基于多元統計分析的紅芪蜜炙前后成分差異研究

牛江濤，曹瑞，司昕蕾，張育貴，張淑娟，李越峰

中藥研究與開發

基于多元統計分析的紅芪蜜炙前后成分差異研究

牛江濤1，2，曹瑞1，2，司昕蕾1，2，張育貴1，2，張淑娟1，2，李越峰1，2

1.甘肅中醫藥大學藥學院，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省中藥質量與標準研究重點實驗室，甘肅 蘭州 730000

比較紅芪蜜炙前后化學成分差異，分析其差異標志物，為紅芪蜜炙炮制機理及紅芪與炙紅芪質量標準研究提供參考。采用HPLC建立紅芪與炙紅芪樣品指紋圖譜，并測定香草酸、毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素含量；采用SIMCA14.1軟件對紅芪與炙紅芪各10批樣品共有峰峰面積數據進行主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）。紅芪和炙紅芪指紋圖譜有19個共有峰，20、21號峰為紅芪蜜炙后出現的色譜峰。炙紅芪中毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷和香草酸含量均顯著降低（＜0.01），分別降低48.00%、21.74%和48.24%；毛蕊異黃酮和芒柄花素含量均顯著上升（＜0.01），分別上升34.18%和17.49%。多元統計分析結果顯示，紅芪蜜炙前后化學成分存在顯著差異，毛蕊異黃酮苷、芒柄花素、香草酸、毛蕊異黃酮及芒柄花苷為其差異主要指標性成分。紅芪與炙紅芪成分差異顯著，紅芪蜜炙后產生了新的成分，毛蕊異黃酮苷、芒柄花素、香草酸、毛蕊異黃酮及芒柄花苷可作為二者的差異標志物。

紅芪；炙紅芪；多元統計分析；含量測定；差異分析

紅芪始載于《本草經集注》，為豆科植物多序巖黃芪Hand. -Mazz.的干燥根，具有補氣升陽、固表止汗、利水消腫等功效[1-2]。紅芪為甘肅道地藥材，在甘肅武都、宕昌、岷縣、舟曲、臨潭、漳縣、西和、禮縣、武山等地有較廣分布。炙紅芪為紅芪的蜜炙炮制加工品，主要具有補中益氣功效[1]。2020年版《中華人民共和國藥典》顯示紅芪與炙紅芪主要功效存在差異，但二者質量控制均無指標性成分含量測定。目前對紅芪成分已有一定研究[3-4]，但紅芪炮制前后成分差異及炮制機理相關報道較少。本研究基于多元統計分析方法，深入比較紅芪蜜炙前后化學成分差異，分析其差異標志物，為促進紅芪與炙紅芪質量標準研究并揭示其炮制機理提供依據。

1 儀器與試藥

Agilent 1260高效液相色譜儀，美國Agilent公司；101-2A型電熱鼓風干燥箱，天津市泰斯特儀器有限公司；AL104萬分之一分析天平，上海梅特勒-托利多儀器有限公司；BT125D十萬分之一分析天平，北京賽多利斯科學儀器有限公司；HHS11S電熱恒溫水浴鍋，余姚市上通溫控儀器廠。

對照品毛蕊異黃酮（批號150629）、毛蕊異黃酮苷（批號PS000687）、芒柄花素（批號150629）、芒柄花苷（批號PS000672）、香草酸（批號PS010559），HPLC純度≥98%，成都普思生物科技股份有限公司。甲醇（色譜級，批號20160305）、乙腈（色譜級，批號20151201）、磷酸（色譜級，批號20150707），天津大茂化學試劑廠。蜂蜜，周氏順發食品有限責任公司。紅芪藥材樣品采自甘肅省隴南市武都區米倉山，經甘肅中醫藥大學藥學院中藥鑒定教研室王明偉副教授鑒定為豆科植物多序巖黃芪Hand. -Mazz.的干燥根。

2 方法與結果

2.1 紅芪飲片制備

將紅芪藥材抖去泥土，快速沖洗干凈，稍晾，趁鮮切成厚片（0.2～0.4 cm），在陰涼通風干燥處陰干，備用。

2.2 炙紅芪樣品制備

取一定量紅芪飲片，加沸蒸餾水稀釋過的煉蜜悶潤1 h，每100 g紅芪用煉蜜25 g，水為蜜的20%。設定烘箱溫度70 ℃，烘制時間2.5 h，飲片鋪設厚度3 cm。烘制完成后，取出放涼，備用[5]。

2.3 含量測定

2.3.1 供試品溶液制備

采用四分法分別取紅芪和炙紅芪飲片適量，粉碎（過20目篩），粉末60 ℃干燥至恒重。精密稱取紅芪和炙紅芪樣品粉末各3.000 0 g，置150 mL錐形瓶中，加入甲醇30 mL，于75 ℃水浴加熱回流提取1 h，過濾，濾液減壓濃縮后，定容至10 mL容量瓶，備用[6]。

2.3.2 對照品溶液制備

分別精密稱取香草酸、毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素對照品4.93、5.13、5.47、5.16、4.71 mg，加甲醇超聲溶解，定容于5 mL容量瓶中，分別制成各對照品貯備液。分別取上述對照品貯備液各1 mL，定容至10 mL容量瓶中，制成混合對照品溶液，備用。

2.3.3 色譜條件

采用Agilent HC-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為乙腈-0.01%磷酸水溶液，梯度洗脫（0～5 min，乙腈2%～5%；5～20 min，乙腈5%～16%；20～35 min，乙腈16%～18%；35～36 min，乙腈18%～30%；36～66 min，乙腈30%～60%；66～80 min，乙腈60%～90%），流速1.0 mL/min，檢測波長280 nm，柱溫30 ℃，進樣量10 μL。在此色譜條件下，色譜峰分離度良好。

2.3.4 線性關系考察

分別精密移取“2.3.2”項下香草酸、毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素對照品貯備液，加甲醇逐級稀釋成不同濃度對照品溶液，按“2.3.3”項下色譜條件進樣測定，以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程。結果表明，各對照品在相應范圍內線性關系良好，見表1。

表1 5種成分線關系考察結果

成分回歸方程相關系數線性范圍/μg 香草酸Y＝15 372X＋53.9910.999 80.076 0～0.296 0 毛蕊異黃酮苷Y＝20 914X－82.960.999 70.174 4～0.513 0 芒柄花苷Y＝18 320X＋0.6130.999 70.064 0～0.765 8 毛蕊異黃酮Y＝29 230X－0.680 60.999 80.092 8～0.309 6 芒柄花素Y＝25 371X－5.514 90.999 90.113 0～0.423 9

2.3.5 精密度試驗

精密吸取“2.3.2”項下混合對照品溶液1 mL，按“2.3.3”項下色譜條件，重復進樣6次，測定各成分峰面積并計算RSD。結果香草酸、毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素色譜峰峰面積RSD分別為0.46%、0.82%、1.02%、0.68%、1.42%，表明精密度良好。

2.3.6 穩定性試驗

取紅芪同一供試品溶液，于4 ℃放置保存，分別于0、6、14、20、32 h進樣，測定各成分峰面積并計算RSD。結果香草酸、毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素色譜峰峰面積RSD分別為0.79%、1.15%、1.07%、1.24%、1.76%，表明供試品溶液于4 ℃放置32 h內基本穩定。

2.3.7 重復性試驗

精密稱取炙紅芪樣品6份，按“2.3.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.3.3”項下色譜條件進樣測定，計算各成分含量。結果香草酸、毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素的平均含量分別為20.40、52.21、90.05、79.20、144.96 μg/g，RSD分別為1.67%、2.05%、2.48%、2.33%、1.27%，表明方法重復性較好。

2.3.8 加樣回收率試驗

精密稱取已知待測成分含量的同一炙紅芪樣品6份，每份約1.000 0 g，按待測成分含量1∶1比例分別精密加入香草酸、毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素對照品，按“2.3.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.3.3”項下色譜條件進樣測定，計算各成分加樣回收率，結果香草酸、毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素平均加樣回收率分別為98.02%、96.58%、97.44%、97.24%、96.37%，RSD分別為1.96%、2.13%、2.26%、1.66%、2.05%，見表2。

2.3.9 樣品測定

精密稱取紅芪和炙紅芪樣品各10批，按“2.3.1”項下方法分別制備供試品溶液，按“2.3.3”項下方法進樣，測定各共有峰峰面積，計算香草酸、毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素的含量，結果見表3。對照品色譜圖見圖1，紅芪和炙紅芪供試品色譜圖見圖2。

紅芪蜜炙后，毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷和香草酸含量均顯著降低（＜0.01），分別降低48.00%、21.74%和48.24%；毛蕊異黃酮和芒柄花素含量均顯著上升（＜0.01），分別上升34.18%和17.49%。

表2 炙紅芪中5種成分加樣回收率試驗結果

成分取樣量 /g樣品中含量/μg加入量 /μg測得量 /μg回收率 /%平均回收率/%RSD /% 香草酸1.000 420.4120.30 38.62 94.87 98.021.96 1.000 320.4120.30 39.67 97.45 1.000 320.4120.30 39.73 97.60 1.000 120.4020.30 39.88 97.98 1.000 120.4020.30 40.78 100.19 1.000 320.4120.30 40.72 100.03 毛蕊異 黃酮苷1.000 452.2352.21 100.28 96.02 96.582.13 1.000 352.2352.21 99.37 95.15 1.000 352.2352.21 102.18 97.84 1.000 152.2252.21 104.36 99.94 1.000 152.2252.21 98.02 93.87 1.000 352.2352.21 100.93 96.64 芒柄花苷1.000 490.0990.10 180.13 99.97 97.442.26 1.000 390.0890.10 176.05 97.71 1.000 390.0890.10 168.62 93.59 1.000 190.0690.10 173.32 96.20 1.000 190.0690.10 177.08 98.29 1.000 390.0890.10 178.13 98.86 毛蕊異 黃酮1.000 479.1079.06 155.03 98.02 97.241.66 1.000 379.0979.06 149.96 94.82 1.000 379.0979.06 156.48 98.94 1.000 179.0879.06 153.07 96.80 1.000 179.0879.06 151.79 95.99 1.000 379.0979.06 156.35 98.86 芒柄花素1.000 4144.90144.80 275.30 95.03 96.372.05 1.000 3144.88144.80 282.31 97.45 1.000 3144.88144.80 288.87 99.72 1.000 1144.85144.80 272.54 94.09 1.000 1144.85144.80 275.61 95.15 1.000 3144.88144.80 280.26 96.75

表3 紅芪和炙紅芪中5種成分含量測定結果（±s，μg/g，n＝10）

注：與紅芪比較，**＜0.01

注：a.香草酸；b.毛蕊異黃酮苷；c.芒柄花苷；d.毛蕊異黃酮；e.芒柄花素

注：12.香草酸；13.毛蕊異黃酮苷；15.芒柄花苷；16.毛蕊異黃酮；17.芒柄花素

2.4 多元統計分析

采用SIMCA14.1軟件對紅芪與炙紅芪各10批樣品中共有峰峰面積數據進行多維變量統計分析。

2.4.1 主成分分析

主成分分析（PCA）主要反映組內聚集和組間分離趨勢[7]。紅芪和炙紅芪的PCA得分圖（見圖3）顯示，炙紅芪與紅芪明顯分為兩類，組內出現明顯聚集。

圖3 紅芪和炙紅芪PCA得分圖

2.4.2 正交偏最小二乘判別分析

采用正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）進一步分析紅芪與炙紅芪差異。紅芪和炙紅芪OPLS-DA得分圖（見圖4）顯示，紅芪和炙紅芪均表現出明顯的聚類，且組間分離更加明顯，表明紅芪與炙紅芪化學成分有顯著差異。

對所建立的OPLS-DA模型進行驗證，通過置換測試以檢查其過度擬合。R2和Q2分別表示累積的自變量X對Y的解釋能力和模型的預測能力，理論上兩者數值越接近1表明模型擬合越好。本研究建立的OPLS-DA模型R2和Q2分別為0.993 5和0.991 1。Q2截距＜0，且R2和Q2與橫坐標的交點均小于0.5，兩者與縱坐標的交點均小于1（見圖5），表明該模型未過度擬合，且預測能力較好。

圖4 紅芪和炙紅芪OPLS-DA得分圖

圖5 紅芪和炙紅芪OPLS-DA模型檢驗圖

進一步以變量重要性投影（VIP）＞1為標準，篩選出紅芪與炙紅芪主要差異色譜峰。21、20、13（毛蕊異黃酮苷）、14、7、17（芒柄花素）、12（香草酸）、16（毛蕊異黃酮）、5、11、2、15（芒柄花苷）、10、8號峰為二者差異的主要指標性成分。其中，21、20號峰為紅芪蜜炙后新生成的色譜峰（見圖6）。

圖6 紅芪與炙紅芪差異成分VIP圖

3 討論

本研究結果顯示，紅芪與炙紅芪成分差異顯著。多元統計分析結果表明，21、20、13（毛蕊異黃酮苷）、14、7、17（芒柄花素）、12（香草酸）、16（毛蕊異黃酮）、5、11、2、15（芒柄花苷）、10、8號峰為其差異主要指標性成分。含量測定結果顯示，與紅芪相比，炙紅芪中毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷及香草酸含量均顯著降低，而毛蕊異黃酮和芒柄花素含量均顯著上升。毛蕊異黃酮苷和芒柄花苷均為黃酮苷類，其苷鍵易受熱斷裂而生成游離黃酮和糖基。紅芪中毛蕊異黃酮苷和芒柄花苷在蜜炙過程中可能部分受熱分解成毛蕊異黃酮和芒柄花素，從而使炙紅芪中這2種游離黃酮含量升高。

毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮苷、芒柄花素和芒柄花苷均具有抗氧化、神經保護、抗菌、抗癌等作用[8-12]。香草酸是一種酚酸類化合物，具有抗氧化、抗炎、抗血栓、抗細胞凋亡及抑制感染性結石形成等多種藥理作用[13-17]。上述5種成分是紅芪和炙紅芪的主要活性成分，也是紅芪與炙紅芪的差異標志物。鑒于2020年版《中華人民共和國藥典》未明確紅芪與炙紅芪質量控制的指標性成分，因此，可以考慮選取上述5種成分作為紅芪與炙紅芪質量控制的指標性成分。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[M].北京：中國醫藥科技出版社,2020：159.

[2] 白海英,張凱雪,包芳,等.黃芪和紅芪對比研究進展[J].西北藥學雜志,2020,35(3)：460-466.

[3] 李越峰,牛江濤,曹瑞,等.不同干燥工藝對紅芪中紅芪多糖含量的影響研究[J].時珍國醫國藥,2019,30(1)：92-94.

[4] 柳小亞,李繼平,陳心悅,等.HPLC同時測定紅芪中8個活性成分的含量及聚類分析[J].藥學學報,2016,51(5)：786-791.

[5] 李越峰,牛江濤,曹瑞,等.正交設計法優選紅芪最佳蜜炙烘制工藝[J].北京中醫藥大學學報,2017,40(2)：166-171.

[6] 牛江濤,曹瑞,邊甜甜,等.紅芪與炙紅芪補中益氣作用對比及成分差異分析[J].中草藥,2019,50(13)：3107-3112.

[7] 吳喆,張霽,左智天,等.紅外光譜結合化學計量學快速鑒別云南重樓不同炮制品[J].光譜學與光譜分析,2018,38(4)：1101-1106.

[8] 張鑫,楊英杰,呂慶章.黃芪異黃酮類化合物抗氧化活性的密度泛函理論研究[J].化學研究與應用,2012,24(11)：1662-1669.

[9] 吳丘玲.黃芪四個異黃酮類化合物促進神經功能恢復的作用及其機制研究[D].福州：福建中醫藥大學,2020.

[10] LIU X, SUN X, DENG X, et al. Calycosin enhances the bactericidal efficacy of polymyxin B by inhibiting MCR-1 in vitro[J]. Journal of Applied Microbiology,2020,129(3)：532-540.

[11] 王維,張路陽,趙子龍,等.毛蕊異黃酮抑制膠質瘤細胞增殖的機制研究[J].沈陽藥科大學學報,2020,37(8)：725-729,755.

[12] 賈紹華,劉麗娜,顏廷華.芒柄花素誘導人乳腺癌MCF-7細胞凋亡及其氧化應激的機制[J].華西藥學雜志,2020,35(4)：385-391.

[13] SIDDIQUI S, KAMAL A, KHAN F, et al. Gallic and vanillic acid suppress inflammation and promote myelination in an in vitro mouse model of neurodegeneration[J]. Molecular Biology Reports,2019, 46(1)：997-1011.

[14] KHOSHNAM S E, SARKAKI A, KHORSANDI L, et al. Vanillic acid attenuates effects of transient bilateral common carotid occlusion and reperfusion in rats[J]. Biomedicine & Pharmacotherapy, 2017,96：667-674.

[15] 孔令雷,王海港,劉成娣,等.香草酸抗血小板聚集作用的體內外研究[J].中國藥物警戒,2020,17(6)：342-347.

[16] KHOSHNAM S E, FARBOOD Y, MOGHADDAM H F, et al. Vanillic acid attenuates cerebral hyperemia, blood-brain barrier disruption and anxiety-like behaviors in rats following transient bilateral common carotid occlusion and reperfusion[J]. Metabolic Brain Disease,2018,33(3)：785-793.

[17] 關帥.香草酸抑制泌尿系感染性結石形成的實驗研究[D].太原：山西醫科大學,2020.

Study on Composition Difference of Hedysari Radix Before and After Honey-processing Based on Multiple Statistical Analysis

NIU Jiangtao1,2, CAO Rui1,2, SI Xinlei1,2, ZHANG Yugui1,2, ZHANG Shujuan1,2, LI Yuefeng1,2

To compare the chemical composition difference of Hedysari Radix before and after honey-processing; To analyze the difference markers; To provide reference for research on processing mechanism of honey-processing Hedysari Radix and the quality standards of Hedysari Radix and honey-processing Hedysari Radix.The fingerprints of samples of Hedysari Radix and honey-processing Hedysari Radix were established by HPLC, and the contents of vanillic acid, calycosin-7-O-beta-D-glucoside, ononin, calycosin, formononetin were determined. SIMCA 14.1 software was used to perform principal component analysis (PCA) and orthogonal partial least squares-discriminant analysis (OPLS-DA) for the common peak area data of 10 batches of samples of Hedysari Radix and honey-processing Hedysari Radix.There were 19 common peaks in the fingerprints of Hedysari Radix and honey-processing Hedysari Radix, and peaks 20 and 21 were new chromatographic peaks of honey- processing Hedysari Radix. In honey-processing Hedysari Radix, the contents of calycosin-7-O-beta-D-glucoside, ononin, and vanillic acid were significantly reduced (<0.01), and decreased by 48.00%, 21.74% and 48.24%, respectively; the contents of calycosin and formononetin significantly increased (<0.01), and increased by 34.18% and 17.49% respectively. The results of multivariate statistical analysis showed that there were significant differences in the chemical components of Hedysari Radix before and after honey-processing, and calycosin-7-O-beta-D-glucoside, formononetin, vanillic acid, calycosin and ononin were the main indicators of the difference.There is a significant difference in composition between Hedysari Radix and honey-processing Hedysari Radix. Hedysari Radix produces new components after honey-processing. Calycosin-7-O-beta-D-glucoside, formononetin, vanillic acid, calycosin and ononin can be used as the indicators of difference between the two.

Hedysari Radix; honey-processing Hedysari Radix; multivariate statistical analysis; content determination; difference analysis

R284.1

A

1005-5304(2021)08-0093-05

10.19879/j.cnki.1005-5304.202010217

國家自然科學基金（81960713）；甘肅省中藥質量與標準研究重點實驗室開放基金（ZYZL18-008）

李越峰，E-mail：lyfyxk@126.com

（收稿日期：2020-10-16）

（修回日期：2020-12-07；編輯：陳靜）