褐藻膠裂解酶研究進展

吳陽，霍崢，李剛，溫少紅

煙臺大學生命科學學院（煙臺 264000）

褐藻膠存在于褐藻細胞壁及細胞間質中，約占其干重的40%。褐藻膠是酸性陰離子線性多糖，由β-D-甘露糖醛酸（β-D-mannuronate；M）和與其C-5差向異構體α-L-古羅糖醛酸（α-L-guluronate；G）通過1,4糖苷鍵共價連接，以均聚或隨機的方式排列成同源多糖醛酸M殘基（Poly M）、G殘基（Poly G）以及雜多糖醛酸（Poly MG或Poly GM）[1]。除褐藻外，褐藻膠也由兩個細菌屬——固氮菌（例如葡萄固氮菌Azotobactersp.）和幾種假單胞菌產生（例如銅綠假單胞菌Pseudomonosasp.）。

褐藻寡糖（AOS）由褐藻膠降解產生，除保留褐藻膠的優良特性外還具有特殊的化學特性及生物活性，具有更廣泛的應用價值。在食品方面作為食品添加劑，農業方面作為植物生長促進劑和治療劑，醫藥方面具有抗氧化和抗腫瘤等特性，在能源方面將褐藻膠降解為寡糖是將其直接轉化為乙醇的關鍵步驟[2-5]。

褐藻膠的降解方法有物理法、化學法和酶解法。酶解法具有底物專一、反應條件溫和等優點，還可以定向制備褐藻寡糖，相較于物理、化學法是一種理想且環保的方法。但是褐藻膠裂解酶的應用目前仍處于研究階段，無法投入工業大規模生產。

1 褐藻膠裂解酶的來源

迄今為止，許多褐藻膠裂解酶已被鑒定、基因克隆和純化，其來源多種多樣，例如從海帶、馬尾藻、土壤中分離得到的海洋和陸地細菌、真菌、噬菌體和病毒（小球藻病毒）等，以褐藻為食的海洋軟體動物（鮑魚Haliotis spp.、海兔Aplysia kurodai、短濱螺Littorina brevicula等）的腸道中也存在著褐藻膠裂解酶。特別地，Stender等[6]從人腸道細菌—溶胞擬桿菌中分離得到褐藻膠裂解酶BeclPL6。

目前對細菌產的褐藻膠裂解酶的研究較為廣泛和深入，已鑒定出50000多個褐藻膠裂解酶氨基酸序列，其中47000個屬于細菌基因組，包括弧菌屬Vibriosp.[7-8]、吞噬性去氟弧菌Defluviitalea phaphyphila[9]、鞘氨醇單胞菌屬Sphingomonassp.[10]、銅綠假單胞菌屬Pseudomonas aeruginosa[11]、卡拉膠假單胞菌屬Pseudoalteromonas carrageenovora[12]、芽孢桿菌屬Paenibacillus[13]、溶胞擬桿菌Bacteroides cellulosilyticus[6]、微鱗球菌Microbulbifersp.[14-16]、志賀氏菌Shewanellasp.[17]、嗜鹽白蟻菌Zsoptericola halotoleransWX[18]等。

2 褐藻膠裂解酶的作用方式

褐藻膠裂解酶通過β-消除的酸堿催化作用，以1,4O-糖苷鍵為目標，將褐藻膠降解為帶有不飽和雙鍵的寡糖，并在非還原末端形成不飽和殘基，用符號Δ表示[19]。褐藻膠裂解酶的β-消除作用如圖1所示。

圖1 褐藻膠裂解酶的β-消除

Gacesa[20]提出了一種褐藻膠裂解酶的新的催化假說，描述了β-消除反應的三個步驟：（1）去除羧酸鹽陰離子上的負電荷，通過鹽橋（組氨酸和賴氨酸）中和電荷，降低H-5質子的pKa；（2）一般堿催化提取C-5上的質子，其中可能需要一個殘基作為質子提取者，另一個作為質子供體或殘基同時充當質子供體和受體，得到稀酸鹽中間體；（3）羧基的電子轉移導致C-4和C-5之間形成雙鍵，并最終裂解O-糖苷鍵。

3 褐藻膠裂解酶的分類

3.1 根據分子量大小

根據分子質量，將褐藻膠裂解酶分為三類：第一類分子質量在20～35 kDa之間[13-14]；第二類分子質量約為40 kDa[21-22]；第三類分子質量約為60 kDa[10]。特別地，ZH0-Ⅰ分子質量為91 kDa，ZH0-Ⅳ分子質量為113 kDa[10]。

3.2 根據底物特異性

將褐藻膠裂解酶分為1,4-β-D-聚甘露糖醛酸裂解酶（EC 4.2.2.3），1,4-α-L-聚古羅糖醛酸裂解酶（EC 4.2.2.11），以及在兩者中均顯示活性的雙功能酶。目前已報道多種雙功能裂解酶，Tavafi等[11]在銅綠假單胞菌中發現了既能降解Poly M，又能降解Poly G的雙功能褐藻膠裂解酶。

3.3 根據作用方式

褐藻膠裂解酶可被分為內切酶和外切酶，外切酶也可稱為寡褐藻膠裂解酶（EC 4.2.2.26）。迄今為止大部分褐藻膠裂解酶為內切酶，主要產物為不飽和寡糖（2-4糖）。不飽和寡糖無法直接轉化為生物燃料，而外切褐藻膠裂解酶作用于褐藻膠或褐藻寡糖的非還原末端，釋放出的不飽和殘基DEH，可用作生物燃料[5]，生物燃料的生產突出了外切型褐藻膠裂解酶的意義。表1是近年發現的外切褐藻膠裂解酶。

表1 外切褐藻膠裂解酶

3.4 根據序列相似性

根據CAZy數據庫（www.CAZy.org/olysaccharide-Lyases.html），褐藻膠裂解酶分為12個多糖裂解酶家族（PLs），包括PL5，PL6，PL7，PL14，PL15，PL17，PL18，PL31，PL32，PL34，PL36和PL39。Helbert等[29]研究表明，PL32，PL34和PL36是新建立的，PL36包括39個細菌序列和一個真菌序列[30]。Ji等[9]從Defluviitalea phaphyphilaAlg1中分離出新的PL39家族的褐藻膠裂解酶。

大多褐藻膠裂解酶屬于PL-5和PL-7家族，且多為Poly M裂解酶。但PL-7家族中也包含一部分Poly G裂解酶，對于重組酶Aly1281[12]，Poly G的裂解優于Poly M。近年來PL-6家族的褐藻膠裂解酶也被廣泛分離出來。PL-6家族中多為Poly G裂解酶，例如Lyu等[8]從弧菌OU02中分離出的第一個單域結構的褐藻膠裂解酶AlyF是Poly G裂解酶。但也有例外，如SHA-4是PL6家族中第一個對PolyMG有底物偏好性的外切型褐藻膠裂解酶[26]，BeclPL6[6]為Poly M褐藻膠裂解酶。

3.5 根據折疊類型

褐藻膠裂解酶可分為3個折疊類型：β-jelly roll class（PL7，PL14，PL18和PL36）、（α/α）n環折疊（PL5，PL15和PL17）和β-螺旋（PL6）[31]。AlgNJU-03[7]及Aly36B[30]分別屬于PL-7和PL-36家族，結構均為β-jelly roll。PL6家族的PsAly[13]及BeclPL6[6]均為β-螺旋結構。

4 褐藻膠裂解酶的酶活測定方法

4.1 初篩——平板測定法

以褐藻膠為唯一碳源，對褐藻膠裂解酶進行定性篩選，包括乙醇法、碘液法、CaCl2法、十六烷基氯化吡啶（CPC）等，未被水解的底物會被染色或形成白色沉淀。

Sawant等[32]首次提出用革蘭氏碘代替CPC：革蘭氏碘2～3 min即可清楚形成對比區域，而CPC法至少需要30～40 min，且培養基中的瓊脂會干擾CPC的作用。因此革蘭氏碘是目前使用平板篩選褐藻膠裂解酶產生菌的最佳方法。

4.2 復篩

復篩即定量測定，包括紫外吸光光度法[33]、硫代巴比妥酸法（TBA法）[24]、3,5-二硝基水楊酸法（DNS定糖法）、黏度法等。魏丹等[18]提出了改良版的DNS法，采用0.1 mL酶與1 mL底物反應，沸水滅活3 min，該方法可以減少發酵液中原本的還原糖對顯色的影響。近年來紫外法及DNS法應用較為廣泛，但因試驗條件的不確定性以及酶活單位定義的不同，各種測定方法之間還無法完全進行比較。

5 菌株產酶酶活的提高

對發酵條件的優化可以提高菌株產酶酶活。例如菌株大多需要褐藻膠誘導產酶；海洋細菌對NaCl含量要求較高，且大多褐藻膠裂解酶對Na+具有依賴性；另外金屬離子對酶與底物結合時的電荷有影響，使得部分金屬離子對酶活具有促進或抑制作用[18]。

由于部分野生菌的不穩定性以及酶活較低，對其進行編碼重組可以獲得更高酶活的褐藻膠裂解酶。Hu等[33]將Aly7B重組為Aly7B-CDⅠ和Aly7B-CDⅡ，僅Aly7B-CDⅡ具有褐藻膠裂解酶的酶活，且酶活提高了近6倍。Li等[22]將重組褐藻膠裂解酶AlyPL6固定在MTOP上，可以提高其熱穩定性和重復利用性，使其在工業上得到更充分的應用。因此，在編碼重組及固定化的基礎上進行發酵條件的優化，可以得到更高酶活及優良生物活性的褐藻膠裂解酶。

6 褐藻膠裂解酶的酶學性質

不同的褐藻膠裂解酶的酶學性質不盡相同，對酶學性質的研究可以使酶發揮出最大潛力。

研究表明褐藻膠裂解酶最適溫度范圍為30～50℃，但也有例外，高楊等[21]從印度尼西亞的熱泉樣品中分離出的褐藻膠裂解酶AlyB5的最適溫度為65 ℃，在70 ℃時仍保持75%以上的酶活；而Itoh等[13]克隆出的褐藻膠裂解酶PsAly的最適溫度在67 ℃，在37 ℃保存24 h，酶活仍保留50%以上，隨著溫度升高，其半衰期的出現時間越短。

褐藻膠裂解酶的最適pH約為6.0-8.0，特別的，Li等[22]克隆出的AlyPL6的最適pH為10；嚴芬等[34]篩選的褐藻膠裂解酶的最適pH為5.5，偏酸性。

不同金屬離子會對褐藻膠裂解酶的活性產生影響，少數幾個在多金屬離子條件下表現出高活性，還有部分受到某些金屬離子的抑制作用。He等[10]在鞘氨醇單胞菌中分離克隆了3個內切酶及一個外切酶，Hg2+對這四種酶的活性均有促進作用，同時也存在其他金屬離子對克隆出的4個酶有促進或抑制作用。AlgNJU-03的酶活在含有Ca2+、Fe2+或Co2+環境中提高，特別是Ca2+對其酶活促進作用最為明顯[7]。Ca2+對較多的褐藻膠裂解酶的酶活具有促進作用，但也有例外，比如AlyF具有鈣不依賴性[8]，Ca2+對Aly17B具有抑制作用[35]等。

Zhu等[14]從Microbulbifersp.ALW1中分離出的褐藻膠裂解酶在0.5 mol/L Na+作用下酶活提高5.1倍。重組酶Aly1281[12]具有明顯的耐鹽性，使其可以應用于褐藻的工業酶法加工而無需進行水密集的脫鹽處理。

7 褐藻膠裂解酶的應用

褐藻膠裂解酶可應用于食品、農業、制藥及能源等方面，其不僅可以降解褐藻膠，定向制備褐藻寡糖，也可用于闡明褐藻膠的細微結構、制備海藻原生質體、發酵生產乙醇、降解生物膜等。

7.1 功能性低聚糖的制備

褐藻膠內切酶是將褐藻膠生產為功能性低聚糖（2-5糖）的關鍵工具，不同聚合度的褐藻寡糖的應用也不盡相同。低分子質量（500～3000 Da）和較高的M/G比（＞1）的褐藻寡糖能更好地促進植物的生長[2]。Zhang等[3]和Zhu等[14]發現的褐藻膠裂解酶產的二糖均具有抗氧化活性。Chen等[4]分離出4個不同聚合度（DPs）的寡糖，但在這些寡糖中僅五糖對骨肉瘤細胞顯示抗腫瘤功能。

7.2 褐藻膠精細結構的闡明及海藻原生質體制備

褐藻膠裂解酶也可用于分析或修飾褐藻膠的精細結構。Aarstad等[1]采用H-1 NMR，HPAEC-PAD和SEC-MALLS等方法分析降解的反應產物和分離的褐藻膠片段，實現褐藻膠的測序。褐藻膠裂解酶也可以制備藻類的原生質體，應用于基因工程和獲得再生植株。Inoue等[36]發現褐藻膠裂解酶可以分解凝膠結構，進而有效地從日本粳稻葉片中分離出原生質體。

7.3 發酵生產乙醇

褐藻膠作為生產生物乙醇的可再生資源，已引起越來越多的關注。褐藻膠、甘露醇和葡萄糖的分解代謝產生了丙酮酸鹽，可以從中合成大量的燃料，Wargacki等[5]建立了生產乙醇的微生物平臺，其產量可以達到理論值的80%。目前僅在實驗室條件下采用工程菌株生產乙醇，還無法完全應用于工業生產。

7.4 生物膜的降解及囊性纖維化的治療

褐藻膠裂解酶能夠降解細菌分泌的褐藻膠形成的生物被膜，增強抗生素的滲透性。部分抗生素（妥布霉素、頭孢克肟）與褐藻膠裂解酶具有協同作用，可以促進生物膜的根除，相反也有的抗生素（環丙沙星）與褐藻膠裂解酶的結合顯示拮抗作用[11]。褐藻膠裂解酶在囊性纖維化的治療中也顯示出巨大的潛力，Wan等[37]創建了銀納米復合材料，遞送兩種藥物化合物（褐藻膠裂解酶和頭孢他啶）以降解褐藻膠并從肺部根除銅綠假單胞菌。

8 結語

目前已經分離并鑒定了各種來源的褐藻膠裂解酶，這些酶具有不同的結構、作用方式和底物特異性，其酶學性質也是多種多樣的，可應用于食品、農業、醫藥和能源等領域。

雖然目前關于褐藻膠裂解酶的研究有很大進展，但仍有許多工作要做。目前發現的褐藻膠裂解酶的穩定性較低，使其僅處于實驗室水平，很少應用于工業中，因此分離出活性高和穩定性好的新型酶對于褐藻膠裂解酶的研究和工業發展都具有重要意義。