選標準包括生物利用度（ob）、藥物相似性（dl）、血腦屏障（bbb）等，數據來自中藥系統藥理學（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/）數據庫［16］。

1.2 黃芩苷化合物靶點預測采用兩種方法預測黃芩苷的靶點信息。在NCBI 數據庫（PubMed Central，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/）通過檢索“黃芩苷”文獻，獲得已知的黃芩苷靶點；在Pharmmapper數據庫（http：//lilab.ecust.edu.cn/Pharmmapper/）通過反向藥效團映射方法識別小分子潛在靶點［17］。

1.3 急性牙周炎疾病相關靶點收集及PPI 網絡建立通過DiseaseGene Network（http：//www.disgenet.org/）收集各種疾病的相關基因，在“DiseaseGene Network”設置窗口中將“Select Source”設置為“All”，將“Select Association Type”設置為“Any”，將“Select Disease Class”設置為“Acute periodontitis”，查詢急性牙周炎疾病相關靶點信息［18］。基于DiseaseGene Network 數據庫查找急性牙周炎疾病相關靶點，并在STRING 數據庫（https：//string-db.org/）建立PPI網絡［19］。

1.4 基因映射收集黃芩苷治療急性牙周炎的相關靶點應用Cytoscape 軟件將黃芩苷的靶點映射在急性牙周炎疾病相關靶點的PPI 背景網絡上，提取黃芩苷治療急性牙周炎的預測靶點。

1.5 拓撲分析提取黃芩苷治療急性牙周炎的核心靶點在Cytoscape 軟件對獲取的黃芩苷治療急性牙周炎的相關靶點計算3個拓撲性質“Degree”“ClosenessCentrality”和“Betweenness Centrality，選取3 個指標均大于中位數的靶點［20］，篩選出具有拓撲重要性的“Hub”節點，定義為黃芩苷治療急性牙周炎的核心靶點。

1.6 黃芩苷治療急性牙周炎預測靶點的PPI 網絡建立及富集分析基于收集獲得的黃芩苷治療急性牙周炎的預測靶點，在STRING 數據建立PPI網絡［18］，選擇具有高置信度的PPI 進行進一步研究（low confidence：score＜0.4；medium：0.4-0.7；high：＞0.7）。

在DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/）［21］數據庫進行富集分析，包括生物過程（biological process，BP）、細胞成分（cellular constituent，CC）、分子功能（molecular function，MF）及作用通路。選取P＜0.05的分析結果，定義為黃芩苷治療急性牙周炎的相關作用通路及BP、CC、MF；選取P＜0.01，FDR＜1 的分析結果，定義為黃芩苷治療急性牙周炎的核心作用通路及BP、CC、MF。

基于收集獲得的黃芩苷治療急性牙周炎的預測靶點，在KEGG 數據庫［22］搜索并建立核心通路的路線圖，標注通路內的預測作用靶點。

1.7 黃芩苷治療急性牙周炎“靶點-通路”網絡建立基于收集獲得的黃芩苷治療急性牙周炎的預測靶點及DAVID 數據庫進行通路富集分析的黃芩苷治療急性牙周炎的核心通路，在Cytoscape軟件建立黃芩苷治療急性牙周炎的“靶點-通路”網絡。

2 結果

2.1 黃芩苷化合物信息及預測靶點在TCMSP中獲得了黃芩苷化合物信息（PubChem CID：64982），包括MW=446.39，OB（%）=40.12，DL=0.75，BBB=-1.74，黃芩苷2D結構式，Canonical SMILES結構式為C1=CC=C（C=C1）C2=CC（=O）C3=C（C（=C（C=C3O2）OC4C（C（C（C（O4）C（=O）O）O）O）O）O）O。研究采用兩種方法預測并獲得了黃芩苷332 個潛在人類蛋白質靶點，這些靶點來自7302個藥效團模型。見圖1。

圖1 黃芩苷化合物2D結構

2.2 急性牙周炎疾病相關靶點及PPI 網絡的建立在DiseaseGene Network 數據庫共收集獲得了急性牙周炎的44 個預測靶點。在STRING 數據庫建立急性牙周炎的PPI 網絡，獲得了一個44 個節點、343條邊的PPI網絡，見圖2。

圖2 急性牙周炎44個靶點的PPI網絡

2.3 基因映射結果與拓撲分析結果

2.3.1 基因映射 在Cytoscape 軟件中，將黃芩苷353 個預測靶點映射在以急性牙周炎PPI 網絡為背景的網絡上，獲得了黃芩苷治療急性牙周炎的13個預測靶點，見圖3。

圖3 基因映射提取黃芩苷治療急性牙周炎的預測靶點

2.3.2 拓撲分析 黃芩苷治療急性牙周炎的13個預測靶點“Degree”中位數為10，“Closeness Centrality”中位數為0.85714286，“Betweenness Centrality”中位數為0.01515152，其中“Degree”“Closeness Centrality”和“Betweenness Centrality 均大于中位數的具有重要拓撲意義的節點共6 個，即“Hub”節點，為黃芩苷治療急性牙周炎的核心靶點，見表1。

表1 黃芩苷治療急性牙周炎的“Hub”節點

2.4 黃芩苷治療急性牙周炎預測靶點的PPI 網絡建立、富集分析及“靶點-通路”網絡建立基于收集獲得的13 個黃芩苷治療急性牙周炎的預測靶點，建立PPI 網絡，獲得了一個13 個節點、58 條邊的PPI 網絡，選擇高置信度PPI 獲得了一個13 個節點、38條邊的PPI網絡，見圖4。

圖4 黃芩苷治療急性牙周炎的預測靶點高置信度PPI網絡

對收集獲得的黃芩苷治療急性牙周炎的13個靶點進行富集分析，P＜0.05 的富集分析結果包括34 個BP，4 個CC，5 個MF，5 個相關作用通路。其中P＜0.01，FDR＜1 的富集分析結果包括21 個BP，3個CC，2個MF及4個核心作用通路。見圖5。

圖5 黃芩苷治療急性牙周炎“靶點-通路”網絡圖

基于富集分析結果，建立了黃芩苷治療急性牙周炎的“靶點-通路”網絡圖。基于KEGG 建立的4個核心作用通路的可視化通路網絡圖建立黃芩苷治療急性牙周炎的可視化通路網絡圖。見圖6。

圖6 黃芩苷治療急性牙周炎的可視化通路網絡圖

3 討論

急性牙周炎是一種破壞性的牙周炎性疾病，其炎癥反應包括水腫形成、白細胞浸潤和炎癥介質釋放，發病機制網絡復雜，但以炎癥反應為核心，炎癥可從牙齦組織延伸到鄰近的骨和牙周膜，造成牙周組織不可逆性破壞［23-24］，臨床研究認為COX-2 抑制劑、非甾體抗炎藥等具有較好的臨床療效［24］，但是存在副作用大的缺陷［25］。傳統中草藥在急性牙周炎治療中具有療效優勢，且副作用低，然而天然中草藥物多靶點、多途徑的藥效、方效特點阻礙了對其作用機制的深入研究，網絡藥理學提供了一種在系統水平方面闡釋黃芩苷生物學機制的研究方法。

首先根據Lipinski 規則［26］和ADME 參數［27-28］驗證黃芩苷良好的成藥性。在NCBI、TCMSP、Pharmmapper、DiseaseGene Network 數據庫分別獲得了黃芩苷的332 個靶點及急性牙周炎的44 個靶點。進一步通過建立PPI 網絡及基因映射、拓撲分析，獲得了黃芩苷治療急性牙周炎的13 個預測靶點及6 個具有拓撲重要性的靶點。富集分析結果表明黃芩苷治療急性牙周炎主要圍繞4 條核心作用通路，涉及21個BP，3個CC，2個MF。

已有研究表明，黃芩苷具有抗凋亡［29］、抗氧化［30］和抗炎作用［31］，黃芩苷治療急性牙周炎的效應機制主要以炎癥、凋亡、氧化應激為主。“Hub”節點IL-6、IL-1β、TNF、TLR4［32-34］作為4 條核心通路TNF signaling pathway、Toll-like receptor signaling pathway、NOD-like receptor signaling pathway、NF-kappa B signaling pathway的上游啟動靶點，介導與MAPK signaling pathway、PI3K-Akt signaling pathway、JAK-STST signaling pathway 等多條通路間的復雜交互作用，如LIN等［35］研究表明NOD-like receptor signaling pathway 與MAPK signaling pathway 的交互作用在PKC 的激活［36］、誘導型一氧化氮合成［37］、炎癥升高［38］中均具有重要作用。而“Hub”節點IL-6、IL-1β、TNF、Ptgs2、Mmp9 又構成了這些信號通路復雜交互作用形成的下游組分，其中IL-6、IL-1β、TNF是調控介導炎癥反應的炎癥因子釋放的重要靶點［39］，如ZHENG等［40］認為下調IL-6、IL-1β、TNF 的表達可抑制牙周炎；Ptgs2 在炎性介質形成過程中具有重要啟動作用［41］，如ZHANG 等［42］研究發現Ptgs2 啟動子內DNA 甲基化水平與COX-2 的表達相關性在牙周炎疾病啟動、介導中具有重要作用；Mmp9 則 具 有 重 塑 細 胞 外 基 質 的 作 用［43-44］，如BARREIROS 等［45］認為Mmp2 和Mmp9 可通過TLR2 和MyD88 參與牙周炎疾病進展。本研究結果表明，黃芩苷主要靶向作用于多條炎癥、凋亡等相關的信號通路上游啟動信號IL-6、IL-1β、TNF、TLR4，及下游功能信號IL-6、IL-1β、TNF、Ptgs2、Mmp9，通過4條核心通路TNF signaling pathway、Toll-like receptor signaling pathway、NOD-like receptor signaling pathway、NF-kappa B signaling pathway及MAPK signaling pathway 等多條相關通路間的復雜交互作用，實現治療急性牙周炎的抗炎、抗凋亡和抗氧化應激等作用。