右歸丸對腎陽虛證大鼠腎臟線粒體功能的影響

張巍嵐，譚從娥

右歸丸對腎陽虛證大鼠腎臟線粒體功能的影響

張巍嵐，譚從娥

陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽 712046

觀察右歸丸對腎陽虛證大鼠腎臟線粒體功能的影響，探討其調(diào)節(jié)能量代謝的作用機制。30只SD大鼠隨機分為正常組（6只）和造模組（24只），造模組后肢肌注氫化可的松注射液，正常組注射2 mL生理鹽水。成模后將造模組隨機分為模型組和右歸丸高、中、低劑量組，每組6只。右歸丸高、中、低劑量組給予相應(yīng)劑量湯劑灌胃，正常組和模型組給予生理鹽水灌胃。透射電鏡觀察腎臟線粒體超微結(jié)構(gòu)，試劑盒檢測線粒體三磷酸腺苷（ATP）含量，JC-1熒光探針檢測線粒體膜電位，DCFH-DA法檢測細胞內(nèi)活性氧（ROS）水平。與正常組比較，模型組大鼠腎臟線粒體明顯腫脹，部分出現(xiàn)空泡，線粒體嵴排列不規(guī)則，基質(zhì)不均勻，核膜不明顯，線粒體ATP含量減少、膜電位下降，細胞內(nèi)ROS水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.01）；與模型組比較，右歸丸各劑量組大鼠腎臟線粒體結(jié)構(gòu)均有改善，線粒體腫脹減輕，線粒體嵴排列較規(guī)則，基質(zhì)均勻，核膜清晰，線粒體ATP含量增加、膜電位升高，細胞內(nèi)ROS水平降低，其中右歸丸高劑量組作用明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.01）。右歸丸通過改善大鼠線粒體功能調(diào)節(jié)能量代謝異常。

右歸丸；腎陽虛證；線粒體功能；大鼠

右歸丸具有補腎填精、溫陽化氣功效，可有效改善腎陽虛引發(fā)的代謝低下癥狀。現(xiàn)代藥理研究表明，右歸丸可降低大鼠血清三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）含量，提高高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）含量，糾正老年大鼠海馬和杏仁核氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)紊亂狀態(tài)，改善大腦邊緣系統(tǒng)，提高腎陽虛大鼠睪酮含量[1-3]。線粒體通過產(chǎn)生三磷酸腺苷（ATP）為機體提供能量，腎臟作為維持機體內(nèi)環(huán)境平衡的重要器官，需要足夠的能量維持機體新陳代謝及營養(yǎng)物質(zhì)的再吸收[4]。本實驗從能量代謝角度，通過不同劑量右歸丸干預(yù)腎陽虛證大鼠，探討其對大鼠腎臟線粒體功能的調(diào)節(jié)作用，為腎陽虛證的臨床治療提供思路。

1 實驗材料

1.1 動物

清潔級SD雄性大鼠30只，體質(zhì)量200～230 g，四川成都達碩實驗動物有限公司提供，動物許可證號SYXK（111）2015-030。飼養(yǎng)于陜西中醫(yī)藥大學(xué)實驗研究中心動物房，正常光照，溫度25～27 ℃，濕度適宜，自由攝食飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2 藥物及制備

右歸丸，北京同仁堂股份有限公司，9 g/丸，批號19013092，稱取不同質(zhì)量右歸丸，分別放入3個燒杯中，45 ℃溫水融化至無沉淀，即得右歸丸湯劑。氫化可的松注射液，華中藥業(yè)股份有限公司，批號2018190108；氯化鈉注射液，灝洋生物技術(shù)有限公司，批號1905190728。

1.3 主要試劑與儀器

蘇木素，德國Sigma公司，貨號H9627；伊紅Y（水溶性）、無水乙醇、二甲苯、鹽酸、包埋石蠟、中性樹膠，國藥集團，貨號分別為71014544、10009218、10023418、10011018、69019361、10004160； ATP含量測定試劑盒，南京建成生物工程研究所，貨號A095；JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒，上海碧云天，貨號C2006；活性氧（ROS）檢測試劑盒，貨號E004-1-1；PBS，武漢普諾賽，貨號PB180327。微型高速離心機（美國Labnet，C2500-R-230V），電熱恒溫培養(yǎng)箱（日本ASONE，ICV-450），病理切片機（德國Leica，RM 2016），切片刀（日本羽毛，R3），組織攤烤片機（武漢俊杰，JK-6），F(xiàn)lexStation 3多功能酶標儀（美國Molecular Devices公司），多功能電熱鍋（廣州飛普納，CRJ-130D-1），臺式冷凍高速離心機（湖南湘儀，H1650R），微量移液器（美國Thermo Fisher），超凈工作臺（蘇州安泰，SW-CJ-1FD），CO2恒溫培養(yǎng)箱（日本SANYO，MCO-15AC），臺式低速離心機（德國Eppendorf，5702R），BD FACSCalibur流式細胞儀（美國BD Biosciences）。

2 實驗方法

2.1 分組、造模及給藥

實驗大鼠隨機分為正常組（6只）、造模組（24只）。參考文獻[5]方法，造模組大鼠每日后肢肌肉注射氫化可的松注射液（2.5 mg/100 g）制備腎陽虛證模型，正常組每日注射2 mL生理鹽水，連續(xù)14 d。成模后將造模組大鼠隨機分為模型組和右歸丸高、中、低劑量組，每組6只。給藥劑量根據(jù)人和大鼠用藥比例換算[6]。右歸丸高、中、低劑量組每日13:00－14:00分別予9.5、3.8、1.9 g/kg右歸丸湯劑灌胃，給藥體積3 mL，連續(xù)14 d，正常組和模型組給予生理鹽水灌胃（10 mL/kg）。由于部分大鼠對激素耐受性較差，模型組和各給藥組均有大鼠死亡，每組最終為3只。

2.2 一般觀察

記錄大鼠精神狀態(tài)、毛色、食量、飲水量、小便顏色、大便性狀、舌色、耳廓絡(luò)脈顏色等。

2.3 取材

第14日干預(yù)結(jié)束后，大鼠空腹過夜，次日上午10%水合氯醛（35 mg/kg）腹腔注射麻醉，置于冰盤，迅速取大鼠腎臟，分離腎皮質(zhì)，PBS反復(fù)沖洗，置于凍存管，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 線粒體超微結(jié)構(gòu)觀察

取1 mm3大鼠腎臟，2.5%戊二醛固定液固定4 h，PBS浸洗2 h，1%四氧化鋨固定液固定2 h，梯度乙醇脫水，浸透，包埋，切片（1～2 μm），亞甲藍染色，鏡下定位，切片（50～70 nm），醋酸鈾和檸檬酸鉛雙染，透射電鏡觀察大鼠腎臟線粒體超微結(jié)構(gòu)并拍片。

2.5 線粒體三磷酸腺苷含量測定

取大鼠腎皮質(zhì)，用預(yù)冷生理鹽水清洗，按1∶4.5（質(zhì)量∶體積）比例加預(yù)冷的0.25 mol/L蔗糖緩沖液，勻漿，4 ℃、1 000×離心10 min，吸取上清液，4 ℃、10 000×離心10 min，棄上清液，BCA法測定線粒體蛋白濃度。將ATP含量測定試劑平衡至室溫，按100 μL/孔加至96孔板，加線粒體上清液50 μL，震蕩30 s，室溫靜置5 min，于波長636 nm處測定各孔吸光度（OD值），根據(jù)樣品蛋白濃度和各孔OD值計算線粒體ATP含量[（測定OD值－對照OD值）÷（標準OD值－空白OD值）×標準品濃度×樣本稀釋倍數(shù)÷待測樣本蛋白濃度]。

2.6 線粒體膜電位測定

取大鼠腎皮質(zhì)，剪成小塊，磨碎，過300目篩網(wǎng)，生理鹽水沖洗，將細胞移至15 mL離心管，離心，棄上清液，加入JC-1熒光探針染液，流式細胞儀進行檢測[7]。以紅綠熒光強度比值計算線粒體膜電位。

2.7 細胞內(nèi)活性氧水平檢測

取大鼠腎皮質(zhì)，剪成小塊，磨碎，過300目篩網(wǎng)，生理鹽水沖洗，將細胞轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，反復(fù)離心去上清，收集細胞，使用DCFH-DA細胞ROS檢測試劑盒經(jīng)流式細胞儀檢測細胞內(nèi)ROS水平。

3 統(tǒng)計學(xué)方法

4 結(jié)果

4.1 一般狀況

與正常組比較，造模組大鼠1周時食量稍減少，飲水量正常，反應(yīng)較遲鈍，毛色黯淡，耳廓顏色蒼白，舌色淡紅，二便正常，2周時食量明顯減少，飲水量增多，反應(yīng)遲鈍，弓背明顯，毛色黯淡無光，耳廓絡(luò)脈蒼白，舌色紫黯，小便增多，大便稀溏；右歸丸干預(yù)后上述情況改善，且右歸丸高劑量組恢復(fù)較明顯。

4.2 右歸丸對模型大鼠線粒體超微結(jié)構(gòu)的影響

正常組大鼠腎臟線粒體超微結(jié)構(gòu)完整，線粒體嵴排列清晰，數(shù)量較多，基質(zhì)均勻，線粒體內(nèi)無水腫、空泡，內(nèi)外膜結(jié)構(gòu)清晰；模型組大鼠腎臟線粒體明顯腫脹，部分出現(xiàn)空泡，線粒體嵴排列不規(guī)則，甚至消失，基質(zhì)不均勻，核膜不明顯；右歸丸各劑量組大鼠腎臟線粒體結(jié)構(gòu)有不同程度改善，其中右歸丸高劑量組改善最明顯。見圖1。

圖1 各組大鼠腎臟線粒體超微結(jié)構(gòu)（×8 000）

4.3 右歸丸對模型大鼠線粒體三磷酸腺苷含量的影響

與正常組比較，模型組大鼠腎皮質(zhì)線粒體ATP含量明顯減少（＜0.01）；與模型組比較，右歸丸各劑量組大鼠腎皮質(zhì)線粒體ATP含量增加，其中右歸丸高劑量組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.01）。見表1。

4.4 右歸丸對模型大鼠線粒體膜電位的影響

當(dāng)線粒體膜電位較高時，JC-1聚集在線粒體基質(zhì)中，形成聚合物，呈紅色熒光，圖中右上象限（UR）表示；當(dāng)線粒體膜電位較低時，JC-1不能聚集在線粒體基質(zhì)中，此時JC-1為單體，形成綠色熒光，圖中右下象限（LR）表示。與正常組比較，模型組大鼠LR值增加，UR值減少，提示JC-1單體增多，綠色熒光增強，線粒體膜電位明顯降低（＜0.01）；與模型組比較，右歸丸各劑量組LR值減少，UR值增加，其中右歸丸高劑量組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.01）。見圖2、表2。

表1 各組大鼠腎皮質(zhì)線粒體ATP含量比較（±s，μmol/g）

注：與正常組比較，##＜0.01；與模型組比較，**＜0.01

圖2 各組大鼠腎皮質(zhì)線粒體膜電位流式細胞圖

表2 各組大鼠腎皮質(zhì)線粒體膜電位變化比較（±s）

注：與正常組比較，**＜0.01；與模型組比較，##＜0.01

4.5 右歸丸對模型大鼠腎皮質(zhì)活性氧水平的影響

正常組大鼠曲線位置偏左，DCFH-DA-A均值為36 016.40，count值接近280，波形高尖。模型組大鼠曲線位置居中，DCFH-DA-A均值為99 930.60，count值接近240，波形較正常組低平。右歸丸低、中、高劑量組大鼠隨劑量增加，DCFH-DA-A均值依次降低，count值逐漸增加，波形趨于高尖，見圖3。與正常組比較，模型組大鼠腎皮質(zhì)ROS熒光強度增強（＜0.01），表明ROS水平升高，細胞凋亡明顯；與模型組比較，右歸丸各劑量組大鼠腎皮質(zhì)ROS水平降低，其中右歸丸高劑量組作用最明顯（＜0.01）。見表3。

圖3 各組大鼠細胞內(nèi)ROS流式細胞圖

表3 各組大鼠腎皮質(zhì)細胞內(nèi)ROS水平比較（±s）

注：與正常組比較，##＜0.01；與模型組比較，**＜0.01

5 討論

中醫(yī)認為，腎主藏精，主生殖，推動和調(diào)節(jié)臟腑的氣化功能。腎精化腎氣，腎中精氣化為腎陰腎陽，其中，腎陽通過溫煦、激發(fā)、氣化等功能為身體提供能量，若腎陽虧虛，則機體表現(xiàn)出一系列能量代謝低下癥狀。以右歸丸為代表的溫補腎陽方劑可通過補腎助陽、溫陽化氣作用改善機體代謝狀態(tài)。線粒體為真核生物有氧呼吸的主要場所，機體通過丙酮酸無氧呼吸、乙酰輔酶A氧化、呼吸鏈運輸、氧化磷酸化等環(huán)節(jié)，最終生成ATP，為細胞提供生長代謝所需能量。因此，通過對線粒體結(jié)構(gòu)觀察及內(nèi)部物質(zhì)的測定可反映機體能量代謝狀態(tài)。邱林等[8]研究發(fā)現(xiàn)，腎氣丸能上調(diào)腎陽虛證大鼠肝細胞內(nèi)磷酸果糖激酶、乳酸脫氫酶、丙酮酸激酶、己糖激酶等酶活性，從而增加線粒體能量合成。咸慶飛等[9]研究發(fā)現(xiàn)，線粒體能量代謝障礙是（脾）腎陽虛證艾滋病中晚期患者的病理基礎(chǔ)。本實驗通過氫化可的松肌肉注射建立腎陽虛證大鼠模型，發(fā)現(xiàn)模型大鼠腎臟線粒體腫脹明顯，部分出現(xiàn)空泡，線粒體嵴排列不規(guī)則，基質(zhì)不均勻，核膜不明顯，ATP含量明顯減少，線粒體膜電位下降，細胞內(nèi)ROS水平升高，表明腎陽虛證大鼠線粒體功能異常。右歸丸干預(yù)后大鼠腎臟線粒體超微結(jié)構(gòu)有所改善，ATP含量明顯增加，線粒體膜電位升高，細胞內(nèi)ROS水平明顯降低，其中，右歸丸高劑量組作用最明顯（＜0.01），提示右歸丸能改善腎陽虛證大鼠腎臟線粒體功能，調(diào)節(jié)能量代謝異常。

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[9] 咸慶飛,劉穎,鄒雯,等.溫腎健脾法對艾滋病中晚期患者能量代謝的影響探討[J].中華中醫(yī)藥雜志,2018,33(3)：939-941.

Effects ofPills on the Function of Kidney Mitochondria in Rats with Kidney-yang Deficiency Syndrome

ZHANG Weilan, TAN Conge

To observe the effects ofPills on the function of kidney mitochondria in rats with kidney-yang deficiency; To explore its mechanism of action of energy metabolism.Thirty SD rats were randomly divided into normal group (6 rats) and model group (24 rats). The model group was injected with hydrocortisone injection into the hindlimb muscle, while the normal group was injected with 2 mL normal saline. After the successful modeling, they were divided into the model group,Pills high-, medium-, and low-dosage groups, with 6 rats in each group.Pills high-, medium-, and low-dosage groups were given corresponding dosages of decoction for gavage, and the normal group and model group were given normal saline for gavage. The ultrastructure of kiney mitochondria was observed with transmission electron microscope; the kit was used to detect the mitochondrial adenosine triphosphate (ATP) content; the JC-1 fluorescent probe was used to detect the mitochondrial membrane potential; the DCFH-DA method was used to detect the intracellular reactive oxygen species (ROS) level.Compared with the normal group, the mitochondria of the kidneys of the model group were obviously swollen, some vacuoles appeared, the mitochondrial cristae were arranged irregularly, the matrix was uneven, and the nuclear membrane was not obvious; mitochondrial ATP content decreased significantly, membrane potential decreased, and intracellular ROS level increased, with statistical significance (<0.01). Compared with the model group, the mitochondrial structure of kidney rats inPills groups was improved, the swelling of mitochondria was reduced, the mitochondrial cristae arrangement was more regular, the matrix was uniform, and the nuclear membrane was clear; rat mitochondrial ATP content increased, membrane potential increased, and intracellular ROS level decreased. Among them,Pills high-dosage group had a significant effect, with statistical significance (<0.01).Pills can improve rat mitochondrial function and regulate abnormal energy metabolism.

Pills; kidney-yang deficiency syndrome; mitochondrial function; rats

R285.5

A

1005-5304(2021)08-0073-04

10.19879/j.cnki.1005-5304.202008073

國家自然科學(xué)基金（81973754）

譚從娥，E-mail：tanzime@163.com

（收稿日期：2020-08-05）

（修回日期：2020-09-01；編輯：華強）