水稻表皮毛發(fā)育相關基因研究進展

馮連杰 安文靜 劉迪 劉亞菲 王凱婕 梁衛(wèi)紅

（河南師范大學生命科學學院，新鄉(xiāng) 453007）

表皮毛是廣泛分布于植物表面的一種特殊結構，由表皮細胞分化形成［1］。作為植物表面與環(huán)境之間的屏障，表皮毛增加了植物組織表皮厚度，幫助植物減少水分流失、增強抗凍能力，具腺體的表皮毛還可通過分泌次生代謝產(chǎn)物使植物獲得生化保護，從而增強植物的抗逆能力［2］。水稻葉片和穎殼表面普遍存在表皮毛，可分為長毛、微毛和腺毛，長毛主要分布在維管束的硅質細胞上，而微毛和腺毛主要分布在氣孔或運動細胞的周圍［3］，還有專家將水稻表皮毛細分為長毛、鉤毛、刺毛、纖細毛和鋸齒毛等類型［4］，不同類型的表皮毛在一定程度上反映了水稻品種與其生存環(huán)境的適應關系。但具有表皮毛的毛葉水稻在收割晾曬過程中會產(chǎn)生大量揚塵，造成空氣污染的同時還易引起農(nóng)事人員眼睛及皮膚過敏、呼吸道感染等，危害身體健康，妨礙農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，而缺乏表皮毛的優(yōu)質高產(chǎn)光葉水稻的培育和推廣是解決這一問題的有效途徑［5］。光葉稻作為一種重要的種質資源，大多莖稈粗壯、具有較強抗倒伏能力，對高光強適應性強、成穗率高、籽粒飽滿、米質優(yōu)良，后代雜交優(yōu)勢明顯等特點［6］，尤其是因葉片、莖稈、葉鞘、穎殼等表面光滑無毛，不僅適合現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的機械化操作，而且可增加單位體積稻米的倉儲量，提高運輸效率，更適合現(xiàn)代化農(nóng)業(yè)機械操作［7］。

與擬南芥相比，對水稻表皮毛發(fā)育相關基因的挖掘目前仍然很有限，表皮毛發(fā)育的分子調控網(wǎng)絡很大程度上并不明確。由于表皮毛發(fā)育相關基因的突變可導致水稻產(chǎn)生光葉表型，因此，水稻表皮毛相關基因的鑒定以及表皮毛發(fā)育機制的研究具有重要意義。近年來，一些水稻表皮毛相關基因相繼被鑒定或克隆，已有的研究結果顯示，水稻表皮毛發(fā)育與相關基因的表觀遺傳修飾［8-11］、啟動子序列突變［12-14］、編碼蛋白質序列變化［15-17］有關，此外還涉及細胞器功能異常［18-20］、激素信號通路變化［14］等多種途徑。本文總結了近年來水稻表皮毛相關基因及其功能的研究進展、已知的水稻表皮毛發(fā)育調控途徑，并對水稻表皮毛發(fā)育相關基因研究的前景及應用進行展望。

1 已知的表皮毛發(fā)育相關基因

現(xiàn)有的研究認為，植物表皮毛相關的正負調控因子的平衡決定了表皮毛的發(fā)生［21］。在模式植物擬南芥中，已發(fā)現(xiàn)的正調控因子主要有GL1［22］、GL3［23-24］、EGL3［25］、TTG1［26］。GL1是最先被克隆的基因，編碼R2R3 MYB蛋白，在表皮毛發(fā)育初期特異表達，gl1突變體表現(xiàn)出表皮毛缺失或減少的表型［22］。GL3和EGL3編碼bHLH蛋白，gl3和egl3單突變體均表現(xiàn)為表皮毛減少，gl3 egl3雙突變體則表現(xiàn)為表皮毛缺失，表明GL3和EGL3存在功能冗余［23-25，27］。TTG1編碼WD40重復序列蛋白，該基因的強等位突變體ttg1表現(xiàn)為無毛，而弱等位突變體則表現(xiàn)為表皮毛簇生［26］。由于上述這些基因突變后擬南芥表皮毛減少或缺失，表明它們對表皮毛發(fā)育具有正調控作用。

擬南芥中已發(fā)現(xiàn)的負調控因子主要有TRY［28］、CPC［29］、ETC1［30］和ETC2［30］，它們都屬于R3型MYB蛋白，其中TRY和CPC是主要的負調控因子，調控擬南芥葉片表皮毛的發(fā)育，try突變體表現(xiàn)為表皮毛簇生［28］；cpc突變體表皮毛數(shù)量增多［29］；ETC1和ETC2主要在莖表皮毛中起負調控作用，其中etc2突變體表皮毛增多，etc1突變體盡管沒有明顯的表型，但能增強CPC和TRY在表皮毛發(fā)育中的作用。當同時突變TRY、CPC、ETC1和ETC2后，擬南芥表皮毛劇增［30］，表明這些基因對表皮毛發(fā)生具有抑制作用。

關于擬南芥表皮毛發(fā)育機制，曾提出激活-抑制模型（the activator-inhibitor model）［31］和激活（底物）-消耗模型（the activator-substrate model）［32］，Balkunde［33］認為目前的研究結果皆適用于上述兩個模型，即在擬南芥表皮毛發(fā)育過程中存在一個MBW復合體（GL1/ MYB23-GL3/EGL3-TTG1）來啟動表皮毛的發(fā)育，該復合體還負責調控TRY、CPC、ETC1和ETC2等負調控因子轉移至相鄰的非表皮細胞，并與GL1競爭性的結合GL3，使相鄰細胞由于GL3缺失而導致MBW復合體的含量降低，從而抑制表皮毛的發(fā)生［33-34］。隨著表皮毛發(fā)育研究的不斷深入，上述模型相繼得到拓展。從組蛋白修飾方面進行的研究發(fā)現(xiàn)，組蛋白乙酰轉移酶GCN5通過組蛋白乙?；揎?，上調GL1、GL2、GL3和CPC的表達水平，從而促進了表皮毛的形成［35］。最近，Huang等［36］的研究發(fā)現(xiàn)，組蛋白去甲基化酶JmjC家族成員JMJ29可以直接結合在GL3基因的啟動子上，激活該基因的表達，同時JMJ29還間接調控了GL1和GL2基因的表達，最終促進了表皮毛的發(fā)育。同時，mRNA穩(wěn)定性調控方面的研究也取得重要進展，如Wei等［37］發(fā)現(xiàn)表皮毛發(fā)育相關基因轉錄產(chǎn)物的穩(wěn)定性維持和轉錄因子ETC2相關，ECT2可結合于mRNA上的m6A（N6-methyladenosine）修飾位點，不僅在核內(nèi)參與其3′UTR的加工，而且調節(jié)mRNA在胞質中的穩(wěn)定性，敲除ECT2后，加速了表皮毛發(fā)育相關基因TTG1，ITB1和DIS2轉錄產(chǎn)物的降解，從而影響表皮毛的分枝。最近的研究還發(fā)現(xiàn)GL1基因3′端UTR區(qū)的一段153 bp的序列可能通過影響其mRNA的穩(wěn)定性和轉錄激活特性，在表皮毛形成過程中具有重要作用［38］。一些研究還發(fā)現(xiàn)表皮毛發(fā)育過程涉及蛋白質降解的調控，如E3泛素蛋白連接酶UPL3可通過促進GL3和EGL3的降解，抑制表皮毛的形成［39］。另有一些研究將轉錄因子和激素信號之間的聯(lián)系建立起來，如RAV家族轉錄因子TEM1和TEM2通過控制赤霉素（GA）在葉肉細胞中的累積，抑制表皮毛發(fā)育的起始，且TEM2的抑制作用強于TEM1［40］。上述研究表明，組蛋白修飾、mRNA穩(wěn)定性的調控、蛋白質降解過程以及轉錄因子、植物激素都可以通過調節(jié)表皮毛發(fā)育正負調控因子的表達，進而調控MBW復合體的構建以及在細胞中的含量，從而指導擬南芥表皮毛的形成。盡管現(xiàn)有研究已經(jīng)建立了擬南芥表皮毛發(fā)育的核心模型，但具體的調控網(wǎng)絡仍不清楚［41］。

與擬南芥相比，目前對水稻表皮毛的研究還有待深入，分離鑒定的相關基因或QTL僅涉及表皮毛發(fā)育的正向調控過程。已知的相關基因主要有OsWOX3B（GLR1、NUDA/ GL-1/dep、GL5）［8-11］、GL6（HL6）［12-14］、glr2［15］、GLR3（OsSPL10）［16-17］、gl1［18-19］、GLL［20］等（表1），這些基因的突變往往導致水稻葉片與穎殼表皮毛減少或缺失。

表1 水稻表皮毛發(fā)育已知基因Table 1 Known genes for rice trichomes development

最早被關注的水稻光葉基因是OsWOX3B/GLR1/NUDA/GL-1/dep/GL5，該基因的報道分別來自不同實驗室的獨立研究，其中Li等［8］利用美國水稻品種Rico No. 1和光葉水稻品種Jia64構建了光葉稻的近等基因系（NIL），將光葉基因GLR1精細定位在5號染色體標記M6與M7之間的21 kb內(nèi)，對GLR1進行互補實驗發(fā)現(xiàn)，減弱GLR1表達量可導致表皮毛數(shù)量顯著減少或完全消失，并且在敲除株系NILglr1中組成型表達GLR1能夠彌補T0代NILglr1的無毛表型［8-9］。Zhang等［10］對另一個光葉基因NUDA/GL-1的研究顯示，光葉性狀受該基因隱性遺傳控制，NUDA/GL-1與WUSCHEL-like基因OsWOX3B同源，但OsWOX3B基因在具毛水稻品種TN1和光葉稻品種HMK中并沒有DNA水平的差異，因而推測NUDA/GL-1產(chǎn)生的無毛表型可能由表觀遺傳修飾引起［10］。Angeles-Shim等［11］也發(fā)現(xiàn)了該光葉基因并將其命名為dep，其編碼蛋白WOX 3B定位于細胞核中，然而對無毛品種與具毛品種的dep序列比較并未發(fā)現(xiàn)差異，提示控制光葉性狀的dep基因可能也涉及表觀遺傳修飾作用的調節(jié)。但是究竟是何種表觀遺傳修飾在控制OsWOX3B/GLR1/ NUDA/GL-1/dep/GL5的表達尚未見報道。

光葉基因HL6/GL6編碼含AP2保守結構域的蛋白，對該基因的研究也來自不同實驗室的報道，其中Sun等通過互補實驗證明HL6以劑量依賴性調節(jié)長毛的生長，HL6過表達會導致水稻葉片表皮毛更長，并推測HL6的啟動子序列變異可能是ZS97與W39水稻分別產(chǎn)生無毛和多毛表型的原因［12］。Zeng等將GL6定位在6號染色體，其編碼蛋白GL6位于細胞核內(nèi)，GL6可與絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶OSK3或COP9復合體（CSN）的亞基CSN5相互作用［13-14］，盡管OSK3功能尚不明確，但已知COP9信號體復合體在調控基因表達、細胞發(fā)育和細胞周期等方面都發(fā)揮著重要作用［42］，提示GL6蛋白可能在細胞核中與CSN5結合，參與形成CSN復合物，調節(jié)表皮毛發(fā)育進程。

基于光葉水稻突變體glr2的研究，Wang等［15］將突變基因定位于1號染色體的84.7 kb區(qū)間，并對其間的12個候選基因進行qRT-PCR檢測分析，結果顯示Loc_Os01g70100、Loc_ Os01g70080和Loc_Os01g70110在野生型與突變體中表達水平存在較大差異，其中Loc_Os01g70100編碼一個鋅指轉錄因子。由于已知在擬南芥中有4種鋅指轉錄因子（GIS1，GIS2，ZFP5，ZFP8）與表皮毛發(fā)生有關［43-44］，因而推測Loc_Os01g70100可能與水稻的光葉表型有關。

在秈稻品種R401輻射誘變過程中篩選到一個光葉突變體glr3［16］，該突變體表現(xiàn)為葉片無毛且邊緣無鉤毛、穎殼無毛，該性狀受定位于6號染色體上的隱性基因GLR3控制，GLR3屬于SBP-box基因家族成員，與OsSPL10為同一個基因。Lan等［17］分別構建了OsSPL10的突變體與過表達水稻發(fā)現(xiàn)，OsSPL10功能喪失導致了水稻葉片與穎殼無毛，以及更高的耐鹽性，而過表達的OsSPL10則導致水稻表皮毛密度高于野生型，且對鹽具有高敏感性，據(jù)此推測OsSPL10可能是控制表皮毛發(fā)育起始過程中的一個轉錄因子。

光葉基因gl1-1也是來自輻射誘變水稻品種93-11制備的光葉突變體，該基因定位于5號染色體，序列對比發(fā)現(xiàn)，與野生型序列相比，gl1-1基因的序列僅在Os05g0118900（Loc_Os05g02754）的5′UTR區(qū)存在一個A→T的點突變，這一突變引起了RNA二級結構發(fā)生劇烈變化，導致該突變體表現(xiàn)出穎殼無毛、葉片無宏毛和微毛的表型［18-19］。王啟釗［45］等進一步證明gl1-1編碼一個葉綠體跨膜蛋白，但迄今該基因與表皮毛發(fā)育之間的聯(lián)系尚未闡明。

還有一些光葉基因的分離來自T-DNA標簽技術制備的光葉突變體，如定位在6號染色體上的GLL基因［20］，GLL主要在細胞核中表達，屬于PEX11基因家族成員。已知PEX11家族編碼過氧化物酶體蛋白，而植物中過氧化物酶體是極長鏈脂肪酸β-氧化的唯一場所［46］，所以該基因可能與脂類代謝相關。有研究顯示，與長鏈脂肪酸相關基因的異常表達可提高細胞內(nèi)極長鏈脂肪酸的含量，從而導致葉表皮毛細胞的程序性死亡［47］，據(jù)此推測GLL可能通過參與極長鏈脂肪酸的代謝過程，影響葉片表皮細胞的分化，并最終決定表皮毛的存亡。

2 水稻表皮毛發(fā)育的分子機制

水稻表皮毛的發(fā)育是一個十分復雜的過程，盡管一些水稻表皮毛相關基因陸續(xù)得到定位與克隆，但水稻表皮毛發(fā)育的分子機制很大程度上仍是未知的。對水稻光葉基因的研究顯示，表觀遺傳修飾作用于一些基因可導致光葉表型，如OsWOX3B/GLR1/NUDA/GL-1/dep/ GL5［8-11］；一些基因表達水平的改變也可導致光葉表型，如GL6/HL6［12-14］；多種轉錄因子編碼基因的突變也可以導致光葉表型，如編碼鋅指轉錄因子基因glr2［15］和SBP蛋白編碼基因GLR3（OsSPL10）［16-17］。此外，一些細胞器相關基因突變也會導致光葉表型，如編碼葉綠體跨膜蛋白的基因gl1［18-19］和編碼過氧化物酶體蛋白的基因GLL［20］。與擬南芥類似的是，在水稻中也發(fā)現(xiàn)植物激素涉及表皮毛的發(fā)育，目前已知的是生長素信號與表皮毛發(fā)育相關，如HL6通過誘導生長素相關基因OsYUCCA5、OsPIN1a、OsARF4、OsARF7和OsIAA21的表達，促進表皮毛的伸長，并通過與OsWOX3B物理結合加強這一促進效應［14］（圖1）。

圖1 水稻光葉表型獲得的主要途徑Fig. 1 Main pathways to obtain glabrous leaf phenotype in rice

在擬南芥中，除多種表皮毛發(fā)育正向和負向調節(jié)因子外，表皮毛的發(fā)育還受細胞周期調控因子和赤霉素、茉莉酸等多種植物激素的影響［48-51］，為水稻表皮毛發(fā)育機制的研究提供了借鑒和參考。值得關注的是，現(xiàn)有的研究顯示單子葉植物與雙子葉植物的表皮毛調控網(wǎng)絡也存在一定的差異，如水稻OsTCL1與擬南芥AtTCL1屬于同源基因，AtTCL1過表達擬南芥的表皮毛形成被抑制，但是OsTCL1過表達水稻與對照水稻相比，表皮毛并沒有出現(xiàn)明顯差異［52］。

3 總結與展望

目前對水稻光葉基因的研究多以光葉突變體為材料，通過經(jīng)典的圖位克隆確定相關QTL，進一步分離突變基因，并采用轉基因技術鑒定基因在表皮毛發(fā)育中的功能。擬南芥中，激活-抑制模型和激活（底物）-消耗模型得到越來越多的實驗結果印 證，在水稻中是否也存在類似的模型來解釋表皮細胞分化的命運，并指導水稻表皮毛的形成尚不清楚，因此有必要對水稻表皮毛發(fā)育相關基因開展更為系統(tǒng)深入的研究，闡明水稻表皮毛發(fā)育的分子機制和調控網(wǎng)絡，解析光葉表型形成的分子基礎，為光葉稻的育種奠定理論基礎。

發(fā)掘新的水稻光葉相關基因，并將已知的水稻光葉基因運用到光葉稻育種中進行高效、精準的改良具有重要意義，同時也富有挑戰(zhàn)性。隨著CRISPR/Cas9基因編輯等技術的發(fā)展，水稻功能基因鑒定和應用的步伐加快，如Wang等［53］以秈粳雜交稻春優(yōu)84作為水稻無融合生殖研究的模式品種，利用CRISPR/Cas9基因編輯技術敲除了其中的REC8，PAIR1，OSD1 和 MTL4個水稻生殖相關基因，建立了水稻無融合生殖體系，成功克隆出雜交稻種子，首次實現(xiàn)雜交稻性狀穩(wěn)定遺傳到下一代，不僅證明了雜交稻進行無融合生殖的可行性，而且證明了CRISPR/ Cas9技術在水稻高效精準分子設計育種中的重大理論意義以及廣闊的應用前景。近期本實驗室通過CRISPR/Cas9技術構建了OsRhoGAP2基因編輯水稻，其中一個純和株系就出現(xiàn)光葉表型［54］?，F(xiàn)有的報道顯示，水稻光葉突變體表型復雜多樣，同一光葉稻基因不僅可以控制表皮毛的發(fā)育，還可控制表皮毛的種類；相同的等位基因在不同的遺傳背景下，也可導致水稻產(chǎn)生的不同的光葉表型，因此分離鑒定光葉表型相關基因，深入剖解其作用機制，將有助于充分利用基因資源開展分子設計育種，創(chuàng)制新的光葉水稻品種，服務生產(chǎn)。