不同品種和產區寧夏枸杞根系AMF多樣性

呂燕 劉建利 李靖宇 候琳琳 孫敏 茍琪

（北方民族大學生物科學與工程學院，銀川 750021）

寧夏枸杞（Lycium barbarum L.）為茄科，枸杞屬，多年生落葉灌木，是典型藥食同源性植物，是寧夏、甘肅、青海、內蒙古、新疆等少數民族地區脫貧的重要經濟林品種，由于其極強耐旱、耐鹽堿、耐貧瘠和抗沙荒等環境適應能力，也是西北地區干旱區生態恢復、鹽堿地改良的首選土著植物［1］。枸杞之所以成為一種典型的生態和經濟功能兼備的植物，其根際微生物在提高枸杞抗逆性方面具有重要的作用［2］。

叢枝菌根真菌（arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）屬于真菌的Glomeromycotina亞門，是最普遍的植物共生微生物之一，借助其菌絲網絡，AMF幫助植物吸收營養物質，提高對非生物脅迫和生物脅迫的抗性，從而影響植物的健康［3-4］，提高植物的生產力［5］。AMF在寧夏枸杞適應鹽脅迫、干旱脅迫中發揮重要作用。劉洪光［6］研究發現，接種Glomus versiforme能調節寧夏枸杞內源激素緩解鹽脅迫抑制作用，促進枸杞根系的生長發育，保證枸杞對水分和養分的吸收；韋素貞［7］研究發現，接種Rhizophagus irregularis能增強干旱脅迫下寧夏枸杞抗氧化酶體系的活力、光合作用以及鉀離子通道基因的表達，促進植物對鉀離子的吸收；張海涵［8］研究發現接種AMF和DSE提高了寧夏枸杞耐旱能力。

AMF多樣性受氣候、植被和土壤理化性質等環境因子變化的影響［9］。寧夏枸杞中也已開展相關研究，肖龍敏等［10］采用巢氏PCR-DGGE研究發現，寧夏枸杞根際AMF定殖和多樣性受種植年限的影響，且隨著種植年限增加多樣性存在下降趨勢；劉洪光［6］發現土壤肥力影響AM真菌多樣性指數，不同的宿主會影響AMF的群落結構。張海涵［8］采用巢氏PCR-DGGE研究不同品種和不同產區枸杞根際土壤AMF群落，發現季節和品種影響AMF 群落多樣性。唐明等［11］、劉洪光［6］亦采用濕篩傾析法研究寧夏枸杞根系土壤中AMF的孢子和孢子果分布，發現不同的采樣地點枸杞AMF α-多樣性指數和群落組成存在差異。

AMF不僅以菌絲網和孢子廣泛分布于植物根區土壤中，更重要的是侵入植物根系內形成叢枝或泡囊等共生結構［12］。根系AMF由于占據獨特的生態位而具有特殊的功能，有研究表明，根系AMF群落與植物根區土壤AMF群落不同［13-14］。以上研究均以寧夏枸杞根區土壤中AMF為研究材料，而對根系AMF并未關注。

本研究以不同品種、不同產區寧夏枸杞根系為材料，采用AMF特異性引物擴增后，基于Illumina Miseq測序平臺進行測序，研究寧夏枸杞根系AMF多樣性及群落組成，探究品種與產區對AMF群落的影響以及AMF與果實有效成分相關性，為寧夏枸杞AMF菌劑開發奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

4個寧夏枸杞品種的樹齡均為3年，采集其根系和果實樣品，每個品種3個生物學重復：“寧杞7號”品種（“N7”）3個重復（“JYAG”、“JYBG”、“JYCG”），“寧杞9號”品種（“N9”）3個重復（“JYGG”、“JYHG”、“JYTG”），“蒙杞1號”品種（“M1”）3個重復（“JYKG”、“JYLG”、“JYMG”），“蒙杞2號”品種（“M2”）3個重復（“JYPG”、“JYRG”、“JYSG”），均來自甘肅靖遠縣五合鄉田窩村。

4個不同寧夏枸杞產區根系和果實樣品，品種均為“寧杞7號”，樹齡均為3年，每個產區3個生物學重復：寧夏中寧產區（“Zhongning”）3個樣品（“ZNAG”、“ZNBG”、“ZNCG”），甘肅靖遠產區（“Gansu”）3個樣品（“JYAG”、“JYBG”、“JYCG”），寧夏海原產區（“Haiyuan”）3個樣品（“GYAG”、“GYBG”、“GYCG”），內蒙古烏拉特產區（“inner mongolia”）3個樣品（“NMAG”、“NMBG”、“NMCG”）。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理 用自來水沖洗掉枸杞根上黏附泥土，再在無菌條件下用無菌水洗3次，用70%乙醇消毒4 min，無菌水沖洗3次，5%次氯酸鈉消毒5 min，無菌水沖洗3次，0.1%氯化汞消毒3 min，無菌水沖洗3次，置于滅菌濾紙上晾干，-70℃冷凍保存。

1.2.2 DNA抽提、18S rDNA序列擴增及高通量測序 參照基因組DNA提取試劑盒說明（MoBio Power Fecal ? DNA Isolation Kit）提取樣品總基因組DNA，Nanodrop2000檢測DNA純度和濃度；1%瓊脂糖凝膠檢測DNA完整性。采用2對特異性引物進行PCR擴增，第一輪擴增引物為AML1/AML2（5′-ATCAACTTTCGATGGTAGGATAGA-3′；5′-GAACCCAAACACTTTGGTTTCC-3′），PCR反應體系為5×FastPfu Buffer 4 μL、2.5 mmol/L dNTPs 2 μL、Forward Primer（5 μmol/L）0.8 μL、Reverse Primer（5 μmol/L）0.8 μL、FastPfu Polymerase 0.4 μL、BSA 0.2 μL、Template DNA 10 ng，補ddH2O至20 μL；擴增程序為95℃ 3 min；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 45 s，32個循環；72℃ 10 min；第二輪擴增引物為AMV4.5NF/AMDGR（5′-AAGCTCGTAGTTGAATTTCG-3′；5′-CCCAACTATCCCTATTAATCAT-3′）［15］，擴增程序為95℃ 3 min；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 45 s，30個循環；72℃ 10 min。將PCR產物進行文庫構建，Miseq測序：PE250平臺由上海美吉生物醫藥科技有限公司完成。

1.2.3 生物信息學分析 Miseq測序得到的PE reads首先根據overlap關系進行拼接，對序列質量進行質控和過濾，導入上海美吉生物醫藥科技有限公司交互式微生物多樣性云分析平臺（http：//www.i-sanger.com/），區分樣本后進行OTU按97%相似度聚類，按最小樣品序列數抽平樣本序列，形成新OTU表，選擇每個OTU的代表序列比對數據庫Maarjam081/AM［16］，將序列相似度≥97%，查詢序列對齊長度≥95%，e值<1e-50視為虛擬分子種（virtual taxa，VTs）［17］。

物種組成、物種差異、樣本比較等分析參數設置如下：合并低于1%的OTU；物種、樣本層級聚類方式用average，分組的樣本豐度計算用均值；多重檢驗校正fdr后檢驗Tukey；多組比較策略oneagainst-all。

1.2.4 枸杞鮮果中活性成分含量測定 甜菜堿含量測定采用雷氏鹽比色法［18］，總糖、總黃酮含量測定采用比色法［19］。

2 結果

2.1 α-多樣性分析

從不同品種和不同產區樣品中分別獲得132 972和130 948條有效序列，平均長度為237.63 bp和237.48 bp，所有樣品的coverage均達到1.00，測序深度能真實反應樣品中AMF物種多樣性（表1和表2）。衡量物種多樣性Shannon指數在品種間由高到低依次為“寧杞7號”>“寧杞9號”>“蒙杞1號”>“蒙杞2號”，而產區間無顯著性差異，Simpson指數反映出的顯著性差異結果和Shannon指數一致。反映樣品豐富度ACE指數中“寧杞7號”最高，而在“寧杞9號”、“蒙杞1號”與“蒙杞2號”之間無顯著差異，產區間無顯著性差異，Chao1指數反映出的多樣性大小和ACE指數一致。反映樣品均勻度Heip指數的與ACE指數顯著性差異一致。因此，品種影響寧夏枸杞根系AMF群落α-多樣性指數，“寧杞7號”最高，“蒙杞2號”最低，而產區無影響。

表1 不同品種樣品中AMF α-多樣性指數Table 1 α-diversity index of arbuscular mycorrhizal fungi in different varieties samples based on OTU

表2 不同產區樣品中AMF α-多樣性指數Table 2 AMF α-diversity index in samples from different cultivation regions

2.2 物種組成分析

所有寧夏枸杞根系樣品中共獲得49個AMF OTUs，屬于真菌界球囊菌亞門球囊菌綱3個目（球囊霉目、類球囊霉目和球囊菌綱未鑒定目）3個科（球囊霉科、類球囊霉科和球囊菌綱未鑒定科）3個屬23個種。

在屬水平，4個寧夏枸杞品種和4個不同產區AMF豐度>1%的屬有球囊霉屬（Glomus）、根孢囊霉屬（Rhizophagus）、近明球囊霉屬（Claroideoglomus）和未知屬（unclassified_c_Glomeromycetes）4種。“蒙杞1號”品種球囊霉屬（Glomus）所占比例高達97.9%，“寧杞9號”和“蒙杞2號”品種所占比例為66.7%，“寧杞7號”品種為79.7%；“蒙杞1號”品種根孢囊霉屬（Rhizophagus）所占比例為1.7%，“寧杞7號”和“蒙杞2號”品種所占比例為18.0%和33.3%；“寧杞9號”品種未知屬（unclassified_c_Glomeromycetes）所占比例為32.5%（圖1-A）。“海原”產區球囊霉屬（Glomus）所占比例為96.3%，“甘肅”產區為81.2%；根孢囊霉屬（Rhizophagus）僅在“甘肅”產區出現，占比為18.0%；“內蒙古”產區和“中寧”產區只出現球囊霉屬（Glomus）和球囊菌綱未知屬（unclassified_c_Glomeromycetes）2種，占比分別為66.7%、33.3%和66.6%、32.9%（圖2-A）。球囊霉屬（Glomus）是4個品種和4個產區的優勢屬，根孢囊霉屬（Rhizophagus）為“寧杞7號”、“蒙杞1號”和“蒙杞2號”品種和“甘肅”產區的次優勢屬；所有屬在所有品種（圖1-B）和所有產區（圖2-B）樣品中無顯著性差異。

圖1 屬水平不同寧夏枸杞品種樣品中AMF相對分布圖Fig.1 Relative abundance of AMF genus among different varieties

圖2 屬水平不同寧夏枸杞產區樣品中AMF相對分布圖Fig.2 Relative abundance of AMF at genus level among cultivated regions

在種水平，4個品種寧夏枸杞根系AMF豐度>1%的有9個VTs和3個未鑒定的球囊霉菌（表3），4個產區根系AMF豐度>1%的有12個VTs和2個未鑒定的球囊霉菌（表4）。所有樣品共有種為Glomus.sp.VTX00113，Glomus.sp.VTX00113為“寧杞7號”、“蒙杞1號”品種的優勢種；“寧杞9號”品種的優勢種為Glomus.sp.VTX00156，為“寧杞7號”品種的次優勢種，“蒙杞2號”品種AMF種最少，優勢種為Rhizophagus intraradices VTX00100、Glomus.sp.VTX00113和Glomus.sp.VTX00393。“海原”產區和“甘肅”產區的優勢種為Glomus.sp.VTX00113，次優勢種為Glomus.sp.VTX00156；“內蒙古”產區和“中寧”產區的優勢種分別為未鑒定出的球囊霉菌unclassified_OTU32和unclassified_OTU39，次優勢種分別為Glomus.sp.VTX00301和Glomus.sp.VTX00155。所有AMF種在4個寧夏枸杞品種根樣品中無顯著差異（圖3-A），Glomus.sp.VTX00113在4個寧夏枸杞產區根樣品中有顯著性差異（P<0.001））（圖3-B）。

圖3 種水平不同寧夏枸杞品種和產區樣品中AMF組間顯著差異圖Fig.3 Significant differences of AMF among different varieties and cultivated regions at species level

表3 種水平不同寧夏枸杞品種樣品中AMF相對分布表Table 3 Relative abundance of AMF among different varieties at species level

表4 種水平不同寧夏枸杞產區樣品中AMF相對分布表Table 4 Relative abundance of AMF among different cultivation regions at species level

不同品種樣品所得的OTUs數目分別為“寧杞7號”16個、“寧杞9號”12個、“蒙杞1號”9個和“蒙杞2號”5個，OTUs數目大小依次為“寧杞7號”>“寧杞9號”>“蒙杞1號”>“蒙杞2號”，“寧杞7號”品種OTUs數目最多（圖4-A）；不同產區樣品所得的OTUs數目分別為“中寧”產區22個、“海原”產區13個、“內蒙古”產區10個和“甘肅”產區14個，OTUs數目大小依次為“中寧”產區>“甘肅”產區>“海原”產區>“內蒙古”產區，4個產區共有OTUs有3個（圖4-B）。共現性網絡圖顯示OTU20為4個品種和4個產區的重要節點（圖5-A），4個產區相互關聯的OTUs數目更多（圖5-B），表明不同品種間AMF OTUs組成存在差異，“寧杞7號”和“寧杞9號”品種OTUs組成更相似，不同產區AMF在OTU水平組成更相似。

圖4 寧夏枸杞根系AMF OTU分布Venn圖Fig.4 Venn of AMF in L. barbarum roots at OTU level

圖5 寧夏枸杞根系AMF OTU和樣品共現性網絡圖Fig.5 Co-occurrence patterns of AMF in L. barbarum roots at OTU level

2.3 β-多樣性分析

基于OTU水平和Bray_Curtis距離的非度量多維尺度分析（non-metric multi-dimensional scaling，NMDS）統計結果顯示，不同寧夏枸杞品種根系AMF群落組成差異不大（圖6-A）；“海原”產區和“中寧”產區的寧夏枸杞根系AMF群落組成相似，而“內蒙”產區和“中寧”產區存在差異（圖6-B）。PERMANOVA分析顯示，不同品種AMF群落組成（Bray_Curtis距離）無顯著差異（P=0.123），不同產區AMF群落組成差異顯著（P=0.001）。

圖6 基于Bray_Curtis距離AMF群落的NMDS排序圖Fig.6 NMDS ordination based on Bray_Curtis similarities of AMF community

2.4 果實有效成分含量與AMF類群關聯分析

在種水平，通過對寧夏枸杞根系豐度前30AMF與樣品果實中多糖（“PS”）、總黃酮（“fl”）、甜菜堿（“bet”）做相關性分析，所有樣品中AMF種與多糖含量無相關性。在不同品種樣品中，Glomus.sp.VTX00113與甜菜堿含量呈顯著正相關，unclassified_OTU14與甜菜堿含量呈顯著負相關，Glomus.sp.VTX00393與總黃酮含量呈顯著正相關，其余AMF種與總黃酮含量無相關性（圖7-A）；在不同產區樣品中，Glomus.sp.VTX00113與甜菜堿含量呈顯著正相關，Glomus.sp.VTX00247與總黃酮含量呈顯著正相關，其余AMF種與甜菜堿和總黃酮含量無相關性（圖7-B）。因此，寧夏枸杞果實多糖含量與AMF無相關性，Glomus.sp.VTX00113與甜菜堿含量顯著正相關，unclassified_OTU14僅在不同品種樣品中與甜菜堿含量顯著負相關，Glomus.sp.VTX00393僅在不同品種樣品中與總黃酮含量顯著正相關，Glomus.sp.VTX00247僅在不同產區樣品中與總黃酮含量顯著正相關。

圖7 基于種水平寧夏枸杞根系AMF與枸杞有效成分相關性heatmap圖Fig.7 Correlation heatmap of AMF and main active ingredients in L. barbarum roots at species level

3 討論

AMF作為植物共生菌，既定殖于宿主植物根系內，又存在于環境土壤中［12］，研究AMF多樣性可選擇的研究材料主要有根系、孢子和土壤［20］。唐明等［11］用濕篩傾析法在寧夏鹽池和海原地區的枸杞（Lycium chinense）根系土壤中AMF的孢子和孢子果發現繞孢球囊霉（Glomus ambisporum）和單孢球囊霉（Glomus monosporum）；盛敏［21］采用濕篩傾析法鑒定西北鹽堿土生境中枸杞（Lycium chinense）根際土壤AMF孢子，發現6種AMF，包括薄壁原囊霉（Archaespora leptotichum）、地表多孢囊霉（Diversispora versiforme）、縮球囊霉（Glomus constrictum）、副冠球囊霉（Glomus coronatum）、根內球囊霉（Glomus intraradices）和摩西球囊霉（Glomus mosseae），其中地表多孢囊霉（Diversispora versiforme）是優勢種，球囊霉屬（Glomus）AMF占主要地位。本研究通過高通量測序研究不同品種和不同產區寧夏枸杞根系AMF，結果表明“寧杞7號”、“蒙杞1號”和“蒙杞2號”品種AMF的優勢種均為Glomus.sp.VTX00113，“寧杞9號”品種AMF優勢種為Glomus.sp.VTX00156；“海原”產區和“甘肅”產區根系AMF優勢種為Glomus.sp.VTX00103，“內蒙古”產區和“中寧”產區的優勢種均為無法鑒定的球囊霉菌，可能是Marrjam數據庫中缺乏一些SSU序列導致。

利用分子生物學技術對寧夏枸杞AMF群落結構進行研究都集中在根際土壤，肖龍敏［22］采用巢氏PCR-DGGE對寧夏枸杞根際土壤研究發現，不同樹齡“寧杞1號”品種枸杞大部分序列與球囊霉屬（Glomus）序列相似，不同樣地（寧夏中寧六隊、長灘、上橋、硝池塘、七隊和寧夏農林科學院枸杞研究所）“寧杞1號”品種枸杞優勢AMF為球囊霉屬（Glomus）和管柄囊霉屬（Funneliformis），不同樣地（寧夏中寧六隊、長灘、上橋）“寧杞7號”品種枸杞優勢 AMF為球囊霉屬（Glomus）；張海涵［8］采用巢氏PCR-DGGE對寧夏農林科學院園林場不同枸杞品種（“寧杞1號”、“寧杞5號”和“檸杞菜1號”）根際土壤研究發現克隆測序的所有序列均屬于球囊霉屬（Glomus）；納小凡等［23］利用Illumina MiSeq測序對種植5年、10年和15年寧夏枸杞根際土壤微生物ITS基因的部分區域進行測序，發現AMF球囊霉屬比例均未發生顯著變化。本研究在4個不同品種和4個不同產區寧夏枸杞根系中分別發現24和35個AMF OTUs，結果表明寧夏枸杞根系中AMF含量較低，且優勢屬均為球囊霉屬（Glomus），與根際土壤中研究結果一致。

選育寧夏枸杞品種時大多采用自然選優、雜交育種和倍性育種等方法［24］，通過扦插繁育技術來擴大品種。本研究選取的4個寧夏枸杞品種均是從“寧杞1號”的突變株選育而來，內蒙古選育的“蒙杞1號”和“蒙杞2號”育成時間最晚。本研究發現內蒙古選育的 “蒙杞2號”品種AMF多樣性和豐富度最低，“寧杞7號”品種最高。Holland等［25］研究葡萄AMF群落時發現在葡萄品種之間AMF物種豐富度和群落結構沒有差異，本研究結果表明不同品種寧夏枸杞根系AMF群落結構不存在顯著差異，可能與物種有關，有待于后續實驗采用更多寧夏枸杞品種深入研究來確證。

我國北方農田土壤中以球囊霉屬（Glomus）的頻度最高，農田土壤中AMF優勢種類明顯，土壤理化性質對其影響不大［26］。生境特征和地理距離的變化可能導致AMF的地理分布格局不同［27］。AMF的分布不僅與植物種類、基因型有關，還與溫度、日照時間、水分、CO2濃度、O2分壓、氮沉降等氣候因子、土壤理化因子和耕作栽培措施等人類活動有關［28-29］。李越鯤等［30］采用MiSeq 高通量測序ITS區研究我國枸杞產區（寧夏中寧、寧夏興仁、新疆精河、青海格爾木）根際土壤真菌群落結構發現不同地區枸杞根際土壤真菌種群結構有一定差異。本研究發現“海原”和“靖遠”產區的根系AMF群落結構最相似，且優勢AMF種相同；不同產區的寧夏枸杞根系AMF群落結構組成存在差異，這可能是由于不同產區不同的氣候、耕作方式以及形成不同的土壤理化等導致。

AMF會影響宿主植物次生代謝產物的積累。Al-Garni［31］研究表明，在鹽脅迫下AMF侵染會促進蘆葦中甜菜堿的積累，Amiri等［32］研究表明接種AMF會促進香葉天竺葵葉片中總黃酮和酚類物質的含量，改善植株的化學生理特性。賀學禮等［33］研究發現接種Glomus mosseae后民勤絹蒿在應對水分脅迫中葉片總黃酮含量顯著升高，植物抗旱性增強。呂桂云［34］和賀超興等［35］研究發現，接種Glomus mosseae和Glomus versiforme能夠提高黃瓜和甜瓜果實中維生素C、可溶性糖和氨基酸的含量并增加果實產量。王銳竹等［36］研究發現，接種Rhizophagus irregularis不僅會提高番茄果實中可溶性固形物和番茄紅素的含量，還可改善植物根區環境，提高土壤有機質含量。曹冠華等［37］研究發現，滇黃精根狀莖中多糖和總黃酮含量等主要功效成分與AMF、DSE定殖率呈正相關。AMF能影響宿主植物次生代謝產物積累的機理也開展部分研究。Mirjani等［38］和劉靈［39］研究發現，AMF通過提高類黃酮生物合成途徑（PAL）和酚酸生物合成途徑相關酶（C4H和4CL2）的基因表達，增加類黃酮和酚酸類物質的生物合成，提高抗氧化活性。王林闖等［40］研究發現，甜椒接種Glomus mossea后葉綠素含量和光合速率提高，植株的光合產物相應增多。也有研究顯示AMF與植物建立共生關系后能夠擴大植物根系吸收面積［41］，提高AMF和DSE定殖率［42］，使植物表現出更強的抗脅迫能力和更好的生長發育狀況［43］。本研究發現Glomus.sp.VTX00393在不同品種中與總黃酮含量顯著正相關，Glomus.sp.VTX00247在不同產區中與總黃酮含量顯著正相關，Glomus.sp.VTX00113在所有產區和品種中顯示與甜菜堿含量顯著正相關，但AMF與寧夏枸杞果實多糖含量無顯著相關性。后續試驗需將通過高通量分子測序獲得的虛擬種和形態種對應，通過AMF孢子分離、人工擴繁、回接進一步驗證AMF與寧夏枸杞果實甜菜堿與總黃酮間的關系。

4 結論

品種影響寧夏枸杞根系AMF群落α-多樣性、優勢種，但不影響β-多樣性，產區影響β-多樣性、優勢種，不影響α-多樣性指數；AMF與枸杞果實甜菜堿、總黃酮含量相關，與多糖含量無相關性。