一例林麝支氣管敗血波氏桿菌性肺炎的診斷※

●劉玉太 金學林 趙澤明 車利鋒 吳橋興（陜西省動物研究所 陜西 西安 710032）

林麝（Moschus berzovskii）是國家Ⅰ級重點保護動物，屬偶蹄目反芻亞目麝科麝屬。野生林麝在我國多個山區均有分布，其中陜西秦嶺地區是重要棲息地之一[1]。麝香是一種重要的中藥材和香料。為了合理保護、開發和利用，陜西省大力推廣林麝的人工馴養，經過數十年的探索，在林麝馴養方面取得了一系列成果，陜西省的圈養林麝數量居全國之首[2]。

疾病是馴養林麝面臨的重要問題之一。林麝個體的經濟價值高，疾病給林麝養殖場帶來巨大經濟損失。目前，圈養林麝受多種疾病危害，主要的疾病類型包括呼吸道疾病、化膿性膿腫病、寄生蟲病、胃腸炎等。據調查，呼吸系統疾病導致林麝死亡的比例高達31.27%。林麝呼吸系統疾病的主要病原包括致病性大腸桿菌、銅綠假單胞菌、巴氏桿菌等[2-6]。

支氣管敗血波氏桿菌（Bordetella bronchiseptica，以下簡稱Bb），屬于革蘭氏陰性需氧球桿菌，大小為（0.2～0.3）μm×（0.5～1.0）μm，有莢膜，散在或成對排列，可在多種培養基上生長。Bb可以感染多種哺乳動物，如豬、兔、雪貂、狗、貓，也可以感染人，主要表現出呼吸道癥狀。Bb感染豬可導致萎縮性鼻炎，常給養豬業帶來重大損失[7]。Bb可以繼發于其他傳染性疾病，導致動物的呼吸道癥狀加劇，使動物死亡率升高。Bb在豬只感染方面多呈散發或地方性流行，傳播廣泛且呈持續性感染[8]。Bb導致野生動物感染的病例報道較少，北京動物園在死亡的袋鼠、小熊貓、節尾狐猴肺組織上分離到過Bb[9]。Lacasse等[10]報道過Bb感染導致北極熊發生支氣管炎的病例。

本文通過對一例因Bb感染死亡的林麝進行病理診斷和病原學分析，詳細描述了Bb感染導致林麝的臨床癥狀和主要臟器的病理變化，并采用16s rRNA對分離到的細菌進行鑒定，旨在為林麝呼吸系統疾病的綜合防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 動物來源

陜西省佛坪縣某林麝養殖基地1只猝死的懷孕林麝，年齡3歲。2020年5月18日13:00死亡，死后保存在有冰袋的泡沫箱中。

1.2 病理剖解和病料采集

林麝死亡當天23:00，按照反芻動物病理剖解規范進行剖檢，詳細記錄主要臟器病理變化。

采集肝臟、肺臟、氣管病料，分別用普通營養瓊脂、血平板及麥康凱瓊脂培養，37 ℃培養12～24 h。菌落長出后，對不同形態的菌落進行革蘭氏染色，并繼續用血平板分離培養，采用16s rRNA引物對分離的菌落進行鑒定，上游引物序列為gagtttgatcmtggctcag，下游引物序列為ctahagggtatctaatcct，目的片段為750 bp[11]。同時對肺臟、肝臟做組織觸片，進行吉姆薩瑞氏染色。

采集主要組織器官，包括淺表淋巴結、扁桃體、氣管、肺臟、心臟、肝臟、脾臟、腎臟等，分別用4%中性多聚甲醛固定和凍存。固定組織進行石蠟包埋和HE染色，并做組織病理學觀察。

2 結果與分析

2.1 臨床調查及癥狀

該群林麝一年前曾出現過呼吸道癥狀，目前部分個體已臨近生產。

14 d前第一例林麝出現精神萎靡，厭食，有明顯喘鳴音和鼻液。1 d后死亡，鼻腔內有鮮紅色液體流出。該病例年齡3歲，雌性，臨近生產。

7 d前，第二例林麝出現類似癥狀，鼻腔有膿性白色分泌物流出。注射頭孢呋辛、林可霉素，2 d后死亡。該病例年齡4歲半，雌性，臨近生產。

本例為第三例，死前2 d林麝表現出喘鳴、鼻液等癥狀，使用拜有利治療。

三例死亡林麝圈舍位置關系，見圖1。

2.2 剖檢變化

林麝死亡時，鼻腔、口腔涌出大量紅色液體（圖2）。尸體柔軟，腹部鼓氣，被毛整齊，眼結膜蒼白。肛門糞便略稀軟，但成形。陰門處無明顯異常。

肩前、腹股溝、頜下等淺表淋巴結無明顯腫大。胸腔內有暗紅色液體，胸膜壁層光滑。咽喉部扁桃體無明顯腫大。雙側肺臟質地柔軟，切面有紅色液體流出，呈暗紅色，尖葉表面有淡黃色膜樣物質附著（圖3）。氣管內有少量泡沫樣紅色液體，黏膜充血，有淡黃色膜樣物質附著（圖4）。縱隔淋巴結未見明顯腫大。

心包內有淡黃色凝膠樣物質。心臟質地堅實，心尖外形無明顯異常，橫縱比無明顯異常。外觀呈黃紅相間條紋，右心室內有大量血凝塊。二尖瓣、三尖瓣表面光滑。肝臟邊緣銳利，顏色呈暗黑色，切面暗紅色，質地堅實。脾臟邊緣銳利，顏色呈暗黑色，質地柔軟。腎臟外觀無明顯異常，被膜易剝離，切面皮質、髓質界限清晰。膀胱大小適中，黏膜白色，尿液清亮，未見明顯異常。腸系膜淋巴結未見腫大。子宮為雙角子宮，有兩個雌性胎兒。消化道眼觀無明顯異常。由于未攜帶開顱工具，未做神經系統檢查。

2.3 組織病理學變化

2.3.1 肺臟細支氣管、肺泡腔內充滿紅細胞及中性粒細胞等炎性細胞，肺泡壁增厚，Ⅰ型肺泡上皮細胞水泡變性。肺泡毛細血管充血，肺泡內可見大量網狀、紅染的凝固纖維蛋白。肺小葉間隔增寬（圖5-A和圖5-B）。

2.3.2 氣管黏膜結構完整，黏膜下層毛細血管充血，間質水腫，大量炎性細胞浸潤（圖5-C）。

2.3.3 頜下淋巴結淋巴結內毛細血管充血，被膜下水腫，大量炎性細胞浸潤。皮質淋巴濾泡反應性增大。髓竇內大量泡沫樣巨噬細胞（圖5-D）。

2.3.4 扁桃體扁桃體隱窩內有少量滲出的炎性細胞及脫落細胞，淋巴濾泡排空，毛細血管充血（圖5-E）。

2.3.5 脾臟脾臟白髓區減小，淋巴細胞減少；紅髓區充血，大量含鐵血黃素沉著（圖5- F）。

2.3.6 心臟、肝臟、腎臟未見明顯異常。

2.4 組織觸片檢查

肺臟、氣管的觸片經吉姆薩瑞氏染色后可見大量兩極著染的短桿菌，如圖6箭頭所示。

2.5 細菌分離培養與鑒定

普通營養瓊脂上僅肺臟和氣管病料有菌落生長。麥康凱瓊脂上未有菌落生長。普通營養瓊脂上肺臟病料形成單一的光滑、濕潤、白色、半透明的隆起，中等大小菌落，經革蘭氏染色，可見革蘭陰性、兩極著染的球桿菌，記為A菌（圖7-A）。

普通營養瓊脂上氣管病料僅有一種菌落形成，為光滑、濕潤、白色、半透明的隆起，中等大小菌落，經革蘭氏染色，可見革蘭陰性、兩極著染的球桿菌，記為B菌（圖7-B），其與肺臟病料細菌形態相近。

采用16s rRNA引物鑒定純化后的細菌，經Genbank比對，A和B分離菌均為支氣管敗血性波氏桿菌，與編號CP050967.1的分離株同源性為99.48%。

2.6 診斷結果

綜合以上檢查結果，可以判定該病例是由敗血性波氏桿菌感染引起的出血性大葉性肺炎,并最終導致死亡。細菌感染主要對肺臟造成損傷，并引起脾臟、頜下淋巴結、扁桃體等免疫器官的炎性反應和損傷。根據脾臟、淋巴結、扁桃體表現出白髓區減小、淋巴濾泡排空等病理變化，表明動物機體的免疫力衰竭。脾臟出現大量含鐵血黃素，表示細菌感染引起了大量紅細胞的崩解。

3 結論與討論

肺炎是圈養麝類種群面臨的重要疾病之一，主要病因為受驚和環境突變等刺激性因素，動物臨床表現為體溫升高、呼吸淺快、膿樣鼻漏、食欲減退、喘鳴[3,12]。患肺炎的個體病程發展較快，因林麝天性膽小，給藥過程中的抓捕等行為可能會加重病癥，感染肺炎后林麝死亡率較高。目前，在對圈養麝類動物肺炎病原的研究中，分離到的主要病原有致病性大腸桿菌、銅綠假單胞菌、巴氏桿菌、沙門氏菌、彎曲桿菌、支原體等。其中較多病原是致病性大腸桿菌[13]，尚未有Bb感染引起林麝肺炎的病例報道。

根據臨床調查發現3頭病死林麝均是妊娠雌性個體，且3個病例的圈舍臨近，臨床癥狀和病程相似。雖然沒有前兩例病例的病料研究，但可以推測3例病例之間具有很強的關聯性。臨床表現均有明顯膿性和紅色鼻漏、喘鳴等癥狀，表明可能是同一種病原引起的死亡。本病例死亡時鼻腔、口腔均有紅色液體流出。剖檢前，對鼻腔分泌物進行革蘭氏染色鏡檢，未見鏈狀排列的有莢膜的粗大桿菌。

氣管和肺臟表現出明顯的病理變化，胸腔有紅色積液，與肺臟和氣管的組織病理學變化相對應，呈現典型的出血性纖維化肺炎特征。在以往報道的林麝大腸桿菌肺炎中，肺臟表現出多處化膿灶，并在肝臟形成轉移性膿腫灶[4,14]。而本病例的肺臟、頜下淋巴結、扁桃體和脾臟出現明顯的病理損傷，肺臟可見大量纖維蛋白滲出和中性粒細胞浸潤，呈現細菌感染的病理變化特征。同時肺泡內有大量紅細胞滲出，表明肺泡毛細血管壁出現損傷。頜下淋巴結、脾臟、扁桃體等免疫器官的淋巴細胞區域表現出不同程度的淋巴細胞排空，表明林麝的免疫機能處于不斷衰竭的過程[15]。此外，心臟、肝臟、腎臟等主要臟器并未表現出明顯的病理變化。

組織觸片染色和細菌分離純化后染色均可見單一的兩極著染的桿狀細菌，革蘭氏染色呈陰性。經16s rRNA PCR鑒定和Genbank比對，與支氣管敗血性波氏桿菌的同源性為99.48%。在以往的研究中，Bb對豬和兔造成的危害比較大，可造成豬的支氣管肺炎、萎縮性鼻炎，兔主要病變也是鼻腔和肺臟，引起膿性鼻分泌物、肺臟化膿等[1,16-18]。Lacasse等[10]報道Bb可以導致北極熊發生氣管炎，并且具有傳染性。李偉杰等[9]采用16s rRNA方法對北京動物園死亡的野生動物肺臟、血液等樣品進行分離，鑒定了數個Bb菌株，與支氣管敗血性波氏桿菌模式菌株存在很高的同源性，但未分析Bb菌株與這些動物死因的關系，Bb菌株在野生動物呼吸道中可能是常在細菌。當環境改變或動物機體免疫力降低時，Bb會導致動物患肺炎、氣管炎等。綜上，Bb感染是導致本病例發生出血性大葉性肺炎的主要原因，與以往報道的林麝肺炎病例或其他Bb所致的兔、豬的肺炎不同，該病例呈現發病急、病程短、致死率高的特征。預防Bb感染主要在于環境控制，在氣候多變時應注意畜舍的保暖，減少應激因素。對于妊娠林麝應加強管理，出現發病個體時應及時隔離治療。