鹿血水解物抗氧化能力研究※

●韓歡勝 郭喜明 徐 馨 柴孟龍

（1.哈爾濱博蒙生物科技有限公司 黑龍江 哈爾濱 150030；2.黑龍江普惠特產有限公司 黑龍江 哈爾濱 150030）

梅花鹿(Cerrus nipponTemminck) 為哺乳綱鹿科鹿屬的反芻動物，是東北季風區的特產物種[1]。鹿血是鹿科動物梅花鹿或馬鹿（Cerrus elaphusLinaeus）膛血或茸血，性熱，味甘咸，歸肝、腎經；具有養血益精、行血祛瘀、消腫療傷等功效[2]，是我國傳統的名貴中藥，是上品動物中藥。隨著人們對大健康的重視，對藥食同源保健品的認可度也越來越高，因此，梅花鹿產業及相關副產品開發利用發展迅速。

鹿血中富含蛋白質和多種氨基酸營養成分[3]，研究表明動物類藥材功效的主要物質基礎為由氨基酸組成的活性肽。同時，氧化應激反應是體內自由基產生的一種負面作用，是導致衰老和許多疾病發生的重要因素之一。因此，本文比較不同蛋白酶水解鹿血后其水解物的抗氧化功效，對鹿血的開發和利用具有一定的意義。

1 材料與方法

1.1 鹿血樣本的采集

四只1歲齡的東北梅花鹿，雌雄各半，身形健壯，精神狀態良好，均來源于吉林省長春市雙陽鹿鄉鎮某鹿場。梅花鹿在采血前禁食12 h后開始麻醉，通過頸靜脈進行采血和收集，并帶回實驗室進行冷凍干燥處理，粉末過篩備用 。

1.2 試驗儀器

萬分之一電子天平 BP211D 德國 Switzerland 公司KQ-250DB 數控超聲清洗器 昆山超聲波儀器有限公司DHG-9240A 恒溫干燥箱 上海一恒科技有限公司Milli-Q Advantage A1 超純水器 美國密理博公司ELX800酶標儀 美國Bio-Tek有限公司5810R型高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司

1.3 試驗試劑

堿性蛋白酶、中性蛋白酶和復合蛋白酶均購于 Solarbio 公司， DPPH 自由基購于Sigma 公司，四硼酸鈉、鄰苯二甲醛、鹽酸、氫氧化鈉、無水乙醇等試劑均為國產分析純。

1.4 試驗方法

選用堿性蛋白酶、中性蛋白酶和復合蛋白酶分別對鹿血進行酶解，篩選出最佳的蛋白酶種類。將預處理的凍干鹿血配制成溶液，分別與3種蛋白酶以底物濃度比為 1∶50進行混合，調節三種酶反應時最佳的溫度和pH條件，并在反應中連續使用NaOH保持pH不變，記錄NaOH使用量（mL）和水解度（DH）。酶水解結束后，90 ℃ 水浴下滅活5 min，連續加入HCl將水解物溶液pH調整為7.0，真空冷凍干燥鹿血水解物溶液，4 ℃保存。

將凍干的鹿血水解物溶解，配置成濃度為30 mg/mL的溶液，測定不同蛋白酶水解鹿血的水解度、DPPH 自由基的清除率和總還原力。

1.4.1 水解度（DH）根據pH-Stat法[4]，水解度的計算公式為：DH=h/htot×100%。公式中h為水解后鹿血中肽鍵量（mmol/g），htot為鹿血中肽鍵的總量（mmol/g）。其中h=B×Nb×1/α×1/Mt，公式中B為鹿血水解過程中NaOH使用量(mL)，Nb為堿液的濃度（mol/L），Mt為鹿血水解物溶液中蛋白質的量（g），1/α為校正系數。

1.4.2 DPPH自由基清除率取4mL 1×10-4mol/L DPPH和甲醇混合溶液，分別與不同酶水解產生的鹿血水解物溶液1mL，放入試管中搖勻，常溫避光反應 30 min，采用分光光度計在517 nm波長下測量吸光度。DPPH自由基清除率=［1-（B1-B2）/B3］×100%。其中公式中B1為DPPH與鹿血水解物混合溶液的吸光度，B2為鹿血水解物溶液的吸光度，B3是單獨DPPH 溶液的吸光度。

1.4.3 總還原力取3.0 mL FRAP （ferric reducing/antioxidant power）試劑加熱到38℃后加入0.1 mL鹿鞭水解物和0.3 mL H2O，反應10 min，采用分光光度計，在593 nm 波長下進行吸光度的測定。同時，作陰性對照和陽性對照進行比較。根據繪制FeSO4·7H2O標準曲線，測定鹿血水解物吸光度表示其抗氧化活性強弱。

1.5 數據處理

用Excell軟件統計分析數據。

2 結果與分析

2.1 測定不同蛋白酶作用下鹿血水解物的水解度

如圖1所示，隨著水解反應時間的增加，3種蛋白酶作用下鹿血水解物的水解度均增大，曲線變化明顯；其中堿性蛋白酶作用下鹿血水解物的水解度變化趨勢顯著高于中性蛋白酶和復合蛋白酶，為最佳水解蛋白酶種類。

2.2 測定不同蛋白酶作用下鹿血水解物DPPH自由基的清除率

如圖2所示，隨著水解反應時間的增加，3種蛋白酶作用下鹿血水解物DPPH 自由基清除能力增強；其中堿性蛋白酶水解后的鹿血水解物比中性蛋白酶和復合蛋白酶具有更高的清除 DPPH自由基活性作用。鹿血酶水解物具有較強的自由基清除能力，可能與其富含色氨酸、亮氨酸和賴氨酸等氨基酸殘基具有較強的抗氧化能力有關。

2.3 測定不同蛋白酶作用下鹿血水解物的總還原力

如圖3所示，隨著水解反應時間的增加，3種蛋白酶作用下鹿血的水解物總還原力增強；其中堿性蛋白酶作用下鹿血水解物的總還原能力均高于中性蛋白酶和復合蛋白酶。鹿血酶水解物具有較強的總還原能力，可能與其在酶水解時肽鏈發生斷裂和增加氫離子數量有關。

3 結論

本文通過采用3 種不同的蛋白酶（堿性蛋白酶、中性蛋白酶和復合蛋白酶) 在最適溫度和pH條件下水解鹿血，以水解度為指標篩選出最佳水解蛋白酶種類為堿性蛋白酶，并研究和比較3種鹿血水解物的抗氧化活性，結果發現，3種鹿血水解物均具有較好的抗氧化能力，隨水解反應時間的增長而增加，并且堿性蛋白酶作用下鹿血水解物的DPPH自由基清除能力和總還原能力較其他兩種蛋白酶略高。鹿血水解物抗氧化活性可能與蛋白質水解后分解成特殊肽和氨基酸殘基成分有關，這對鹿血的進一步開發利用和抗氧化應激作用方面相關研究具有一定的參考價值和意義。