豬miR-378種子序列的多態(tài)性對(duì)其功能以及胴體性狀的影響

張廷煥 張利娟 陳四清 郭宗義

（1. 重慶市畜牧科學(xué)院，重慶 402460；2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部養(yǎng)豬科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 402460）

microRNAs（miRNAs）是一類(lèi)內(nèi)源性的短片段非編碼 RNAs，調(diào)控體內(nèi)多數(shù)基因，廣泛參與生物體的生長(zhǎng)發(fā)育，比如細(xì)胞增殖、凋亡和分化，系統(tǒng)的免疫，疾病的發(fā)生、發(fā)展等［1］。miRNAs基因首先被RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄成的初級(jí)miRNAs（primiRNAs），在細(xì)胞核內(nèi)由Drosha酶加工成60 bp且具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的前體miRNAs（pre-miRNA），然后由細(xì)胞質(zhì)的Dicer酶進(jìn)一步切割成18-25 bp的成熟miRNAs［2-3］。miRNAs主要是通過(guò)其2-8位保守的堿基序列（即種子序列）與mRNA的3′UTR區(qū)特異性位點(diǎn)互補(bǔ)配對(duì)抑制轉(zhuǎn)錄，從而引起靶基因的剪切、脫腺苷化或降解［4］。近年來(lái)，越來(lái)越多的報(bào)道表明miRNA的序列突變后，miRNAs二級(jí)結(jié)構(gòu)以及表達(dá)水平一般都會(huì)發(fā)生顯著改變［5-7］。特別是，種子序列中的任一堿基的改變，如單核苷酸多態(tài)性（SNPs），都會(huì)顯著影響該miRNA的功能［8-9］。

其中，miR-378是一個(gè)與脂肪生成［10-11］、肌肉生長(zhǎng)［12-13］和成骨分化［14］等密切相關(guān)的表觀(guān)遺傳調(diào)控因子。大量研究證明，miR-378在脂肪、肌肉組織中高表達(dá)，且對(duì)脂肪、肌肉的生成過(guò)程起著重要的作用［11，15］。在脂肪細(xì)胞中，miR-378的生成會(huì)受到一些與脂肪分化相關(guān)因子的調(diào)控，比如TNF-a、IL-6、Leptin，來(lái)影響脂肪分化過(guò)程［16］；同時(shí)在前體脂肪細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-378能夠增加C/EBP-α和C/EBP-β基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)脂質(zhì)的生成；miR-378還能靶向調(diào)控MAPK1基因，促進(jìn)前體脂肪細(xì)胞的分化［11］；敲除miR-378的小鼠會(huì)出現(xiàn)體重降低，皮下白色脂肪體積減少等現(xiàn)象［10］；對(duì)于棕色脂肪而言，miR-378靶定磷酸二酯酶Pde1b來(lái)控制增加脂肪產(chǎn)熱，從而起到緩解肥胖的效果［17］。此外，在成肌細(xì)胞中miR-378能靶向抑制MyoR的表達(dá)［12］，而MyoR是生肌分化因子（MyoD）的拮抗劑［18］，相當(dāng)于miR-378間接增加了MyoD的表達(dá)量，從而促進(jìn)肌細(xì)胞分化；miR-378還可控制內(nèi)源性靶基因BMP2和MAPK1的表達(dá)，以此調(diào)控肌生成過(guò)程［19］；miR-378能與Igf1R結(jié)合來(lái)影響新生兒心臟的重塑以及心肌細(xì)胞的存活［20］。

豬 miR-378 是由 2 號(hào)染色體和 12 號(hào)染色體上兩個(gè)不同 miR-378 基因位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄而成［21］。本實(shí)驗(yàn)利用群體遺傳分析了miR-378位點(diǎn)在不同豬種中的選擇信號(hào)；PCR測(cè)序獲得miR-378-3p種子序列第5位的突變?cè)诟鱾€(gè)豬種中的基因頻率；利用RNAfold軟件預(yù)測(cè)了該突變對(duì)其二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變；在前體脂肪細(xì)胞中驗(yàn)證了該突變對(duì)其促脂功能的影響；同時(shí)對(duì)該位點(diǎn)不同基因型與豬背膘厚、眼肌面積等屠宰性狀進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析。旨為明確 miR-378 種子序列多態(tài)性對(duì)其生物學(xué)功能的改變，以及對(duì)豬胴體性狀的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

榮昌豬以及其雜交群體來(lái)自榮昌豬國(guó)家級(jí)保種場(chǎng)、小鼠的前體脂肪細(xì)胞（3T3-L1）購(gòu)自北京協(xié)和細(xì)胞資源中心。DNA提取試劑盒、RNA提取試劑盒、Q5超保真DNA聚合酶均購(gòu)自NEB公司；蛋白酶K、GoTaq?qPCR Master Mix試劑盒來(lái)自Promega公司；PCR 產(chǎn)物回收試劑盒Omega公司；Lipofectamine 2000購(gòu)自Invitrogen公司；瓊脂糖、DNA marker購(gòu)自TaKaRa公司；miRNA類(lèi)似物由銳博公司合成。

1.2 方法

1.2.1 基因組測(cè)序數(shù)據(jù) 提取6頭榮昌母豬血液中基因組DNA，所選個(gè)體近3代內(nèi)無(wú)直接和間接血緣關(guān)系，利用Illumina HiSeq 2000平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。同時(shí)從EMBL-EBI數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.ebi.ac.uk/）下載了不同地域豬種的重測(cè)序數(shù)據(jù)，包括亞洲野豬、4個(gè)歐洲家豬、11個(gè)中國(guó)家豬。

1.2.2 單核苷酸多態(tài)性（SNP）分析 利用BWA軟件將榮昌豬和亞洲野豬重測(cè)序數(shù)據(jù)比對(duì)到豬參考基因組，運(yùn)用SAMtools工具獲得單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)（single nucleotide polymorphisms，SNP），計(jì)算每個(gè)個(gè)體在每個(gè)基因組位置的基因型可能性，并估計(jì)等位基因頻率。篩選出高質(zhì)量SNP用于后續(xù)分析，判斷標(biāo)準(zhǔn)為：SNP測(cè)序覆蓋度≥4且≤1 000，均方根比對(duì)質(zhì)量≥20，相鄰S(chǎng)NP的距離≥5 bp，每組樣本的缺失率<50%。

1.2.3 群體遺傳選擇分析 應(yīng)用滑行窗口法（100 kb窗口+10 kb步伐）計(jì)算100 kb內(nèi)SNP位點(diǎn)等位基因數(shù)進(jìn)行選擇信號(hào)分析。對(duì)榮昌豬和亞洲野豬的平均雜合度（Hp）、遺傳分化系數(shù)（Fst）以及選擇統(tǒng)計(jì)量（Tajima’s D，即基因組中的選擇指標(biāo)）進(jìn)行量化。為了檢測(cè)具有顯著受選擇的基因組區(qū)域，運(yùn)用Z值轉(zhuǎn)換對(duì)Hp和Fst值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，同時(shí)在榮昌豬中具有Z（Hp）值低于-2且Z（FST）高于2的窗口可作為強(qiáng)選擇信號(hào)的區(qū)域。

1.2.4 miR-378二級(jí)結(jié)構(gòu)及其自由能預(yù)測(cè) 利用RNAfold在 線(xiàn) 軟 件（http：//rna.tbi.univie.ac.at//cgibin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi）對(duì)miR-378野生型和突變型的二級(jí)結(jié)構(gòu)及其自由能進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.2.5 油紅O染色定量 合成了3種不同microRNA類(lèi)似物，分別為野生型組miR-378W，突變型組miR-378M和對(duì)照組Control，其中Control為無(wú)義序列，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔。將這3種microRNA類(lèi)似物分別轉(zhuǎn)染到3T3-L1細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞在6或12孔板中分化培養(yǎng)到第8天，用PBS（含10%福爾馬林）在室溫下固定1 h，再用蒸餾水沖洗孔板3次。用含0.5%油紅O染色1 h，之后用異丙醇或PBS清洗，即可在顯微鏡下觀(guān)察。之后，用異丙醇溶解脂滴，在酶標(biāo)儀上檢測(cè)550 nm吸光度值，其中脂肪分化程度和油滴大小與吸光度成正相關(guān)。

1.2.6 定量RT-PCR 將上述1.2.5中的3種miRNA類(lèi)似物分別轉(zhuǎn)染到3T3-L1細(xì)胞，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔，當(dāng)細(xì)胞在6或12孔板中分化培養(yǎng)到第8天，裂解細(xì)胞釋放mRNA，隨后利用反轉(zhuǎn)錄和RT-PCR檢測(cè)與脂質(zhì)生成和分解相關(guān)基因mRNA表達(dá)情況，10 μL反應(yīng)體系：GoTaq@qPCR Master Mix（2×）5 μL，正、反向引物（10 μmol/L）各0.2 μL，CXR 0.1 μL，cDNA 1μL，ddH2O 3.5 μL。反應(yīng)程序：95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)，采用2-△△Ct方法計(jì)算基因表達(dá)量。RT-PCR所用引物如表1。

表1 RT-PCR引物Table 1 RT-PCR primers

1.2.7 miR-378基因的擴(kuò)增以及基因型判定 在Ensembl豬 基 因 組 數(shù) 據(jù) 庫(kù)（http：//www.ensembl.org/Sus_scrofa/Info/Index）中獲取位于十二號(hào)染色體miR-378附近的基因序列。采用Primer3軟件在線(xiàn)（http：//bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/）設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物（表2）。用 Q5超保真DNA聚合酶配置50 μL PCR反應(yīng)體 系：5×reaction buffer 10 μL；MgCl2（15 mmol）1.5 μL；dNTPs（10 mmol/L）1.0 μL；forward primers（10 μmol/L）2.5 μL；rorward primers（10 μmol/L）2.5 μL；Template DNA（50 ng/μL）2.0 μL；Q5 highfidelity DNA polymerase 0.5 μL；加水至 50 μL。采用凝膠回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物。隨后采用ABI公司 3730 基因序列分析儀以下游引物進(jìn)行反向測(cè)序。將測(cè)序峰圖文件比對(duì)到基因組參考序列中，根據(jù)峰圖結(jié)果判斷該位置基因型，如果為G堿基單峰則基因型為GG型；如果為A/G雙峰同時(shí)出現(xiàn)則基因型為AG型；如果為A堿基單峰基因型為AA型。

表2 miR-378擴(kuò)增引物Table 2 Amplification primer of miR-378

1.2.8 miR-378種子序列多態(tài)性與表型的相關(guān)性分析 挑選同一批次、相同飼養(yǎng)條件、相近的屠宰體重（100 kg左右）的榮昌豬雜交群體進(jìn)行屠宰性能測(cè)定，收集基因分型群體的生長(zhǎng)、胴體性狀指標(biāo)并與基因型和個(gè)體編號(hào)一一對(duì)應(yīng)，建立如下的固定效應(yīng)模型，采用 SAS 統(tǒng)計(jì)分析軟件包的常規(guī)線(xiàn)形模型過(guò)程（PRO-GLM）進(jìn)行重復(fù)數(shù)不等資料的方差分析和多重比較。

其中，Yijk：個(gè)體胴體肉質(zhì)性狀的觀(guān)測(cè)值；μ：胴體及肉質(zhì)性狀的群體均值；bi：第i個(gè)品種（種群）效應(yīng)（i的不同數(shù)值代表不同的豬種或雜交組合）；hj：第j個(gè)場(chǎng)效應(yīng)值（j的不同數(shù)值代表不同的采樣豬場(chǎng)）；gk：第k個(gè)基因型效應(yīng)（k=1、2、3，分別對(duì)應(yīng) AA、AG、GG 基因型）；eijk：隨機(jī)殘差效應(yīng)。

1.2.9 統(tǒng)計(jì)分析 使用Excel 2013進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)整理，用SPSS l9軟件中的Student′s t-test進(jìn)行差異顯著分析，使用Publisher 2013作圖。

2 結(jié)果

2.1 miR-378位點(diǎn)突變遺傳效應(yīng)分析

豬12染色體上miR-378位位點(diǎn)的坐標(biāo)為38 396 700-38 396 767，存在于TBX2和BCAC3之間的基因間區(qū)。將榮昌豬和亞洲野豬重測(cè)序數(shù)據(jù)與豬參考基因組對(duì)比，找到了大量的SNP位點(diǎn)，以每100 kb窗口內(nèi)的SNP為統(tǒng)計(jì)單元進(jìn)行群體遺傳選擇分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與亞洲野豬相比，榮昌豬miRNA-378所在區(qū)域的Tajima′s D值更偏離零（約-6），表明這個(gè)區(qū)域存在大量的低頻等位基因位點(diǎn)，同時(shí)它在榮昌豬中的Z（Hp）值小于-2（約-4.5）且Z（FST）值大于2（約2.5），說(shuō)明在榮昌豬的馴化過(guò)程中，miRNA-378位于一個(gè)受到強(qiáng)烈選擇的基因組區(qū)域中（圖1）。

圖1 miR-378位點(diǎn)在榮昌豬和亞洲野豬中的群體遺傳選擇分析Fig.1 Population genetic selection analysis of miR-378 locus in Rongchang pig and Asian wild boar

與參考基因組序列對(duì)比發(fā)現(xiàn)，在榮昌豬miRNA-378-3p的功能核心區(qū)——種子序列中，第5位堿基出現(xiàn)一個(gè)由A到G的單堿基突變（A>G）。這個(gè)突變導(dǎo)致miRNA-378前體的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著變化，其莖結(jié)構(gòu)上的凸環(huán)顯著變小；自由能由原來(lái)的-23.00 kcal/mol變?yōu)?26.90 kcal/mol，下降17.2%（圖2）。這很有可能直接影響成熟miRNA-378的生成以及靶基因的識(shí)別，從而直接改變其功能上的表現(xiàn)。

圖2 miR-378野生型（miR-378W）和突變型（miR-378M）二級(jí)結(jié)構(gòu)以及自由能分析Fig.2 Secondary structure and free energy analysis of miR-378 wild type（miR-378W）and mutated type（miR-378 M）

通過(guò)統(tǒng)計(jì)不同豬種重測(cè)序數(shù)據(jù)在該突變位點(diǎn)的基因頻率發(fā)現(xiàn)，在亞洲野豬中A和G的基因頻率接近0.5；在長(zhǎng)白豬和杜洛克豬種中等位基因A的頻率接近1；而在中國(guó)12個(gè)地方豬種和2個(gè)國(guó)外豬種（約克夏豬和皮特蘭豬）中該位點(diǎn)等位基因的比例不盡相同，其中香豬G等位基因的頻率最高，內(nèi)江豬A等位基因的頻率最高，這可能與人工選擇的強(qiáng)度大小有關(guān)（圖3）。

圖3 miR-378種子序列第5位堿基（A/G）在不同豬種中的等位基因頻率Fig.3 Allele frequency of the fifth base（A/G）of miR-378 seed sequence in different pig breeds

2.2 miR-378突變對(duì)脂肪細(xì)胞分化以及脂質(zhì)相關(guān)基因表達(dá)的影響

miRNA-378已經(jīng)被報(bào)道在脂肪沉積等過(guò)程中起重要作用。為了驗(yàn)證種子序列的突變是否改變了miRNA-378的功能，我們將野生型（miR-378W）和突變型（miR-378M）類(lèi)似物轉(zhuǎn)染至3T3-L1前脂肪細(xì)胞中，檢測(cè)各組脂質(zhì)沉積情況。在誘導(dǎo)分化第8天，兩種miRNA表達(dá)水平具有極顯著增加，與Control相比，miR-378W提高了~15倍且miR-378M 提高了~21倍（圖4-A）。油紅O染色發(fā)現(xiàn)，與Control組相比，miR-378W組的脂滴累積明顯增加，而miR-378M組脂滴累積并不明顯（圖4-B）。通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)550 nm吸光度值，對(duì)脂滴含量進(jìn)行定量分析也發(fā)現(xiàn)，miR-378W組的脂滴含量極顯著高于Control組和miR-378M組，miR-378M組與Control組的脂滴含量差異不顯著（圖4-C）。這說(shuō)明miR-378能促進(jìn)脂質(zhì)沉積，然而其種子序列突變后缺失了促脂生成的功能。

圖4 miR-378W和miR-378M對(duì)脂肪細(xì)胞脂質(zhì)生成的影響Fig.4 Effects of miR-378W and miR-378 M on the lipid production of adipocytes

隨后在脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中，通過(guò)對(duì)脂肪生成相關(guān)基因進(jìn)行表達(dá)量分析發(fā)現(xiàn)，與Control組相比，脂肪生成相關(guān)基因PPAR-γ、PGC-1α和PGC-1β在miR-378W組表達(dá)量顯著升高，而在miR-378M組除了PPAR-γ，其他基因的表達(dá)量沒(méi)有變化（圖5-A）；而在miR-378W組，脂肪分解相關(guān)基因HSL、ATGL和CGI-58的表達(dá)水平有顯著下降，而miR-378M組卻沒(méi)有變化（圖5-B）。這表明miR-378種子序列的突變的確改變了對(duì)某些脂質(zhì)相關(guān)基因的調(diào)控作用。

圖5 miR-378W和miR-378M對(duì)脂質(zhì)相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.5 Effects of miR-378W and miR-378 M on the expression of lipid related genes

2.3 miRNA-378種子序列多態(tài)性與表型的相關(guān)性分析

miR-378成熟體序列以及其種子序列在10個(gè)物種間（豬、人、大鼠、小鼠、牛和羊等）具有高度保守（圖6），同時(shí)由2.2可知，種子序列的突變改變了miR-378促進(jìn)脂質(zhì)生成的功能以及對(duì)相應(yīng)基因的調(diào)控作用，因此miR-378極有可能是具有重要功能的經(jīng)濟(jì)性狀調(diào)控位點(diǎn)。

圖6 miR-378在10個(gè)物種間的堿基序列比對(duì)Fig.6 Base sequence alignment of miR-378 among 10 species

為此，我們?cè)?07頭榮昌豬雜交群體中利用PCR擴(kuò)增測(cè)序發(fā)現(xiàn)了該突變位點(diǎn)存在3種基因型（AA、GG和AG）（圖7），其中AA型32頭、GG型24頭、AG型51頭。隨后將這些豬的屠宰測(cè)定數(shù)據(jù)與該位點(diǎn)基因型進(jìn)行性狀關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果表明在最小二乘均值方面，最后肋骨處背膘厚性狀表現(xiàn)出GG>AG>AA的趨勢(shì)，并達(dá)到顯著水平（P<0.05），3個(gè)基因型個(gè)體最小二乘均值分別為（2.77±0.20）cm、（2.66±0.13）cm 和（2.63±0.16）cm。GG基因型個(gè)體的最后肋骨處眼肌面積顯著低于AA基因型個(gè)體。A等位基因在降低最后肋骨處背膘厚，增大眼肌面積，提高胴體瘦肉率方面的加性效應(yīng)分別為0.07 cm、1.22 cm2和 0.32%，顯性效應(yīng)分別為-0.04 cm、0.445 cm2和0.07%（表3）。

表3 miR-378種子序列3種基因型在群體中的個(gè)體數(shù)及與屠宰性狀之間的關(guān)聯(lián)分析Table 3 Number of individuals for three genotypes of miR-378 seed sequence in the population and their association with slaughter traits

圖7 榮昌豬雜交群體中miR-378種子序列多態(tài)性測(cè)序峰圖Fig.7 Polymorphism of miR-378 seed sequence in Rongchang pig cross population

3 討論

人工選擇是影響家畜群體基因平衡的重要因素［22］，而榮昌豬12號(hào)染色體miR-378位點(diǎn)具有極強(qiáng)的人工選擇信號(hào)；同時(shí)榮昌豬miR-378-3p種子序列第5位發(fā)生了突變（A>G）；但是這個(gè)突變位點(diǎn)在不同豬種中受到的人工選擇卻大不相同，在自然狀態(tài)下，亞洲野豬A和G的基因型頻率是相同的，然而在受到強(qiáng)烈人工選擇的長(zhǎng)白豬和杜洛克豬種中G基因型消失了，在其他家豬中也出現(xiàn)了G基因頻率不同程度的下降，這說(shuō)明人工選擇更趨向于保留A基因型，且人工選擇強(qiáng)度越大A基因頻率越高。除此之外，我們還在外種豬（皮特蘭豬和約克夏豬）中也發(fā)現(xiàn)了G基因型，這與Chai等［15］認(rèn)為G基因型只存在于中國(guó)地方豬種的結(jié)論相矛盾。

miRNA的突變通常會(huì)改變其pri-miRNAs或premiRNAs的二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而影響剪切效率，最后導(dǎo)致成熟miRNA表達(dá)量的變化。在人MLL-AF4急性淋巴細(xì)胞性白血病中，Kotani等［6］發(fā)現(xiàn)pre-miR-128b序列中出現(xiàn)一個(gè)A>G變異，該突變降低primiR-128b的加工效率，導(dǎo)致成熟體miR-128b的表達(dá)量顯著下調(diào)；Sun等［7］發(fā)現(xiàn)莖環(huán)結(jié)構(gòu)上的C>T突變改變了pre-miR-15b的二級(jí)結(jié)構(gòu)和自由能，影響了pre-miR-15b的生物加工過(guò)程；Duan等［9］發(fā)現(xiàn)miR-125a種子序列第八位G>T的突變影響了與剪切酶的結(jié)合，最終導(dǎo)致成熟體表達(dá)量發(fā)生改變。而本研究也發(fā)現(xiàn)miR-378-3p種子序列第5位A>G的突變使得其莖環(huán)結(jié)構(gòu)變小以及自由能下降，這會(huì)導(dǎo)致pri-miR-378二級(jí)結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，有利于提高Drosha酶對(duì)pri-miR-378的剪切效率，促進(jìn)pri-miR-378到pre-miR-378的加工過(guò)程。

種子序列是動(dòng)物miRNA識(shí)別并結(jié)合靶基因的關(guān)鍵功能元件，種子序列的突變會(huì)直接導(dǎo)致miRNA功能的改變。大量研究證明，miR-378在脂肪組織中具有較高的表達(dá)水平，能夠在脂肪細(xì)胞中調(diào)控C/EBP-α和C/EBP-β基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化、脂質(zhì)的增加［11］。的確，我們通過(guò)microRNA 類(lèi)似物的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了miR-378具有促脂肪生成的作用，但種子序列A>G的突變導(dǎo)致了miR-378缺失了相應(yīng)的功能，這與先前的報(bào)道一致［15］。同時(shí)脂肪細(xì)胞在脂質(zhì)沉積過(guò)程中，不僅受到脂肪分化相關(guān)基因的影響，而且也會(huì)受脂肪分解代謝相關(guān)基因的影響。PGC-1α和PGC-1β對(duì)脂肪細(xì)胞分化、線(xiàn)粒體合成以及能量代謝具有重要的調(diào)節(jié)作用［23-24］；PPAR-γ能調(diào)控脂肪分化相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，降低脂肪分解速度［25］。而ATGL和HSL是重要的脂肪分解酶，二者可共同作用通過(guò)催化甘油三酯水解形成游離脂肪酸，調(diào)節(jié)脂肪分解代謝過(guò)程［26-27］；而CGI-58 是 ATGL 的激活劑［28］。本研究發(fā)現(xiàn)miR-378W可以通過(guò)上調(diào)與脂肪分化相關(guān)基因（PGC-1α、PGC-1β、PPAR-γ）的表達(dá)和下調(diào)與脂肪分解相關(guān)基因（ATGL、HSL、CGI-5）的表達(dá)兩種途徑來(lái)影響脂質(zhì)生成。但很遺憾，我們并沒(méi)有在這些與脂肪生成、分解直接相關(guān)基因的3′ UTR區(qū)發(fā)現(xiàn)miR-378的結(jié)合位點(diǎn)，這可能是通過(guò)一些其他通路（如C/EBP-α等）間接調(diào)控這些基因。然而除了PPAR-γ以外，miR-378M并未影響其他基因的表達(dá)，說(shuō)明種子序列突變改變了miR-378在脂肪細(xì)胞中的基因調(diào)控方式，最終影響細(xì)胞分化和脂質(zhì)沉積的功能。

背膘厚和眼肌面積遺傳力高，二者是豬遺傳育種和性能鑒定中的重要參數(shù)［29］。近年來(lái)，豬的主要選育方向是減小背膘厚度，增加眼肌面積，提高胴體瘦肉率。我們通過(guò)比較豬miRNA-378 種子序列多態(tài)性與屠宰性能測(cè)定數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，與突變GG型相比，野生純合子AA型和雜合子AG型的背膘厚有顯著的減小，這與miR-378敲除的小鼠皮下脂肪體積減少的現(xiàn)象相一致；而AA型的眼肌面積比GG型有顯著的增加；再加之前面闡述的人工選擇強(qiáng)度越大A基因頻率越高的特點(diǎn)，這些發(fā)現(xiàn)都與選育目標(biāo)十分吻合。除此之外，我們還發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞水平驗(yàn)證得出的脂肪沉積能力野生型（AA）大于突變型（GG）的結(jié)論與豬背膘厚GG>AG>AA的趨勢(shì)相悖，而miRNA-378對(duì)于脂肪組織（背膘）和肌肉組織（眼肌）的大小有著相反的作用結(jié)果，這可能與miR-378調(diào)控細(xì)胞的增殖和凋亡的功能相關(guān)。組織大小是由細(xì)胞在發(fā)育過(guò)程中的數(shù)量決定的，主要表現(xiàn)在增殖和凋亡兩方面［30］，miRNA-378在不同細(xì)胞中扮演者不同的作用，如miRNA-378可靶向BRAF抑制大腸癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡［31］；能降低SDAD1表達(dá)來(lái)抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖［32］；下調(diào)KLF9促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞增殖［33］；抑制骨髓增生異常綜合征細(xì)胞生長(zhǎng)和促進(jìn)凋亡［34］等。然而在脂肪細(xì)胞中miRNA-378能促進(jìn)細(xì)胞凋亡［35］，所以AA型雖然能促進(jìn)脂肪增加，但減少了細(xì)胞數(shù)量降低背膘厚度；在肌細(xì)胞中miRNA-378能抑制細(xì)胞凋亡［36］，故AA型能增加細(xì)胞數(shù)量，提升眼肌面積。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)了豬miR-378位點(diǎn)具有極強(qiáng)的人工選擇信號(hào)，其種子序列的多態(tài)性不僅改變了miR-378的功能，而且與豬的背膘厚度和眼肌面積指標(biāo)顯著相關(guān)，該位點(diǎn)可作為豬遺傳分子標(biāo)記用于豬的育種實(shí)踐中。