基于16S rDNA技術分析化瘀溫膽湯對糖耐量受損大鼠腸道菌群的影響

田苗，周迎春，孫丹，李衛忠，樊德慧，韓宇博，劉莉，張福利

基于16S rDNA技術分析化瘀溫膽湯對糖耐量受損大鼠腸道菌群的影響

田苗1，周迎春1，孫丹2，李衛忠1，樊德慧1，韓宇博2，劉莉2，張福利1

1.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040； 2.黑龍江中藥大學附屬第一醫院，黑龍江 哈爾濱 150040

基于16S rDNA技術分析糖耐量受損（IGT）大鼠腸道菌群結構特征，初步探討化瘀溫膽湯可能的干預機制。70只雄性SD大鼠中隨機抽取10只作為空白組，其余60只予高脂高糖飼料喂養21周構建IGT大鼠模型，抽取30只IGT模型大鼠隨機分為模型組、化瘀溫膽湯組和二甲雙胍組，每組10只。化瘀溫膽湯組給予中藥水煎劑灌胃，二甲雙胍組給予二甲雙胍懸濁液灌胃，空白組及模型組給予生理鹽水灌胃。藥物干預4周后測定大鼠空腹血糖（FPG）及灌胃葡萄糖溶液后2 h血糖（2 h PG），采集結腸內糞便，利用16S rDNA技術，基于OTU聚類結果，分析樣本菌群的多樣性和豐度，同時分析各樣本在門、屬水平的物種組成。基于OTU的韋恩圖結果顯示，有445個OTU為4組共有，4組間相似性較高，其中空白組和模型組相似性最低。α多樣性分析顯示，與空白組比較，模型組α多樣性指數下降，化瘀溫膽湯組、二甲雙胍組α多樣性指數顯著升高。菌群均勻度和菌群豐度從高到低依次為空白組、化瘀溫膽湯組、二甲雙胍組、模型組。物種相對豐度結果顯示，門水平各樣本以厚壁菌門（Firmicutes）為優勢菌，Saccharibacteria在空白組數量最多，模型組數量最少，廣古菌門（Euryarchaeota）在空白組數量最多，模型組該門幾乎為零；屬水平各樣本以乳酸菌屬（）數量最多，在空白組數量最少，模型組數量最多。群落結構差異性分析顯示，組間兩兩比較，腸道菌群分布具有明顯差異性。IGT大鼠腸道菌群穩態失衡，菌群多樣性及豐度在一定程度上降低，化瘀溫膽湯可能通過提高腸道菌群多樣性和相對豐度影響IGT大鼠腸道菌群穩態。

化瘀溫膽湯；糖耐量受損；腸道菌群；16S rDNA技術；大鼠

糖耐量受損（impaired glucose tolerance，IGT）是介于正常狀態與糖尿病之間的機體代謝異常階段，屬糖尿病前期。隨著生活方式改變，糖尿病及糖尿病前期發病率逐年增加[1]。國際糖尿病聯合會保守估計，至2045年全球20～79歲人群將有5.48億人患有IGT[2]。IGT不僅增加糖尿病的發病風險，同時還增加心血管疾病的發病率和病死率[1]。因此，積極篩查并干預IGT，對降低糖尿病發病率、減少各種并發癥所導致的危害具有重要意義。腸道菌群作為染色體之外的第二基因組，其結構、代謝及功能失調是代謝性疾病發生發展的重要原因。近期研究發現，腸道菌群參與脂質和碳水化合物的代謝及激素水平的調節，影響機體的新陳代謝[3]。腸道菌群與宿主相互作用，可通過影響宿主的胰島素分泌及胰島素敏感性，使機體產生慢性炎癥和胰島素抵抗，誘發IGT、肥胖、糖尿病、代謝綜合征等，而上述疾病又可加重腸道菌群紊亂[4-5]。此外，腸道菌群失調被認為是促進2型糖尿病（T2DM）胰島素抵抗快速進展的因素，占全世界所有糖尿病病例的90%[6-7]。因此，對腸道菌群失調進行早期干預，可能是今后防治糖尿病等代謝性疾病的新方向。

化瘀溫膽湯治療IGT、糖尿病、代謝綜合征等糖脂紊亂性疾病臨床療效顯著[8-9]。前期研究顯示，化瘀溫膽湯可有效改善IGT大鼠血糖、血脂、胰島素抵抗相關指標，調節糖脂代謝紊亂，延緩疾病的發展[10-11]。基于腸道菌群與糖脂代謝的相關性，本實驗通過16S rDNA技術手段研究IGT大鼠腸道菌群物種組成及其多樣性的差異，以明確化瘀溫膽湯是否可能通過影響腸道菌群達到防治IGT的目的。

1 實驗材料

1.1 動物

70只SPF級雄性SD大鼠，體質量（180±20）g，黑龍江中醫藥大學實驗動物中心提供，動物生產許可證號SCXK（黑）2015006，動物使用許可證號SYXK（黑）2015007。飼養于溫度20～25 ℃，相對濕度50%～70%環境，自由攝食飲水。

1.2 藥物及制備

化瘀溫膽湯（法半夏、枳實、竹茹各10 g，陳皮、酒白芍、葛根各15 g，茯苓、黃芩、三七各7.5 g，生姜、甘草、大棗各5 g），上述飲片均購于黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院草藥局，并由黑龍江中醫藥大學藥學院生藥學教研室鑒定符合藥典規定。化瘀溫膽湯按照前期研究進行制備[12]，并制成濃度為含原藥材1.25 g/mL，置于4 ℃冰箱保存。鹽酸二甲雙胍片，購于中美上海施貴寶制藥有限公司，批號20150824，加無菌蒸餾水將其（500 mg）研磨至粉末狀溶解，制成5 mg/mL鹽酸二甲雙胍懸濁液。

1.3 主要試劑與儀器

QIAamp DNA Stool Mini Kit（Qiagen，貨號51504），QIAquick Spin Handbook（Qiagen，貨號28304），DL2000 DNA Marker（Takara，貨號3427A），10×Loading Buffer（Takara，貨號9157），DNA Polymerase mix（Takara，貨號RR001Q），GelRed（Biotium，貨號41001-T）。ACCU-CHEK微量血糖儀（德國羅氏），SORVALL ST8/8R型低溫離心機（美國Thermo），SC-320D型4 ℃冰箱（海爾公司），E-Centrifuge-6型小型掌上離心機（WEALTEC），Tissue lyser-24型全自動樣品快速研磨儀（上海凈信科技），IMS-50型制冰機（雪科公司），Select Cycler ⅡPCR儀（美國SBP）。

2 實驗方法

2.1 造模

適應性喂養1周后，將SD大鼠隨機分為空白組10只和造模組60只。造模組予高脂高糖飼料（豬油15%，蛋黃粉15%，蔗糖15%，食鹽1.5%，嚙齒類動物普通飼料53.5%），空白組予嚙齒類動物普通飼料。參照前期研究[13]，于21周末測定空腹血糖（FPG）和腹腔注射葡萄糖后2 h血糖（2 h PG）并進行模型篩選，以FPG＜5.6 mmol/L，7.8 mmol/L≤2 h PG≤11.1 mmol/L作為IGT大鼠造模成功的參考標準[14-15]。

2.2 分組及給藥

抽取30只成模大鼠，隨機分為模型組、化瘀溫膽湯組和二甲雙胍組，每組10只。化瘀溫膽湯組予化瘀溫膽湯水煎劑1.25 g/mL灌胃（按人與動物體表面積折算等效劑量，相當于臨床劑量1.875 g/kg），二甲雙胍組給予鹽酸二甲雙胍懸濁液5 mg/mL灌胃，給藥體積均為2 mL/100 g，空白組及模型組予等體積生理鹽水灌胃，持續干預4周。

2.3 標本采集

25周末測定大鼠FPG及2 h PG后，利用異氟烷進行麻醉，大鼠沿胸骨剪開，暴露心臟，進行心臟采血，靜置1 h，3 000 r/min離心15 min，收集血清，-20 ℃保存。心臟取血后，剪開大鼠盲腸約2 cm，取結腸0.2～0.4 g糞便放入已經滅菌的凍存管中，置于-80 ℃冰箱保存。

2.4 指標檢測

2.4.1 空腹血糖及2 h血糖測定

干預結束（25周）前1日禁食水12 h，于次日8時剪尾尖取血，使用微量血糖儀測FPG；隨后予大鼠50%葡萄糖溶液2 g/kg灌胃，2 h后用微量血糖儀檢測大鼠2 h PG。

2.4.2 高通量測序檢測腸道菌群

利用隨機數字表法每組取6只大鼠結腸內糞便，進行腸道菌群的高通量測序分析。

2.4.3 糞便DNA提取

按照QIAamp糞便DNA小提試劑盒說明書對糞便樣本進行DNA提取，所得核酸濃度皆滿足擴增要求。

2.4.4 PCR擴增及PCR產物純化

以提取到的DNA（30～50 ng）為模板，PCR擴增16S rDNA基因V3～V4區（上游引物：5’-TCCTACGGGAGGCAGCAGT-3’；下游引物：5’-GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT-3’）。擴增反應條件：95 ℃，10 s；（95 ℃，5 s；58 ℃，10 s；72 ℃，15 s）×35次循環；4 ℃，+∞。使用1%瓊脂糖凝膠對PCR產物進行電泳檢測。根據QIAquick試劑盒說明書對所得PCR產物進行純化，用于后續檢測。

2.4.5 高通量測序

使用Agilent2100生物分析儀及Qubit2.0 Fluorometer構建文庫并對文庫進行濃度和質量檢測。DNA文庫混合后，利用Illumina MiSeq進行雙端測序，MiSeq讀取序列信息，并將得到的正反向reads進行兩兩組裝連接，經序列質量過濾，最終得到的序列用于OTU分析，使用VSEARCH（1.9.6）進行序列聚類（序列相似性設為97%），然后用RDP classifier貝葉斯算法對OTU的代表性序列進行物種分類學分析并統計群落組成。基于OTU的分析結果，分析大鼠腸道菌群相似性，α多樣性，門、屬水平物種分布情況，以及通過Anosim分析各組腸道菌群群落結構差異。

3 統計學方法

4 結果

4.1 化瘀溫膽湯對模型大鼠血糖的影響

與空白組比較，模型組大鼠FPG、2 h PG明顯升高（＜0.01）；與模型組比較，化瘀溫膽湯組和二甲雙胍組大鼠FPG、2 h PG明顯下降（＜0.05，＜0.01）。結果見表1。

表1 各組大鼠FPG、2 h PG比較（±s，mmol/L）

注：與空白組比較，##＜0.01；與模型組比較，*＜0.05，**＜0.01

4.2 化瘀溫膽湯對模型大鼠腸道菌群相似度的影響

將優化后有效序列提取unique序列，進行OTU聚類，將所有優化后序列與OTU代表序列進行比對，與OTU代表序列相似性≥97%序列為同一OTU，24個大鼠糞便樣本共獲得OTU 649個，每個樣本OTU個數分布見圖1。韋恩圖用于分析多個樣本/分組共有和特有的OTU，見圖2。24個大鼠糞便樣本共獲得OTU 649個，其中4組共有OTU 445個，表明4組間OTU代表序列相似性較高，與化瘀溫膽湯組、二甲雙胍組比較，空白組與模型組OTU相似性最低。

4.3 化瘀溫膽湯對模型大鼠腸道菌群多樣性的影響

α多樣性可反映微生物群落中物種數目，通過ACE、Chao1計算菌群豐度，Shannon、Simpson計算菌群多樣性。ACE則用來計算群落中含有OTU數目的指數。Chao1是用來計算樣本中所含OTU數目的指數。Shannon常用于反映α多樣性，用來估算樣本中微生物多樣性，Simpson常用于定量描述一個區域的生物多樣性。對隨機抽到的有效序列數進行OTU的分析，并計算其各α多樣性指數。

與空白組比較，模型組大鼠腸道菌群α多樣性指數明顯下降（＜0.01）；與模型組比較，化瘀溫膽湯組、二甲雙胍組大鼠腸道菌群α多樣性指數顯著升高（＜0.01）。見表2。以Chao1指數和Shannon指數為例，組間差異分析箱線圖見圖3、圖4。

4.4 化瘀溫膽湯對模型大鼠腸道菌群結構組成的影響

門水平各樣本中厚壁菌門（Firmicutes）數量最多，為優勢菌，Saccharibacteria、脫鐵桿菌門（Deferribacteres）、梭桿菌門（Fusobacteria）次之，見圖5。組間比較Saccharibacteria在空白組數量最多，模型組數量最少；廣古菌門（Euryarchaeota）在空白組數量最多，模型組該門幾乎為零，見圖6。

注：KB-1～KB-6.空白組；MX-1～MX-6.模型組；ZY-1～ZY-6.化瘀溫膽湯組；EJSG-1～EJSG-6.二甲雙胍組

圖2 各組大鼠OTU分布韋恩圖

表2 各組大鼠腸道菌群α多樣性指數比較（±s）

注：與空白組比較，##＜0.01；與模型組比較，**＜0.01

注：KB.空白組；MX.模型組；ZY.化瘀溫膽湯組；EJSG.二甲雙胍組

注：KB.空白組；MX.模型組；ZY.化瘀溫膽湯組；EJSG.二甲雙胍組

注：KB-1～KB-6.空白組；MX-1～MX-6.模型組；ZY-1～ZY-6.化瘀溫膽湯組；EJSG-1～EJSG-6.二甲雙胍組

注：KB.空白組；MX.模型組；ZY.化瘀溫膽湯組；EJSG.二甲雙胍組

屬水平各樣本中乳酸菌屬（）數量最多，未分類（Unclassified）、布勞特氏菌屬（）、次之，見圖7。在空白組數量最少，模型組數量最多，見圖8。

注：KB-1～KB-6.空白組；MX-1～MX-6.模型組；ZY-1～ZY-6.化瘀溫膽湯組；EJSG-1～EJSG-6.二甲雙胍組

注：KB.空白組；MX.模型組；ZY.化瘀溫膽湯組；EJSG.二甲雙胍組

4.5 腸道菌群群落結構差異分析結果

Anosim組間差異分析通過對樣本間距離矩陣的分析，得到值和值。4組兩兩比較，腸道菌群群落結構差異有統計學意義（＜0.05）。見表3。

表3 各組大鼠腸道菌群群落結構Anosim分析

分組因子R值P值 空白組vs二甲雙胍組0.5240.002 空白組vs模型組0.8130.005 空白組vs化瘀溫膽湯組0.3190.019 模型組vs二甲雙胍組0.2720.039 模型組vs化瘀溫膽湯組0.4500.011 化瘀溫膽湯組vs二甲雙胍組0.4070.009

注：值范圍[-1，1]，值接近0表示組間和組內無明顯差異，值接近1表示組間差異大于組內差異；值表示統計分析可信度

5 討論

IGT是正常糖耐量轉化為糖尿病的過渡階段，以餐后血糖升高為主要臨床表現，是糖尿病發生的必經階段，具有可逆性。因此，有效改善IGT符合中醫治未病思想。根據臨床表現，IGT可歸屬于中醫學“脾癉”“消渴”等范疇，其病機主要包含陰虛、脾虛、痰瘀互結等[16-17]。課題組認為其發病與現代人久坐少動、不節飲食、喜食膏粱厚味、偏嗜煙酒及憂思煩勞過度有關。上述因素均可直接或間接損傷脾主運化和主升清功能，導致脾虛不運，痰濕瘀熱內蘊于三焦，阻礙機體氣化，成為IGT主要病理基礎，而“脾不散精，三焦失運為本，痰濕瘀熱為標”為其主要病機。化瘀溫膽湯以法半夏為君藥，和胃降逆、祛痰化濁；竹茹甘寒，與法半夏配伍，既清熱化痰，又降逆除煩；生姜、大棗培土和中，茯苓健脾滲濕，三者可清生痰之源；枳實破氣消痰，陳皮燥濕理氣化痰，二者可理氣化痰、行氣降逆；黃芩清熱，葛根生津，二藥合用可清熱燥濕；酒白芍養血斂陰；三七可活血化瘀；甘草益氣和中，調和諸藥。全方共奏祛痰滲濕、清熱生津、活血化瘀之功。

有研究顯示，腸道菌群參與中藥成分生物轉化，中藥成分對其具有調節作用，提示腸道菌群可作為治療疾病的潛在靶點[18-19]。中醫認為，腸道菌群紊亂是脾主運化功能失司、脾不散精的病理表現。任欣等[20]研究顯示，小米膳食干預12周可顯著提高IGT患者腸道菌群多樣性和厚壁菌門/擬桿菌門比值及柔嫩梭菌屬的相對豐度，調節腸道菌群穩態，推測飲食干預可通過改變IGT患者腸道菌群的組成和相對豐度改善機體血糖代謝。本研究基于IGT“脾虛不運、脾不散精”的病機特點，采用16S rDNA技術分析IGT大鼠腸道菌群結構特征，并初步探討化瘀溫膽湯的可能干預機制。研究發現，IGT大鼠腸道菌群多樣性及豐度均降低，化瘀溫膽湯可能通過提高腸道菌群的多樣性和豐度，影響IGT模型大鼠的腸道菌群穩態，進而發揮其調節糖脂代謝的作用。

IGT大鼠腸道菌群結構組成柱狀圖顯示，門水平各樣本大鼠腸道菌群以Firmicutes為優勢菌。Firmicutes作為人體腸道菌群最主要的優勢菌，占總菌群的50%～60%，其與T2DM關系緊密。研究顯示，增加腸道內Firmicutes的比例，如增加普拉氏梭桿菌，可增加腸道內丁酸菌的數量，進而改善機體的胰島素抵抗[21]。屬水平以在模型組數量最多，空白組數量最少，這與T2DM患者[22]、大鼠[16]腸道菌群中豐度增高的結論一致。此外，研究還發現梭菌綱（Clostridia）在模型組數量最少，空白組數量最多，這也與郭麗璇等[23]研究T2DM患者腸道菌群中Clostridia菌群豐度降低一致。在此基礎上，本研究Anosim組間差異分析結果顯示，模型組與空白組比較，腸道菌群群落結構差異顯著，提示IGT大鼠腸道菌群菌落組成較空白組大鼠發生顯著變化。

腸道菌群菌落的多樣性和豐度是反映腸道菌群組成的重要指標。本研究采用ACE、Chao1、Shannon及Simpson指數反映群落的豐度和多樣性，發現與空白組比較，IGT大鼠腸道菌群在豐度和多樣性上差異顯著，表明IGT大鼠腸道菌群表征發生改變，其腸道菌群菌落的豐度和多樣性均減少，與臨床IGT和糖尿病患者腸道菌群特點分析結果一致[24]。此外，本研究OTU韋恩圖結果顯示，空白組有41個OTU未在模型組中發現，而模型組中1個OTU未在空白組中發現，表明空白組與模型組菌群組成差異較大，提示IGT大鼠腸道菌群發生了變化。腸道菌群菌落豐度降低及多樣性減少，易導致腸道微生態紊亂，成為代謝性疾病等眾多疾病發生的潛在誘因[25]。二甲雙胍作為陽性藥物對照，不僅是糖尿病一線治療藥物，而且具有調節腸道菌群的作用[26]。與模型組比較，二甲雙胍組和化瘀溫膽湯組α多樣性指數顯著升高，而二者之間在腸道菌群豐度及多樣性方面則無顯著差異，提示兩組藥物均可能影響IGT大鼠的腸道菌群穩態，驗證了二甲雙胍可改善腸道菌群紊亂，同時提示化瘀溫膽湯可能通過增加腸道菌群菌落的多樣性和豐富度影響IGT大鼠的腸道微生態。

綜上，本研究采用16S rDNA技術觀察IGT大鼠腸道菌群的變化及化瘀溫膽湯的可能干預機制，發現IGT大鼠腸道菌群穩態失衡，菌群群落多樣性及豐度在一定程度上降低，化瘀溫膽湯可能通過提高腸道菌群群落多樣性和相對豐度影響IGT大鼠腸道菌群穩態，為化瘀溫膽湯治療IGT提供依據，但尚需擴大樣本量和豐富研究手段進一步驗證。

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Effects ofDecoction on Intestinal Flora of IGT Rats Based on 16S rDNA

TIAN Miao1, ZHOU Yingchun1, SUN Dan2, LI Weizhong1, FAN Dehui1, HAN Yubo2, LIU Li2, ZHANG Fuli1

To analyze the structural characteristics of intestinal flora in rats with impaired glucose tolerance (IGT) based on 16S rDNA technology; To preliminarily explore the possible intervention mechanism ofDecoction.Ten of 70 male SD rats were randomly selected as blank group, and the remaining 60 rats were fed with high fat and high sugar diet for 21 weeks to induce IGT rat model. 30 IGT model rats were randomly divided into model group,Decoction group and metformin group, with 10 rats in each group.Decoction group was given the TCM decoction for gavage; the metformin group was given the metformin suspension for gavage; the blank group and the model group were given normal saline for gavage. After 4 weeks of drug intervention, FPG and 2 h PG were measured, and feces in the colon were collected. Using 16S rDNA technology, based on OTU clustering results, the diversity and abundance of each group of samples were analyzed, and the species composition of each sample at the phylum and genus level was analyzed.The results of Venn diagram based on OTU showed that there were 445 OTUs shared by the four groups, and the similarity among the four groups was high, and the similarity between the blank group and the model group was the lowest. The alpha diversity analysis showed that compared with the blank group, the alpha diversity index of the model group decreased, while the alpha diversity index ofDecoction group and metformin group increased significantly. The homogeneity and abundance of the microbiome from high to low were the blank group,Decoction group, metformin group, and model group. The relative abundance results of species showed that, at the phylum level, Firmicutes was the dominant bacteria in each sample; Saccharibacteria had the largest number in the blank group and the least number in the model group; Euryarchaeota had the largest number in the blank group and almost zero in the model group. At the genus level, the number ofin each sample was the most. The number ofin the blank group was the least, and the number ofin the model group was the most. The analysis of structural differences between the groups showed that comparing the four groups of samples in pairs, the distribution of intestinal flora was obviously different.The homeostasis of intestinal flora in IGT rats is unbalanced, and the diversity and abundance of intestinal flora has decreased to a certain extent.Decoction may affect the intestinal flora homeostasis of IGT rats by increasing the diversity and relative abundance of gut microbiome.

Decoction; impaired glucose tolerance; intestinal flora; 16S rDNA technology; rats

R285.5

A

1005-5304(2021)08-0059-07

10.19879/j.cnki.1005-5304.202101419

黑龍江省自然科學基金聯合引導項目（LH2020H080）；黑龍江省博士后資助經費項目（LBH-Z19212）；黑龍江中醫藥大學校科研基金項目（201818）

張福利，E-mail：fuli7505@163.com

（收稿日期：2021-01-23）

（修回日期：2021-03-04；編輯：華強）