聚乙二醇改性聚乳酸神經導管修復大鼠坐骨神經缺損

羅 東，史振偉，王 玉，孫 琦，黃轉青，程曉清，馬 玥，楊 飛，張 瑩，王聰聰，許文靜，徐風華

1 解放軍醫學院，北京 100853；2 解放軍總醫院醫療保障中心 藥劑科藥學基礎研究室，北京 100853；3 解放軍總醫院 骨科研究所，北京 100853

周圍神經損傷(peripheral nerves injury，PNI)會導致受支配區域感覺和運動功能障礙，甚至導致終身殘疾，嚴重影響患者的生活質量，其臨床常見體征和癥狀有麻木、刺痛、搏動、灼熱、劇烈疼痛等[1-2]。目前，自體神經移植仍是臨床治療周圍神經損傷的首選方法，同時也是研究其替代治療措施的“金標準”[3]。但自體神經來源有限，且存在增加創傷、遺留供區感覺障礙、神經束支對合及匹配不佳等缺點[4]。為了滿足大間隙修復的臨床需求，解決自體神經移植的限制，基于組織工程的神經引導導管(nerve guidance conduit，NGC)開始發展起來，該方法通過植入天然、合成或半合成生物材料的NGC 來治療周圍神經缺損[5-6]。聚乳酸(poly lactic acid，PLA) 具有良好的生物相容性、良好的生物降解性和熱塑性，其在神經再生組織工程中的應用引起了人們的極大關注[7]。但其代謝中間產物乳酸在局部堆積會導致局部pH 值下降，同時其親水性差，細胞吸附率低，不利于細胞表面黏附，這都會影響神經損傷的修復再生。研究表明，細胞外酸性pH 可刺激巨噬細胞NLRP3 炎性小體活化和IL-1β 分泌，周圍神經損傷常伴隨局部酸中毒、缺血和炎癥，而局部酸中毒又會進一步促進缺血和炎癥的發生[8-9]。聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG) 是一種常見的醇類水凝膠材料，在神經再生領域也有廣泛應用[10]。用聚乙二醇制備的水凝膠有著良好的親水性和生物相容性，其分子鏈含有羥基和醚鍵，因此能與含羧基、羥基的水溶性分子通過分子間的氫鍵形成網絡結構[11-12]。本研究利用PEG 改善PLA 導管親水性能，誘導免疫耐受，減輕免疫反應，同時防止PLA 中間降解產物乳酸在導管內聚集，維持神經再生局部微環境穩定，探討其作為神經修復支架的可能性。

材料與方法

1試劑及儀器 聚乳酸(η=0.8 dL/g，相對分子質量1×105，山東省醫療器械研究所)；二氯甲烷(國藥化學試劑有限公司)；PEG3000(Fluka 公司)；丙烯酰氯(TCI 公司)；三乙胺(Sigma-Aldrich)；帶線縫合針(上海浦東金環醫療用品公司)；甲苯胺藍染料(北京化學試劑有限公司)，小鼠來源NF200 單克隆抗體(Sigma-Aldrich 公司)，山羊抗小鼠IgG/Alexa Fluor?488(Abcam 公司)，兔來源抗S100 多克隆抗體(Sigma-Aldrich 公司)，山羊抗兔IgG/Alexa Fluor?594(Abcam 公司)，兔來源抗CD31 多克隆抗體(Servicebio 公司)，山羊抗小鼠CY3(Servicebio公司)，山羊抗兔IgG/Alexa Fluor?488(Servicebio公司)，DAPI 染色劑(北京百奧科技有限公司)；RSC96 細胞(上海雅吉生物有限公司)。SU-8200 型掃描電子顯微鏡(日立公司)；SHY-2A 型水浴恒溫振蕩器(江蘇金壇國勝實驗儀器廠)；Catwalk XT 10.5 小動物步態分析儀(Noldus 公司)；RM2016 病理切片機(上海徠卡儀器有限公司)；JB-P5 型包埋機(武漢俊杰電子有限公司)；Donatello 脫水機(DIAPATH 公 司)；ECLIPSE C1 型熒光顯微鏡(Nikon 公司)；108 AUTO/SE 型離子濺射儀(廣州競贏化工科技有限公司)。

2實驗動物 健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠30 只，10 周齡，體質量250～300 g，用于構建大鼠坐骨神經10 mm 缺損動物模型，由斯貝福(北京) 生物技術有限公司提供，許可證號：SCXK(京)2019-0010，經過解放軍總醫院實驗動物管理和使用委員會批準，嚴格執行動物實驗程序，飼養于自動供應食水、12 h 光照/黑暗循環條件的塑料鼠籠中。

3PLA 神經導管的制備 采用溶劑揮發法制備PLA 導管。稱取20 mg 聚乙二醇溶于1 mL 二氯甲烷中，攪拌均勻后加入280 mg 聚乳酸，再次攪拌均勻。將不銹鋼模具(直徑1.5 mm、長80 mm)垂直浸入溶液30 s 后提出，室溫放置，待溶劑揮發后，從不銹鋼模具上取下，制備成內徑1.5 mm、壁厚0.2 mm、長14 mm 的PLA 導管。封裝后經γ 射線輻射滅菌，4℃保存備用。

4PEGDA 的合成 稱取3 g PEG3000 于反應器中，加入20 mL 甲苯攪拌使PEG3000 完全溶解，密封，通入氮氣保護。向其中滴加555 μL 三乙胺和325 μL 丙烯酰氯，38℃水浴，攪拌過夜。將反應液過濾，濾液用50 mL 的4℃冷乙醚重結晶。濾餅在38℃水浴溶解后，冷卻至室溫，再用50 mL 的4℃冷乙醚重結晶2 次。將濾餅常溫避光干燥24 h，得到白色產物，避光-20℃保存。

5PEG-PLA 神經導管的制備 稱取PEGDA 0.5 g溶于1 mL 純凈水中，待完全溶解后，再向其中加入100 μL 的APS 溶液(50 mg/mL)和50 μL 的TEMED溶液(20%，pH 7.4)，反應30 s，用移液槍將尚未完全膠凝的溶液垂直注入PLA 導管，旋轉PLA 導管，使溶液在管壁均勻分布。干燥24 h。PBS 洗3 次，每次5 min。封裝后經γ 射線輻射滅菌，4℃保存備用。

6掃描電鏡觀察導管的結構和形態 將PLA 神經導管和PEG-PLA 神經導管沿矢狀位切開，修剪成矩形小塊，將兩種移植物的內外側分別用導電膠固定于SU82000 型掃描電鏡的標本金屬底座上，108 AUTO/SE 型離子濺射儀中氬氣填充密閉條件下噴金。將固定有標本的金屬底座移至顯微鏡掃描電鏡內，調整坐標及焦距，真空條件下5 kV電壓對標本進行檢測并記錄照片。

7細胞毒性評價將單純PLA 和PEG-PLA 神經導管分別放入含有體積分數10% 胎牛血清的DMEM 培養基中，置于37℃、5% CO2的培養箱中培養48 h，棄去導管，得到預處理的DMEM 培養基。設置Control 組(未處理的DMEM 培養基)、PEG-PLA 組(PEG-PLA 預處理DMEM 培養基)和PLA 組(PLA 預處理DMEM 培養基)，每組5 個復孔，將生長至對數培養期的RSC96 細胞以2.5 × 105/mL 的濃度接種于60Co 消毒的96 孔板中，每孔200 μL 細胞懸液，于5% CO2、37℃恒溫培養箱中培養。過夜，待細胞貼壁后，更換為上述對應培養基，培養1 d、3 d 和5 d。于各檢測時間點向每孔加入20 μL 的CCK-8 溶液，37℃孵育1 h 后，將96 孔板置于微量孔板分光光度計中，測定各孔在450 nm 處的吸光度值。

8動物分組及實驗方法 SD 大鼠30 只隨機分為自體神經移植組(ANG)、聚乙二醇改性聚乳酸神經導管組(PEG-PLA)、聚乳酸神經導管組(PLA)，每組10 只。電子天平稱量SD 大鼠體質量，3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg 體質量)進行麻醉。角膜反射確定麻醉可靠后于大鼠右后肢備皮，常規消毒鋪巾。取右后肢后外側縱行切口，長約2.5 cm，逐層切開皮膚、皮下、肌層，暴露坐骨神經，直尺測量下切除7 mm 坐骨神經，坐骨神經斷端回縮，最終形成10 mm 坐骨神經缺損，以8-0帶針縫合線分別在坐骨神經近、遠端橋接縫合移植物，確認橋接物縫合可靠，0.9%氯化鈉注射液沖洗術區，止血充分后以3-0 手術縫合線逐層縫合肌層和皮膚，碘伏消毒切口后等待麻醉蘇醒。麻醉蘇醒后按分組分籠飼養于自動供應食水、12 h光照/黑暗循環條件的塑料鼠籠中。

9再生神經免疫熒光染色 術后第2 周每組隨機選取5 只大鼠腹腔注射過量3%戊巴比妥鈉處死，充分暴露并完整切取再生神經。切取的移植段再生神經行10 μm 厚縱行冰凍切片，冰凍丙酮固定15 min，PBS 洗3 遍，每遍5 min。然后置于含10%山羊血清的PBS 中，在室溫條件下阻斷非特異性抗原2 h。切片用小鼠來源抗NF200 單克隆抗體(與PBS 按1∶200 稀釋)和兔來源抗S100 多克隆抗體(與PBS 按1∶200 稀釋) 作為一抗在4°C濕盒中孵育過夜。第2 天，去除多余一抗，切片用PBS 洗3 遍，每遍5 min，然后用山羊抗小鼠IgG/Alexa Fluor?488(與PBS 按1∶200 稀釋)和山羊抗兔IgG/Alexa Fluor?594(與PBS 按1∶200 稀釋)作為二抗在常溫避光條件下孵育1 h。去除多余二抗后，PBS 洗3 遍，每遍5 min，切片再用DAPI 工作液常溫避光條件下孵育5 min，蒸餾水清洗后水性封片劑封片。術后第12 周每組大鼠坐骨神經取材后行CD31/NF200 免疫熒光染色。

10大鼠運動功能恢復評價 術后4 周、8 周和12 周(每組5 只大鼠)中，使用Catwalk 步態分析系統評估運動功能的恢復。將大鼠放在走道板上，讓其向前走。當腳趾接觸踩踏表面時，將顯示實時運動圖像和3D 足跡。從每組的足跡中測量腳趾的長度和寬度以及靜態坐骨神經功能指數(sciatic nerve function index，SFI)。SFI=0 表示運動功能正常，SFI=-100 表示運動功能完全損傷。

11大鼠腓腸肌濕重分析和組織學評價 術后12 周，各組大鼠腹腔注射過量3%戊巴比妥鈉處死，取材各組大鼠雙側腓腸肌，立即稱重以術側腓腸肌與正常側腓腸肌濕重的比值進行標準化，所得數據用于計算腓腸肌濕重恢復率；然后取腓腸肌肌腹用4%多聚甲醛固定2 h，石蠟包埋并行腓腸肌肌腹橫斷面10μm 厚石蠟切片。切片常規脫蠟復水，以改良Masson 染色試劑盒進行染色，常規脫水、透明、封片。每組隨機選取5 個視野，測量腓腸肌纖維平均橫截面積。

12統計學方法 統計分析使用SPSS23.0 軟件進行，計量資料以表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

結果

1PEG-PLA 神經導管掃描電鏡下形態 掃描電鏡照片顯示新制備的PEG-PLA 神經導管外壁質地緊密，無微孔(圖1A)。而其內壁有質地疏松，呈軸向取向性的排列整齊的紋路(圖1B)。而PLA 神經導管內外壁均為致密無微孔的結構(圖1C)。

圖1 PEG-PLA 和PLA 神經導管電鏡 A：PEG-PLA 和PLA 神經導管外壁；B：PEG-PLA 神經導管內壁；C：PLA 神經導管內壁Fig.1 Scanning electron microscope of PEG-PLA nerve conduit A:PEG-PLA and PLA nerve conduit outer wall;B:PEG-PLA nerve conduit inner wall;C:PLA nerve conduit inner wall

2神經導管材料對RSC96 細胞增殖的影響 各組1 d、3 d、5 d 時在450 nm 處的吸光度值(OD value)無統計學差異(P＞0.05)，未處理的DMEM培養基培養的RSC96 細胞(對照組) 與PLA 神經導管預處理組和PEG-PLA 神經導管預處理組的細胞增殖差異無統計學意義(P＞0.05)，表明PEGPLA 神經導管預處理的RSC96 細胞可以正常增殖。見表1。

表1 神經導管材料對RSC96 細胞增殖的影響(n=5)Tab.1 Effect of nerve conduit on the proliferation of RSC96 cells in the three groups (n=5)

3大鼠運動功能恢復評價 Catwalk 步態分析提示，術后12 周，PEG-PLA 組的足趾分離程度較PLA 組明顯改善，接近自體神經移植組(圖2)。各組手術側足趾(右側)與地面的接觸面積均較正常側(左側)減小。同時可見各組大鼠傷側后足(右后足，RH) 受力重心均有不同程度后移，其中PLA 組RH 足印不明顯，足跟部受力面積增加，重心后移程度大于PEG-PLA 組和ANG 組。PEGPLA 組大鼠RH 足趾寬度及中間足趾寬度均較對側減小，而足印長度加大，且足趾受力強度較對側(LH) 明顯降低。而ANG 組大鼠RH 足趾寬度及中間足趾寬度接近對側(LH)，足印長度亦無明顯加大，足趾受力強度略低于對側(LH)。三組術后4 周SFI 均接近-100，表明術后神經功能惡化。隨著神經再生，單純PLA 組和PEG-PLA 組在第8 周和第12 周SFI 有所提高，但均明顯低于ANG組，單純PLA 組低于PEG-PLA 組，差異無統計學意義(P＞0.05)。見圖3。

圖2 術后12 周各組大鼠3D 步態足印Fig.2 At 12 weeks after operation,the 3D gait footprints of rats in each group were observed

圖3 術后4 周、8 周、12 周各組坐骨神經功能指數(aP＜0.05)Fig.3 Sciatic nerve function index of each group at 4,8 and 12 weeks after surgery (aP＜0.05)

4腓腸肌肌肉濕重恢復率 各組術側與健側腓腸肌大體觀對比圖(圖4)可見，單純PLA 組和PEGPLA 組術側肌肉萎縮嚴重，與健側差距明顯；PEGPLA 組術側與健側間差距接近ANG 組。腓腸肌肌肉濕重恢復率由高到低依次為ANG 組(51.08±8.68)%、PEG-PLA組(31.74±6.56)%、PLA組(18.96±2.75)%，各組間差異均有統計學意義(P＜0.05)(圖5 左)。

圖4 術后12 周大鼠腓腸肌大體觀Fig.4 Gross view of gastrocnemius muscle in rats at 12 weeks after surgery

5腓腸肌肌 纖維 橫截面積 Masson 染色 可見PLA 組術側腓腸肌肌纖維纖細，排列不規則，且紅染的肌纖維間有大量的藍染膠原纖維，橫截面積明顯小于其他兩組；PEG-PLA 組和ANG 組腓腸肌肌纖維形態排列較為規整，但PEG-PLA 組橫截面積小于ANG 組(圖6)。數據統計顯示各組腓腸肌肌纖維橫截面積由高到低依次為(圖5 右)。

圖5 腓腸肌濕重恢復率(左)和腓腸肌肌纖維橫截面積(右)(aP＜0.05；bP＜0.01)Fig.5 Gastrocnemius muscle wet weight ratio (left) and mean cross-sectional area of gastrocnemius muscle fiber (right) (aP＜0.05;bP＜0.01)

圖6 術后12 周大鼠腓腸肌肌肉橫截面Masson 染色Fig.6 Masson staining of cross section of gastrocnemius muscle in rats at 12 weeks after operation

6術后移植段神經組織免疫熒光染色 術后2 周移植段神經免疫熒光染色可見NF200 陽性的再生神經纖維被標記為綠色熒光，S100 陽性的施萬細胞被標記為紅色熒光。雖然兩組神經再生效果都低于ANG 組，但仍可見PEG-PLA 組的神經再生效果優于單純PLA 組。表明聚乙二醇改性聚乳酸神經導管改善了單純PLA 導管的神經修復效果(圖7)。術后12 周各組大鼠移植段中段端再生神經的橫斷面CD31/NF200 免疫熒光染色結果：NF200陽性的再生神經纖維被標記為紅色熒光，CD31 陽性的血管內皮細胞被標記為綠色熒光。PEGPLA 組的神經纖維密度以及血管內皮細胞的密度明顯高于PLA 組，接近ANG 組。其中，PEG-PLA組ANG 組的血管化程度接近，但三組再生神經纖維的數量卻有所不同，從高到低依次為ANG 組、PEG-PLA 組、PLA 組(圖8)。

圖7 術后2 周各組移植段再生神經的免疫熒光染色Fig.7 Results of immunofluorescence staining of regenerated nerve in each group at 2 weeks after surgery

圖8 術后12 周，各組移植段再生神經中段的免疫熒光染色結果。免疫熒光染色可見NF200 陽性的再生神經纖維被標記為紅色熒光，CD31 陽性的血管內皮細胞被標記為綠色熒光Fig.8 Immunofluorescence staining results of the middle segment of regenerated nerve in each group at 12 weeks after operation.Immunofluorescence staining showed that NF200-positive regenerated nerve fibers were marked with red fluorescence and CD31-positive vascular endothelial cells were labeled with green fluorescence

討論

隨著社會的發展，各類交通事故和建筑事故高發，使得周圍神經損傷在臨床上越來越普遍，周圍神經的再生速度緩慢，且損傷后效應器和感受器的功能迅速喪失，這種功能喪失往往會隨著神經損傷修復時間的延長而最終不可逆轉。周圍神經損傷一直是臨床上的“世界性難題”[13]。

周圍神經損傷發生后短時間內就會發生瓦勒氏變性，由于神經纖維的連續性被中斷，神經元軸突斷裂，血運循環障礙，導致損傷平面營養代謝障礙，損傷部位遠端神經纖維最終發生潰變[14]。同時施萬細胞經蛋白酶途徑降解髓鞘蛋白，神經纖維脫髓鞘，大量巨噬細胞通過血管聚集到神經損傷部位，與施萬細胞吞噬變性髓鞘的碎片，引發炎癥反應[15]。巨噬細胞在這一時期一方面由于吞噬作用產生了大量炎性因子，促進炎癥發生，另一方面分泌活性因子將促進施萬細胞的增殖，加快了早期變性髓鞘的清除[16]。另外神經損傷后血-神經屏障被破壞，神經相關性抗原經附近淋巴結產生特異性抗體，這些抗體最終進入血液循環引起免疫反應[17]。而炎癥反應和免疫反應在早期都不利于神經再生修復。

聚乳酸是目前周圍神經組織工程應用最廣泛的一種可降解材料[18]。但其親水性差，聚乙二醇是一種常見的醇類水凝膠材料，用聚乙二醇制備的水凝膠在有著良好的親水性和生物相容性[13]。

用聚乙二醇改性PLA 神經導管，改善PLA 神經導管的親水性，提高PLA 的生物相容性，有利于細胞表面黏附。PEG 水凝膠減少了PLA 的降解中間產物乳酸與神經再生微環境的接觸，維持了神經再生微環境的穩定。用聚乙二醇修飾材料可以減少材料對體內補體系統的活化，誘導抗原特異性免疫耐受同時聚乙二醇有穩定蛋白的作用[19]。聚乙二醇還有促進周圍神經損傷修復再生的潛力[20]。

本研究利用溶劑揮發法制備PLA 神經導管支架，并用聚乙二醇雙丙烯酸酯(PEGDA)通過化學交聯的方式在導管內壁形成PEG 水凝膠，構建聚乙二醇改性聚乳酸神經導管，并用其修復大鼠坐骨神經缺損。

本實驗結果表明，PEG-PLA 神經導管內壁質地疏松，具有取向性排列整齊的紋路和生物相容性。坐骨神經支配大腿后側以及整個小腿，因此坐骨神經損傷會引起大腿后側和小腿的肌肉萎縮，表現為大鼠足下垂和足趾變形，反映在足印上即足趾間距離減小、重心改變和足印延長[21-22]。術后大鼠運動功能評價中，PEG-PLA 組和ANG組大鼠足趾間距離減小、重心后移和足印延長的程度明顯低于PLA 組，提示PEG-PLA 組和運動功能恢復明顯優于PLA 組，接近ANG 組。PEGPLA 組坐骨神經功能指數雖高于和PLA 組，但差異無統計學意義(P＜0.05)。分析原因可能是神經導管由于不含有任何生物活性物質，如神經營養因子，而神經營養因子在調節各種細胞活動如細胞的增殖、分化、成熟等的過程中扮演了重要的角色[23]。而導管僅是神經再生的物理通道，所以其修復的效果并不令人滿意。PEG-PLA 組的移植段神經再生情況、腓腸肌肌肉濕重恢復率以及Masson 染色等結果均明顯優于PLA 神經導管組，更接近自體神經移植的修復效果。各組步態分析結果、SFI、腓腸肌濕重恢復率、移植段神經再生情況以及Masson 染色結果均接近同類研究。

綜上所述，我們認為PEG-PLA 神經導管具有良好的組織相容性，是一種較為理想的神經導管。在今后的實驗中我們將以PEG-PLA 導管負載神經營養因子并修復大鼠坐骨神經缺損。