研究珠海弓斑東方鲀的毒性和腸道微生物結構隨著生長年齡之變異

北京師范大學-香港浸會大學聯合國際學院 李子威，余振輝，姚世榮

一、引言

河豚是分布在世界各地的動物,其含有河豚毒素和TTX。河豚毒素（tetrodotoxin，TTX）因為在河豚身體中發現，而被命名為河豚毒素。盡管河豚毒素發現于河豚體內，但是通過對其他物種以及養殖河豚的研究[1]，河豚并不是河豚毒素的來源。在此次研究中，取珠海市不同生長年限的弓斑東方鲀作為樣本，測量器官中毒素含量以及對腸道菌群進行16S rRNA掃描，對比其腸道菌群的差異。

二、數據和研究方法

（一）數據組成及其來源

本研究使用弓斑東方鲀（Takifugu ocellatus）作為實驗對象，為珠海市唐家市場、朝陽市場獲得的野生弓斑東方鲀采用LS-MS/MS法，檢測肝、皮膚、肌肉中TTX的含量。腸道樣本取樣后送往基因公司檢測，并獲得報告，然后進行一系列分析和檢驗。

（二）數據取得方法

取樣記錄所有河豚魚的體重和長度，解剖后，所有樣品保存在-80℃環境中。分別取10克肌肉、皮膚和肝臟，用25ml 0.1%乙酸在100℃加熱10min提取后，以7000 rpm離心5分鐘。過濾加入與混合物比例為1:1的正己烷去除脂肪。用0.1%乙酸將樣品稀釋為50ml，用0.2μmPTFE膜過濾后進行LC/LC-MS分析。腸道取樣是基因公司進行16S rRNA測序。雙端(2×300)基因測序由Illumina基因公司進行。原始數據通過QIIME 2軟件對分解后的序列進行定量分析。

本研究中使用總重量和總長度之間的關系，TW是總重量(g)，TL是總長度（cm）。

三、結果與分析

（一）河豚體長以及生長曲線

根據長度頻數分布，弓斑東方鲀可能有3個不同的世代或年齡組。第1組長度在5厘米到10厘米之間，第2組長度在10厘米到14.5厘米之間，第3組長度在14.5厘米到22.5厘米之間。每組選取10個樣品進行TTX濃度檢測（如圖1）。

圖1 河豚總長度與總質量的關系圖

比較不同河豚同一組織中TTX的濃度，發現第2年組肝臟和皮膚的毒性最大。肝臟和皮膚中TTX的濃度從第1年到第2年逐漸升高，第3年又開始下降。肌肉中TTX的濃度隨著年份的增加而不斷降低。

（二）腸道菌群分析

多樣性指數結果顯示，第2年河豚的腸道微生物多樣性最大，第1年河豚的腸道微生物多樣性最小（如圖2）。

圖2 基于Shannon多樣性指數的稀疏性曲線

由圖3數據表明，第3年河豚腸道微生物組成與第1年腸道微生物組成相似，第2年河豚的腸道微生物組成與其他年份的差異明顯。

圖3 坐標1-2與坐標1-3平面展示圖

表1 第1年與第3年間腸道微生物的百分位數豐度差異

表2 第1年與第2年間腸道微生物的百分位數豐度差異

表3 第2年與第3年間腸道微生物的百分位數豐度差異

有兩種優勢腸道微生物能夠產生TTX，第一種為弧菌，弧菌在各組優勢微生物中排名基本持平。第二種為擬諾卡氏菌屬，在各組優勢微生物的排名迅速上升后又下降。

哈維弧菌群是一種能夠產生TTX的鰻弧菌集團,其中檢測出的相似DNA片段包括兩種細菌：副溶血性弧菌和溶藻弧菌，異型菌菌種以及藍色弧菌是否可以產生TTX尚未可知。ANCOM檢驗表明，弧菌數量的變化為：1年最多，第2年下降，第3年增長。

四、討論

在同一年齡的河豚體內不同組織中TTX的濃度，肝臟毒素含量一定高于皮膚和肌肉，表明肝臟是TTX積累的主要組織。當比較不同河豚年齡時，發現TTX在肝臟和皮膚中的含量從第1年到第2年呈上升趨勢，第3年又呈下降趨勢。我們推論，河豚腸道微生物多樣性越高，其體內肝臟和皮膚中的毒素含量越高。因為通過分析，發現第2年河豚腸道微生物多樣性為最高，第1年的多樣性也高于第3年。另外在分析中發現，第1年河豚的腸道微生物的組成與第3年腸道微生物組成十分相似，第2年的河豚腸道微生物組成有別于第1和第3年。我們發現河豚肌肉中TTX的濃度會隨著年齡的增加而不斷降低，這與其體內腸道微生物多樣性和組成沒有直接關系，因為肌肉不是儲存TTX的組織，而其TTX含量會一直降低到不能被檢測到。

弓斑東方鲀是在珠江河口一帶常見的河豚，剛出生的河豚一般在河口生活和覓食一到兩年，然后會游到大海生長，直到身體成熟再洄游到珠江河口產卵繁殖下一代，因此，不同年齡的河豚腸道微生物會因環境和食物的改變而不同。我們進一步發現有兩種腸道優勢微生物可以產生TTX，分別是弧菌和擬諾卡氏菌屬,其中有報道，達松維爾擬諾卡氏菌是一種從河豚卵巢分離出的新型的能夠產生TTX的放射菌類[2]。而弧菌屬代表菌在許多攜帶TTX的動物中占所有產生TTX菌株的30%以上，大多數研究表明毒素的產生與水生動物微生物群的溶藻弧菌有關系[3]。根據ANCOM檢驗可知，腸道微生物弧菌數量從先減少后增加，而擬諾卡氏菌屬，在各組優勢微生物的排名中迅速上升后又下降。這兩種微生物，在每個階段數量的增加和減少相互補充，可以維持了TTX的產生。這兩種微生物之間可能存在競爭關系，幫助河豚合成TTX。

第1年河豚腸道微生物中弧菌的數量最多，河豚與產生TTX的細菌之間可能有一些關系，因為TTX的產生有助于幫助野生河豚對抗天敵，且分布于生物體表或者體內的河豚毒素具有重要的保護作用,可以警示或威懾其捕食者[4]。這些河豚毒素還可以傳遞給幼魚，有研究表明擁有河豚毒素的幼體可以防止礁石魚類的捕捉從而提高成活率[5]，因此幼年河豚體內弧菌數量最多有助于幼魚的存活率。