密度、施氮量和留葉數對渠首1號香氣特性彰顯的影響

張謙 薛宇 賀凌霄 吳疆 程玉淵 楊鐵釗 丁永樂 徐世曉 薛剛

（1. 河南農業大學煙草學院，鄭州450002；2. 河南省煙草公司洛陽市公司，洛陽 471000；3. 河南省煙草公司南陽市公司，南陽473000）

類西柏烷類化合物和石油醚提取物是煙葉風格特色重要決定因素，類西柏烷類主要包括西柏三烯醇類、茄酮、降茄二酮等物質，是煙草次生代謝類西柏烷二萜的主要成分，以葉面腺毛分泌物的形式存在于煙草中［1］，腺毛由植物的表皮細胞分化而來，在植物次生代謝物質積累和利用以及抵御外界不良因素起重要作用［2］。煙草葉片腺毛豐富，種類多樣且具有較強的分泌能力，腺毛分泌物是煙草香味香氣組分的重要前體物，與煙草的香味有密切聯系，分泌物中有些成分還具有抗病、抗蟲、抗氧化的作用［3-4］，因此提高煙草葉片腺毛密度是提高煙草抗性和改良煙葉品質的重要途徑之一［5］。煙草葉片腺毛分泌物的主要化學成分是西柏三烯二醇，占腺毛分泌物總量的60%以上［6］，在煙葉生長和后期調制過程中，西柏三烯二醇大部分降解為以茄酮為主要代表的多種致香成分［7］。而茄酮可降解為茄醇、茄尼呋喃和降茄二酮等對煙草的香吃味影響很大的物質。前人研究顯示，諸多因素對烤煙西柏三烯二醇的代謝都有影響，例如海拔高度、遮陰、光照條件以及不同的栽培措施［8-10］。煙葉石油醚提取物通常被作為衡量煙葉品質和香氣的重要指標之一，煙草中石油醚提取物的質量分數受生態環境因素和栽培技術的影響［11］。種植密度、施氮量及打頂留葉數是煙葉在大田生產過程中最基礎的栽培技術，同時也是影響煙葉產質量和煙農收益的關鍵因素［12］。合理種植密度和單株留葉數可以保證煙株合理的群體質量，并能夠調控和促進煙株的生長發育，對煙葉腺毛密度及其分泌物也有一定的影響［13］。氮元素對煙葉優良品質的形成以及風格特色的彰顯有重要 貢獻［14］。

渠首1號是河南南陽地方特色品種，具有生產典型河南濃香型煙葉的潛質。但近年來由于栽培習慣的變化，導致渠首1號煙葉風格特色彰顯不足。目前，關于種植密度、施氮量及打頂留葉數對煙草產質量的研究多注重對現象的分析，深入到分子水平對葉面分泌物代謝過程中的關鍵基因進行分析的研究還不多見。因此，本研究對比各處理類西柏烷類化合物和石油醚提取物含量，同時結合對葉面腺毛密度、腺毛分泌物主要成分烤煙西柏三烯二醇代謝關鍵基因CYC-1和CYP71D16的表達情況及感官評價結果的分析，研究不同種植密度、施氮量和留葉數對渠首1號類西柏烷類化合物和石油醚提取物含量的影響，可為大田生產措施的調整上提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

試驗于2019年在河南省南陽市方城縣清河鄉金葉園實驗基地進行，供試土壤類型為棕壤土，土壤肥力中等，前茬作物烤煙，參試烤煙品種為渠首1號（南陽自育品種）。試驗按3因素3水平設置，試驗采用正交設計L9（34），共計9個處理組合（表1、表2），每個處理組合重復3次，共27個區，每個小區面積為66.7 m2，小區采用隨機區組排列，四周設保護行。2月14日播種，漂浮育苗，4月22日移栽大田，8月1日第1次采烤（烤房使用密集式烤房，烘烤工藝按照三段式烘烤）。烤煙各生產環節按當地優質煙葉生產技術標準進行管理。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Orthogonal test factor level table

表2 試驗安排表Table 2 Test schedule

1.2 測定項目與方法

1.2.1 腺毛密度 采各處理煙株中部葉片（從下往上數第 14 葉位）葉齡 60 d的葉片，通過電子顯微鏡掃描觀察并統計單位面積的腺毛數量。

1.2.2 葉面腺毛分泌物的提取與測定 腺毛分泌物的提取按照張景華［1］的方法。

1.2.3 熒光定量 PCR 以煙草Actin基因（GenebankAccession No. AB158612）為內參，各基因名稱及引物如表3。熒光定量PCR體系（20 μL）：2×SYBR Green qPCR Mix，10 μmol/L的-Forward Primer和Reverse Primer各0.4 μL，ROX 0.4 μL，cDNA 1 μL，nuclease-free water 7.8 μL。PCR反應程序：95℃ 10 min；95℃ 15 s，55℃ 15 s， 72℃ 45 s，40個循環；95℃ 15 s，55℃ 30 s， 95℃ 15 s。

表3 各基因名稱及引物Table 3 Gene names and primers

1.2.4 茄酮的測定方法 采用“水蒸氣蒸餾-二氯甲烷萃取”法對煙葉進行前處理，經前處理制備的化驗樣品，加內標后（內標為硝基苯），運用氣質連用儀進行測定，由GC/MS鑒定結果和NIST庫進行檢索定性。茄酮由國家煙草栽培生理生化研究基地進行測定。

1.2.5 石油醚提取物 由專業分級人員每個處理分別隨機選取 C3F等級15片煙樣，烘干粉碎供，采用索氏提取法測定煙葉樣品的石油醚提取物含量［14］；

1.2.6 感官質量評價 將烤后煙中部葉制成單料煙，送至河南中煙工業公司，按照“YC/T138-1998 煙草及煙草制品感官評吸方法”請6位專家進行評吸。

1.2.7 數據分析 采用Excel 2010、DPS統計軟件對試驗數據進行方差分析，顯著性檢驗用Duncan新復極差法。

2 結果

2.1 種植密度、施氮量和留葉數對煙葉腺毛密度的影響

由表4可知，短柄腺毛密度T4最高，為11.67根 /mm2，T4、T2、T5無顯著差異，T9最低，為8.15根 /mm2，T7、T8和T9無顯著差異，其它處理處于中間水平且差異不顯著；長腺毛密度也為T4最高，為21.63根 /mm2，與其他處理差異顯著，T7、T2處理長柄腺毛密度次之且無差異顯著，T9最低，為16.59根 /mm2，T1、T8和T9差異不顯著。腺毛總密度也為T4最高，為33.3根 /mm2，與其他處理差異顯著，T2、T5處理腺毛總密度次之且無差異顯著，T9最低，為24.74根 /mm2，T1、T6、T7和T9差異不顯著。

表4 各處理組合間煙葉腺毛密度差異分析Table 4 Analysis of the difference in density of tobacco leaf glandular hair among the treatment combinations（root/mm2）

由表5可得，短柄腺毛密度隨種植密度、施氮量和單株留葉數增加而先增后減小，腺毛總密度隨種植密度和留葉數的變化與短柄腺毛一致，不同的是腺毛總密度隨時施氮量的增加而減小。根據極差分析，對短柄腺毛密度和腺毛總密度的影響由大到小依次為種植密度、留葉數、施氮量；長柄腺毛密度隨種植密度和留葉數而先增后減小，長柄腺毛密度隨著施氮量的增加而減小。對長柄腺毛密度影響由大到小依次為施氮量、留葉數、種植密度。

表5 葉面腺毛密度的邊際值和極差Table 5 The marginal value and range of leaf glandular hair density

2.2 種植密度、施氮量和留葉數對煙葉腺毛分泌物的影響

種植密度、施氮量及留葉數對煙葉腺毛分泌物影響的正交試驗方差分析結果（表6）表明，西柏三烯一醇含量占腺毛分泌物總量極少，西柏三烯二醇含量約占腺毛分泌物總量的67%-72%，烷烴類物質約占腺毛分泌物13%-16%，西柏三烯二醇是煙葉腺毛分泌物的主要組分。比較各處理組合，西柏三烯二醇含量T4最高，為54.21 μg/cm。各處理組合西柏三烯二醇的含量高低排序為：T4>T2>T5>T7>T1>T8>T3>T6>T9；腺毛分泌物總量T4最高，為74.38 μg/cm，各處理腺毛分泌物總量高低分別為：T4>T7>T2>T5>T1>T8>T3>T6>T9；烷烴類物質含量T5最高，為11.25 g/cm，T4含量次之，為11.066 7 μg/cm，為而T9含量最少，僅為8.436 7 μg/cm。總體來看，T4處理西柏三烯一醇含量、西柏三烯二醇含量和腺毛分泌物總和含量均為最高，在中等種植密度，低施氮量及中等留葉數的條件下，煙葉可獲得較高的腺毛分泌物含量。

表6 各處理組合的煙葉腺毛分泌物含量差異分析Table 6 Analysis of the difference in the secretion content of the tobacco leaf glandular hairs of each treatment combination（μg/cm2）

由表7可知，煙片西柏三烯一醇總量和西柏三烯二醇總量均隨著種植密度的增加而先增加后下降，隨施氮量的增加而下降。西柏三烯一醇總量隨著留葉數的增加而增加，西柏三烯二醇總量隨著種植密度和留葉數的增加而先增加后下降。3個因子對西柏三烯一醇總量和西柏三烯二醇總量影響由大到小依次為施氮量、種植密度、留葉數。

表7 腺毛分泌物含量的邊際值和極差Table 7 Marginal value and range of glandular hair secretion content（μg/cm2）

烷烴類隨著種植密度和留葉數的增加而先增加后下降，且各處理間差異顯著；隨施氮量的增加而下降，且各處理間差異顯著；隨留葉數的增加而下降，且各處理間差異顯著。種植密度和施氮量是影響烷烴類含量的重要因素，留葉數影響力最小。

腺毛分泌物總量變換規律與西柏三烯二醇總量變換規律一致，3個因子對腺毛分泌物總量影響由大到小依次為施氮量、留葉數、種植密度。總體來看，當種植密度中等時，西柏三烯一醇含量、西柏三烯二醇含量、烷烴類和腺毛分泌物總量均處于最高值，施氮量水平較低時，四者表現最好，留葉數為中等水平時，西柏三烯一醇總量、西柏三烯二醇總量和腺毛分泌物均處于最高值，當種植密度中等，施氮量水平較低，留葉數中等時，南陽煙區渠首1號煙葉腺毛分泌物較高。

2.3 種植密度、施氮量和留葉數對西柏三烯二醇代謝相關基因相對表達量的影響

由圖1可知各處理中，T4的CYC-1相對表達量最高，為1.477，其次是T5，兩者無明顯差異，T9表達量最低，且T9與T6差異不顯著，與其他處理差異顯著，各處理CYC-1相對表達量表 現 趨 勢 為：T4>T5>T2>T7>T8>T1>T3>T6>T9；CYP71D16各處理CYC-1相對表達量表現趨勢為T4>T7>T2>T5>T1>T9>T3>T9>T6，相對表達量也是T4最高，為1.3267，是最低處理T6的2.17倍，兩者均與其他處理差異顯著，T7、T2和T5三者差異不顯著，T1與其他處理差異顯著，T8、T3和T9三者差異不顯著。前面的分析已經表明不同栽培措施能使煙葉分泌物主要成分西柏三烯二醇的含量發生變化，與煙葉西柏三烯二醇代謝密切相關的基因相對表達量出現相似變化規律則可以很好地解釋這一現象。再一次證明西柏三烯二醇的代謝與CYC-1、CYP71D16基因密切相關。

圖1 各處理組合CYC-1和CYP71D16基因的相對表達量Fig.1 Relative expression levels of CYC-1 and CYP71D16 genes in each treatment combination

由表8可知CYC-1和CYP71D16相對表達量均隨種植密度的增加而先增大后減小，且不同因素水平差異顯著，CYC-1相對表達量隨施氮量的增加而先增大后減小，但是M1和M2差異不顯著，CYP71D16相對表達量施氮量的增加而減小。CYC-1和CYP71D16的相對表達量均隨留葉數的增加而先增大后增加。施氮量是影響二者最重要的因素，留葉數和種植密度對CYC-1影響力相當，留葉數是CYP71D16的相對表達量的次要因素，種植密度影響最小。

表8 CYC-1和CYP71D16基因相對表達量的邊際值和極差Table 8 The marginal value and range of the relative expression of CYC-1 and CYP71D16 genes

2.4 種植密度、施氮量和留葉數對煙葉茄酮含量的影響

各處理茄酮的含量高低分別為：T5>T4>T2> T7>T8>T3>T1>T9>T6，在 0.05 差異水平上，T5茄酮含量最高，為79.65 μg/g，T6最低，為44.85 μg/g，除T3和T8外，其他各處理差異顯著（圖2）。

圖2 各處理組合間茄酮含量差異分析Fig.2 Analysis of the difference in solanone content between treatment combinations

茄酮含量隨著種植密度和施氮量的增加而先增加后下降，且各處理間差異顯著；隨留葉數的增加而增加，各處理間差異顯著；施氮量和留葉數是影響茄酮含量的重要因素，種植密度影響力最小 （表9）。

表9 不同因素水平下煙葉茄酮的邊際值和極差Table 9 Marginal value and range of solanone in tobacco leaves under different factor levels（μg/g）

2.5 種植密度、施氮量和留葉數對烤后煙石油醚提取物質量分數的影響

對烤后煙中部葉石油醚提取物質量分數的影響密度、施氮量及留葉數的正交試驗方差分析結果（圖3）表明，在0.05差異水平上，T5石油醚提取物質量分數最高，為7.9%，T1最低，為4.43%，兩者均分別與其它處理差異顯著，T8石油醚提取物質量分數居第2位，且與T4無顯著差異，其它處理間差異顯著。

圖3 各處理組合間烤后煙石油醚提取物質量分數差異分析Fig.3 Analysis of the difference in mass fraction of petroleum ether extract of flue-cured tobacco among various treatment combinations

從邊際值來看，石油醚提取物質量分數隨著種植密度和施氮量的增大而先增大后減小，且3個水平差異顯著；隨著留葉數的增大而增大，M1與M2和M3差異顯著。據極差分析，3個因子對石油醚提取物影響由大到小依次為種植密度、施氮量、留葉數（表10）。

表10 不同因素烤后煙石油醚的邊際值和極差Table 10 Marginal value and range of petroleum ether of flue-cured tobacco after different factors

2.6 種植密度、施氮量和留葉數對烤后煙感官質量評價的影響

由表11和表12可知，施氮量是影響中部葉感官質量評價的主要因素，種植密度是次重要因素，留葉數是次要因素。就香氣特征而言，處理T5的香氣質感和香氣量表現最好，其次為處理T8，T2處理最差。就煙氣特征而言，處理T1表現較優，其次為處理T5，T2處理最差處理。就吃味特征而言處理T1表現較優，其次為處理T5，T6處理最差處理。處理T5在總分表現最好，為69.4分，其次為處理T8，T6處理最差，僅為57.2分。從邊際值來看，隨施氮量和種植密度的增加，總分呈反V字型變化，隨著留葉數的增加，總分呈V字型變化。推薦處理組合為M2N2L3，可獲得較高的感官質量評分。

表12 不同因素烤后煙感官質量評價邊際值和極差Table 12 Marginal value and range of sensory quality evaluation of flue-cured tobacco after different factors

3 討論

生態因素、遺傳因素和栽培因素共同影響了煙葉風格的形成，其中生態條件決定了煙葉香氣風格的類型和潛力，而栽培因素決定了風格特色的顯示度和彰顯度。

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煙草腺毛密度越高，香氣量越足［15-16］。本實驗中腺毛總密度隨種植密度和留葉數增加而先增加后減小，密度過大或過小及留葉數過多過少均不利于腺毛密度增加，這可能與煙葉個體的發育和營養分配有關［17］，也可能與種植密度過大或留葉數過多造成的煙株間相互遮陰有關［8］；隨施氮量的增加腺毛總密度減小，這與衛宣志［18］研究一致。綜合來說，在M2N1L2的條件時，渠首1號在本地區腺毛總密度可以達到較大值。

楊鐵釗等［19］研究指出中部位在葉齡 60 d 時葉面分泌物量達到最大值，之后腺毛分泌物含量逐漸下降，因此本研究選取此時期進行葉面分泌物的測定。種植密度，施氮量和留葉數均對腺毛分泌物有一定的影響［20］。本實驗中，西柏三烯一醇總和隨種植密度和施氮量變化不大，隨施氮量的增加而減小。烷烴類物質含量則在中等密度，施氮量水平較低，留葉數較多的條件下達到最大值。西柏三烯二醇總和含量和腺毛分泌物總和變化基本一致，說明了西柏三烯二醇是煙葉腺毛分泌物的主要成分，兩者均在M2N1L2的條件下達到最大值且不同因素水平下差異明顯，對二者影響最大的因素為施氮量，增施氮肥不利于煙草葉面分泌物的合成和積累，這與史宏志等［21］研究一致，原因可能是由于增施氮肥后葉片較大，在整片葉腺毛分泌物總量一致的情況下，單位葉面積腺毛分泌物含量降低。

王冬等［22］研究表明，CYC-1和CYP71D16直接參與了西柏三烯二醇的合成。其中西柏三烯醇合成酶以香葉基焦磷酸為底物催化合成西柏三烯一醇，CYC-1則是編碼西柏三烯一醇合成酶的基因，CYP71D16作為編碼細胞色素 P450加氧酶的基因則參與調控了西柏三烯一醇向西柏三烯二醇轉變的過程［23］，CYC-1和 CYP71D16在類西柏烷二萜合成中發揮著重要的作用，直接決定著植物腺毛分泌物中西柏三烯一醇和西柏三烯二醇的含量［24］。較高光照強度促進CYC-1和CYP71D16的上調表達，本實驗中CYC-1和CYP71D16相對表達量均在中等種植密度下達到最大值，這與前人研究結果一致［22］，總體當種植密度中等，施氮量水平中低等水平，留葉數較多時，CYC-1和CYP71D16可以上調表達。

石油醚提取物是衡量煙葉品質優劣的重要指標，對煙葉外觀質感也有影響［25］，煙葉中石油醚提取物與其香氣量呈正相關關系［26］。本實驗中煙葉石油醚提取物隨著種植密度和施氮量的增大而先增大后減小；隨著留葉數的增大而減小，這與趙銘欽等［27］和曹紅云等［28］研究一致。腺毛分泌物含量較高的，其石油醚提取物含量也較高，表明腺毛分泌物含量與石油醚提取物含量有一定的相關性。綜合來說，當M2N2L2時，渠首1號在本地區石油醚提取物可以達到較大值。

茄酮是煙葉主體香味成分之一，其在改善煙草香吃味和醇和煙氣方面有很大益處［29］，本實驗中茄酮隨著種植密度和施氮量的增大而先增大后減小，隨著留葉數的增大而增大，這與許自成［30］研究一致，綜合來說，當M2N2L3時，渠首1號在本地區石油醚提取物可以達到較大值。西柏三烯二醇在酶解或加熱等條件下降解，在鍵的斷裂過程中，得到了茄酮，本實驗中各處理茄酮含量與西柏三烯二醇含量不完全一致，可能是后期雨水過多，西柏三烯二醇轉化不完全造成的。

感官質量是煙葉質量的核心和基礎，是衡量煙葉可用性的重要指標［31］。感官質量的優劣會對卷煙產品的質量造成直接影響。本研究中密度、施氮量對煙葉的評吸質量都有影響，施氮量是主要因素，這與張晨東等［32］研究結果一致；當M2N2L3時，感官質量取的最好評價。隨著施氮量增加煙葉感官質量評價呈上升趨勢，超出一定范圍再增施氮肥，感官評吸質量下降，這與占俊文［33］和劉國［34］研究結果一致。烤煙感官質量隨著煙株密度的增大而先增大再減小，這與張渝婕［35］研究不一致，可能與留葉數對感官質量的影響有關。烤煙感官質量評價隨的留葉數增多而先增加，這與胡麗濤［36］研究不一致，可能是本實驗中的渠首1號與前人實驗中K326品種差異造成的。雖然腺毛分泌物在施氮量較低的條件下可以得到較大值，但是較低施氮水平導致煙株發育不充分，各化學成分不協調，所以影響了最終的感官質量評價結果。本次感官質量評價結果也證實茄酮對于改善煙草的香味和提升抽吸品質也有重要的貢獻。

煙葉中致香物質指標可分為兩類，第一類為指示“清香型”類物質，包括多酚類物質、葉綠素、類胡蘿卜素及質體色素等；第2類傾向指示烤煙為“濃香型”，包括類西柏烷類致香物質、石油醚提取物和美拉德反應產物［37-40］。本實驗中渠首1號作為濃香型煙葉，其類西柏烷類致香物質含量、石油醚提取物含量在中等種植密度，中低施氮量及較多留葉數的條件下取得最大值，考慮產量產值（另文發表）及感官質量評價，渠首1號采用中等施氮量較為合適。

4 結論

綜合各項指標來看，密度15 500株/hm2、施氮量45 kg/hm2和留葉數22片時，煙葉中茄酮含量、石油醚提取物含量均為最大值，腺毛密度，葉面分泌物含量及關鍵基因相對表達量也都處于較高水平，且茄酮轉化比較充分，烤后煙葉感官質量評價最高，香味得到了改善，是彰顯渠首1號濃香型煙葉風格的適宜栽培方式。這表明渠首1號在豫南煙區種植時應采用中等密度，合理施用氮肥、適當增加留葉數。初步認為渠首1號在豫南最優的栽培措施組合為：密度15 500株/hm2、施氮量45 kg/hm2、留葉數22片，建議在生產中進行示范應用和推廣。