萊蕪干烘茶中咖啡因提取方法及濃度測定的優(yōu)化

曹峰

濟(jì)南市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心（濟(jì)南 250102）

萊蕪干烘茶是萊蕪特產(chǎn)，創(chuàng)始于明朝隆慶年間，原產(chǎn)于安徽省六安、霍縣一帶，后傳入萊蕪地區(qū)，距今已有400多年的歷史。萊蕪干烘茶屬半發(fā)酵茶，其湯色橙紅，口味苦中帶澀，甘醇悠長，深受當(dāng)?shù)孛癖娤矏邸？Х纫蛴置Х葔A，是茶葉中的重要成分，作為一種中樞神經(jīng)興奮劑，臨床上用于治療神經(jīng)衰弱，但是大劑量或長期使用會(huì)對人體造成危害[1]，如影響睡眠，降低女性受孕率，嚴(yán)重者會(huì)損害肝、胃、腎等重要器官[2]，特別是它有成癮性，一旦停用會(huì)出現(xiàn)精神萎靡、渾身困乏疲軟等癥狀[3-4]，因而國家制定了相應(yīng)的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)。

咖啡因的濃度是衡量茶葉品質(zhì)的一項(xiàng)重要指標(biāo)[5]，因此準(zhǔn)確測定咖啡因的濃度對確保茶葉質(zhì)量及開發(fā)利用我國豐富的茶葉資源具有十分重要的意義。目前測定咖啡因的方法有薄層色譜法、紫外分光光度法、氣相色譜法和高效液相色譜法等[6-7]，其中高效液相色譜法具有高效、快速、靈敏度高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)[8]，應(yīng)用較多。

醇提法及二氯甲烷等有機(jī)溶劑提取法是從茶葉中提取咖啡因的兩種常用方法，醇提法一般使用乙醇溶液為溶劑，使用索氏提取器蒸餾提取或者直接加熱浸提[9]，前者需連續(xù)提取2～3 h[10]，耗時(shí)較長；二氯甲烷等有機(jī)溶劑提取法需使用大量二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮等對人體有害且易污染環(huán)境的有機(jī)試劑，并需蒸餾、水浴回收、抽濾等操作步驟[11-12]，不利于日常檢測。盡管國標(biāo)方法[13]對樣品處理過程進(jìn)行了改進(jìn)優(yōu)化，采用水為提取溶劑，使用氧化鎂沉淀茶葉中的單寧酸等物質(zhì)，但處理過程需用沸水浴提取2次，不時(shí)振搖并用流水冷卻，操作繁瑣，耗時(shí)長，且提取率較低[10]。針對這些問題，為提高提取率、簡化提取工藝，參考國標(biāo)方法及相關(guān)文獻(xiàn)[1,6,8-13]并略加改進(jìn)，以70%乙醇溶液為溶劑，對加熱振蕩提取、超聲提取及微波萃取3種方法的提取效果進(jìn)行研究，并對測定萊蕪干烘茶中咖啡因的高效液相色譜法進(jìn)行優(yōu)化，為萊蕪干烘茶的檢驗(yàn)檢測及進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

U3000高效液相色譜儀（配VWD-3100紫外檢測器），美國Thermo Fisher公司；UV-2700紫外可見分光光度計(jì)，日本島津公司；MARS 6 CLASSIC微波萃取儀，美國CEM公司；LTB-800數(shù)控超聲波清洗機(jī)，濟(jì)寧魯通超聲電子設(shè)備有限公司；TDZ5-WS臺(tái)式離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開發(fā)有限公司；SHA-C水浴恒溫振蕩器，江蘇金怡儀器科技有限公司。

咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品（≥99.8%），德國DR公司；無水乙醇（分析純），天津市大茂化學(xué)試劑廠；甲醇、乙腈（均為色譜純），山東禹王和天下新材料有限公司；氧化鎂（分析純），天津金匯太亞化學(xué)試劑有限公司；萊蕪干烘茶，山東五福茶業(yè)有限公司；測試用水為娃哈哈純凈水。

1.2 液相色譜條件

色譜柱：Acclaim120 C18柱（4.6 mm×150 mm，粒徑5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-水（25∶75，V/V）；流動(dòng)相流速：1 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：275 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

1.3 干烘茶樣品的處理

將干烘茶樣品低溫干燥后粉碎，過0.600 mm孔徑篩，精確稱取茶葉樣品和氧化鎂置于具塞三角瓶及微波萃取管中，分別加入不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液作為提取劑，渦旋混勻后分別采用加熱振蕩提取、超聲提取及微波萃取3種方法提取樣品中的咖啡因。將得到的提取液以5000 r/min離心15 min，移取全部上清液于容量瓶中用純水定容，經(jīng)有機(jī)相針式濾器過濾后上機(jī)測試。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的研究確定

2.1.1 檢測器波長的確定

將50 mg/L咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品溶液用島津紫外分光光度計(jì)進(jìn)行光譜掃描，繪制吸收曲線，以確定咖啡因的最大吸收波長，結(jié)果見圖1。

圖1 咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品溶液吸收曲線

從吸收曲線可以看出咖啡因在275 nm處吸收波長最大，與丁瑞芳等[7]的研究結(jié)果一致。由于在最大吸收波長條件下檢測，雜質(zhì)干擾少，比較靈敏且穩(wěn)定性好，因此確定275 nm為測定波長。

2.1.2 流動(dòng)相組成及比例的確定

在國標(biāo)方法[13]基礎(chǔ)上并參照相關(guān)研究[1,2,7]，考察甲醇和乙腈兩種有機(jī)相分別與水以不同體積比混合作為流動(dòng)相時(shí)對目標(biāo)峰與雜質(zhì)峰的分離效果的影響，結(jié)果顯示在兩種有機(jī)相下目標(biāo)峰與雜質(zhì)峰分離良好并且均能得到較好的峰形。由于甲醇的毒性相對要小，因此選擇甲醇-水作為方法的流動(dòng)相。

將甲醇-水兩相在不同體積比（10∶90，20∶80和25∶75）條件下對干烘茶提取液進(jìn)行測定（紫外波長275 nm，柱溫為30 ℃），結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩相的體積比在10∶90時(shí)咖啡因出峰時(shí)間約為18 min，體積比在20∶80時(shí)咖啡因出峰時(shí)間在7 min左右，但體積比為25∶75時(shí)咖啡因能在5 min內(nèi)出峰，目標(biāo)峰與雜質(zhì)峰能完全分離，色譜峰峰形較好，為提高檢測效率，研究采用甲醇與水的體積比25∶75。

2.1.3 色譜柱溫度的確定

在25～40 ℃的溫度范圍內(nèi)按照1.2的色譜條件每隔5 ℃度測定1次咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品溶液，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在此溫度范圍內(nèi)柱溫對咖啡因色譜峰峰形及保留時(shí)間的影響均不顯著，由于高溫不僅影響色譜柱壽命，還會(huì)使各組分的分離度減小，因此選擇柱溫30 ℃。

在以上確定的色譜條件下，咖啡因標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及萊蕪干烘茶樣品色譜圖如圖2和圖3所示。

圖2 咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品溶液色譜圖

圖3 萊蕪干烘茶樣品色譜圖

2.2 咖啡因提取方法的優(yōu)化選擇

目前從茶葉中提取咖啡因的方法根據(jù)提取溶劑的不同主要有水提法、醇提法及二氯甲烷等有機(jī)溶劑提取法[11]。按照提取方式不同可分為直接加熱浸提、超聲提取、微波萃取等[14-17]方法。相關(guān)研究[10,18]表明相對于使用水及二氯甲烷為提取劑，用乙醇溶液為提取劑更利于咖啡因的提取，因此選擇不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液為提取溶劑，并將直接加熱浸提改進(jìn)為加熱振蕩提取，然后將加熱振蕩提取、超聲提取與微波萃取進(jìn)行比較，以便選擇一種較好的提取方法。

2.2.1 加熱振蕩提取

加熱振蕩提取是最常用的一種提取方法，簡單易行。參照其他研究[9]，稱取0.5 g（精確至0.001 g）粉碎的萊蕪干烘茶樣品及1 g氧化鎂各5份放入5只100 mL具塞三角瓶中，分別加入40 mL 50%，60%，70%，80%和90% 5種不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液，放入水浴恒溫振蕩器中，由于常壓下乙醇溶液沸點(diǎn)較水低（50%及90%乙醇水溶液沸點(diǎn)分別為81.9和78.5℃），為防止提取過程中乙醇沸騰溢出及減少揮發(fā)，造成咖啡因損失，提取溫度不宜太高，研究選擇水浴溫度78 ℃，以30 r/min的速度振蕩提取60 min。

2.2.2 超聲提取

超聲提取是利用超聲波機(jī)械粉碎和空化作用，以加速提取物向溶劑擴(kuò)散，提高有效成分提取率的方法[9]。按照2.2.1稱取干烘茶樣品及氧化鎂并加入不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液，在功率200 W，78 ℃下超聲提取60 min。

2.2.3 微波萃取

微波萃取技術(shù)是近期發(fā)展起來的一種新型提取技術(shù)，具有萃取時(shí)間短、試劑用量少、節(jié)能高效等優(yōu)點(diǎn)[19-20]，已被廣泛應(yīng)用于食品、生物樣品的分析與提取。

研究的萃取方法參照CEM微波化學(xué)（中國）技術(shù)中心提供的《MARS微波萃取常用方法》及其他文獻(xiàn)并適當(dāng)改進(jìn)，稱取0.5 g（精確至0.001 g）粉碎的干烘茶樣品及1 g氧化鎂各5份放入5只萃取管中，分別加入20 mL 2.2.1中5種不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液，按照表1方法進(jìn)行萃取。

表1 微波萃取方法

將以上3種方法提取得到的15組不同提取液以5000 r/min離心，取全部上清液用純水定容至50 mL，經(jīng)0.22 μm有機(jī)相針式濾器過濾，然后按照優(yōu)化的檢測條件對提取液進(jìn)行測定，結(jié)果如圖4所示。

圖4 提取方法及乙醇體積分?jǐn)?shù)對咖啡因提取效果的影響

由圖4可以看出，提取方法及乙醇體積分?jǐn)?shù)對咖啡因的提取效果有較為顯著的影響，在相同茶葉樣品的條件下，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)，采用微波萃取所得咖啡因的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，為23.8 mg/g；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%時(shí)，仍然是微波萃取所得咖啡因質(zhì)量分?jǐn)?shù)最大，但小于乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)所得，加熱振蕩法得到的咖啡因的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最小，僅為18.5 mg/g。從以上結(jié)果可以看出采用70%乙醇溶液為提取溶劑，以微波萃取的方法的提取效果最好，操作簡單且用時(shí)最短。因此選擇以70%乙醇溶液為提取溶劑，采用微波萃取法提取萊蕪干烘茶中的咖啡因。

2.3 咖啡因的線性及方法檢出限

將咖啡因標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制成1.0～150.0 mg/L之間6種不同質(zhì)量濃度的溶液，依照優(yōu)化的測試條件進(jìn)行測定，結(jié)果顯示在此范圍內(nèi)質(zhì)量濃度和峰面積線性關(guān)系良好。咖啡因的校正曲線見圖5，曲線方程、檢出限及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（SRSD）等見表2。

圖5 咖啡因校正曲線圖

表2 校正曲線和檢出限

2.4 方法精密度試驗(yàn)

利用微波萃取法提取干烘茶樣品中的咖啡因后，按照優(yōu)化的液相色譜法平行測定樣液6次，并計(jì)算咖啡因測定值的SRSD及平均值，結(jié)果見表3。

表3 咖啡因精密度試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

結(jié)果顯示，6次測量值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（SRSD）為0.46%，干烘茶樣品中咖啡因的平均值為23.85 mg/g，說明該方法精密度較好，可以在日常檢測中應(yīng)用。

2.5 方法加標(biāo)回收率的測定

稱取適量茶葉樣品，在校正曲線范圍內(nèi)按照表4所示的加標(biāo)量分別加入不同量的咖啡因標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，并依照上述確定的方法處理后進(jìn)行測定，測定結(jié)果見表4。

表4 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

表4結(jié)果顯示，按照優(yōu)化的提取方法及測試條件測定萊蕪干烘茶中的咖啡因，其加標(biāo)回收率為97.4%～100.2%，平均回收率為98.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（SRSD）為1.02%，測試結(jié)果精確可靠。

3 結(jié)論

對3種提取咖啡因的方法進(jìn)行對比研究，結(jié)果表明以70%乙醇溶液作為提取液，氧化鎂為沉淀凈化劑，利用微波萃取干烘茶中的咖啡因，經(jīng)離心過濾后直接上機(jī)測試，相比加熱振蕩提取及超聲提取，微波萃取法操作更簡單，提取率高，耗時(shí)少；與其他測定茶葉中咖啡因的高效液相色譜法[1,5,9]相比，該方法前處理工藝簡單快捷，分析時(shí)間短，加標(biāo)回收率較高，檢出限較好。從以上結(jié)果顯示該方法提取率高、分離效果好、快速簡便、精密度高，符合相關(guān)檢驗(yàn)檢測要求，適用于萊蕪干烘茶中咖啡因含量的分析測試。