血漿血小板活化因子乙酰水解酶的活性及其與中國人群冠狀動脈疾病的關系

施晶晶 朱棟曉 金偉東 王曉彥 莊瑞娟 李拜紅 苗宗寧

(無錫市第三人民醫院心內科，江蘇 無錫 214041)

血漿血小板活化因子(PAF)及其乙酰水解酶(PAF-AH)有可能造成溶血性磷脂酰膽堿(LysoPC)和無氧化脂肪酸的釋放，促進動脈粥樣硬化〔1〕，導致冠狀動脈疾病(CAD)和腦卒中的風險增加〔2〕。歐洲人口的研究一致表明，盡管目前還不清楚血漿PAF-AH與動脈粥樣硬化是否有因果關系〔3〕，CAD患者血漿PAF-AH活性升高。血小板活化因子信號通路中的另一個重要的成員是PAF受體，由PTAFR基因編碼。 本研究旨在探討中國CAD人群中血漿PAF-AH活性和PTAFR基因變異情況。

1 對象與方法

1.1研究對象 2000～2010年918例冠心病患者，納入標準中至少有1個主要的冠狀動脈直徑狹窄>30%。排除顯著的伴隨疾病，特別是血流動力學心臟瓣膜病，心肌病和惡性疾病以及發熱。術后隨訪期中位數為3.9(最高5.2)年。因心血管原因死亡組(n=89)，非心血管原因死亡組(n=26)和非致命性心肌梗死(MI)組(n=54)。后續信息死亡和死亡原因的信息由醫院或醫生獲得。

健康對照組485例來源于我院體檢科，年齡≥40歲。參與研究對象有中國國籍，并為江蘇地區的居民。均由倫理委員會批準。研究對象均簽署知情同意書。

1.2實驗室方法 晨 8：00經肘靜脈抽空腹血5 ml，37℃溫育30 min，離心后取血清1 ml，-80℃保存。儀器采用德 國Bayer公司生產的 ACS：180SE型全自動化學發光免疫分析儀，試劑全部由 Bayer公司提供，按說明操作，由該儀器自動給出檢測結果。樣品一式兩份。每次測定前進行質量控制。不抗凝血儲存于-80℃。血脂水平測定采用美國貝克曼庫爾特AU480全自動生化分析儀檢測，包括總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)，低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)，甘油三酯(TG)。 C-反應蛋白(CRP)測定采用Sysmex XT-2000i全血細胞分析儀。纖維蛋白原采用CA1500全自動血凝儀。白細胞介素-6的酶聯免疫吸附法(ELISA)技術檢測(ASIATM，Biosource Europe，Fleurus，Belgium)。

1.3篩選基因多態性PTAFR基因 采用聚合酶鏈式反應-單鏈構象多態(PCR/SSCP)技術進行等位基因特異性寡核苷酸基因多態性鑒定。利用Primer Express版本2.0設計PCR引物和TaqMan MGB探針。在GeneAmp9700熱循環儀96孔板進行反應。熒光測定使用ABI PRISM7000序列檢測系統和ABI PRISM7000 SDS1.0版軟件分析。

1.4統計學方法 估計等位基因頻率用基因計數，進行對數線性分析。偏離Hardy-Weinberg平衡采用χ2檢驗。PAF-AH活性數轉換，除去陽性的偏度，報道幾何平均數(95%CI)。 Cox回歸分析檢測多態性與預期結果的聯系。研究終點是心血管原因和非致命性MI死亡。分析PTAFR基因單體型與不同表型(病例對照的狀態，PAF-AH活性和生存結果)的聯系。二進制和連續表型的單體型分析，利用先前所描述的模型實施的SEM算法和Cox制定。單倍型的影響(95%CI)表示為一個二進制性狀平均值，效果持續特性和(HRRs)為生存的結果。參考單體型被選為最常見的一種。單體型和表型之間的聯系采用似然比檢驗。除單體型分析，以上采用SAS8.01軟件。生化指標比較采用ANOVA方法進行分析。采用Mann-WhitneyU分析變量的正態分布情況。心血管疾病危險因素與PAF-AH活性性別調整的關聯分析，采用ANOVA分析和Pearson相關系數進行了分析。 PAF-AH相關的CAD比值比(ORS)被調整為相同的變量進行Logistic回歸分析。以上采用SPSS10.07軟件。

2 結 果

2.1病例組和對照組的一般情況 與對照組相比，男女冠心病患者更經常地吸煙，有糖尿病和高血壓的發病率較高，并有一個更加不利的血脂水平?？赡苁怯捎跒樗麄兎盟☆愃幬?，并導致TC和LDL-C水平低于對照組的水平。男女患者的炎癥標志物顯著增加。與對照組相比，女性病例PAF-AH活性顯著增加，男性病例無明顯差異。見表1。

表1 病例組和對照組的一般情況

2.2性別校正后PAH-AH的平均活性比較 對照組女性比男性具有明顯的PAF-AH低活性。糖尿病或者吸煙不會影響兩組的PAF-AH活性。病例組高血壓者的PAF-AH活性比非高血壓者明顯降低。對照組并不顯示高血壓的差異。盡管血管緊張素轉換酶抑制劑(ACEI)顯著降低CAD患者PAF-AH的活性，但是這一效果在高血壓低PAF-AH患者并不明顯。其他藥物包括倍他樂克或者鈣拮抗劑不影響PAF-AH的活性。接受他汀類藥物的患者也顯示較低的PAF-AH活性，而這個效果在對照組是相反的。急性冠狀動脈綜合癥(ACS)患者有較高PAF-AH活性(P<0.000 1)。見表2。

表2 兩組性別校正后PAH-AH的平均活性比較

2.3性別校正后PAF-AH，血脂變量，炎癥標志之間的pearson相關分析 見表3。PAF-AH在所有分組與LDL和TC以及apoB-100活性有很強的相關性。PAF-AH與與HDL和apoA-I濃度控制和ACS患者呈現負相關。除在ACS患者組之外，PAF-AH與炎性介質無相關性。

表3 性別校正后PAF-AH、血脂變量、炎癥標志之間的Pearson相關分析(r值)

2.4根據臨床狀況按性別分層的PAF-AH活性 見表4。PAF-AH的活性與CAD呈現相關性(P<0.05)。男女ACS患者出現PAF的活性水平升高。控制傳統的風險因素后，差異仍然顯著。不接受他汀類藥物或ACEI治療時相關性加強。對照組，病例組PAF-AH的活性逐漸增多而不論性別。

2.5PTAFR基因的篩選 圖1可見，篩選出完整的外顯子序列(1 931 bp)，以及兩個位于第1外顯子和第2外顯子(共3 326 bp)上游區域和位于第3外顯子(249 bp)的下游區域。2個C/T分別替換5′端第2個外顯子-838和-414位置。沒有發現C-414T多態性。一個A/T替換從-1209開始的5′端外顯子1。一個A/G的替代被發現于終止密碼子(+503G)+503的位置。對照組PTAFR基因的等位基因頻率和配對連鎖不平衡見表5，基因型的分布沒有顯著偏離Hardy-Weinberg平衡。

表4 根據臨床狀況按性別分層的PAF-AH活性

圖1 篩選確定的PTAFR基因多態性

表5對照組PTAFR基因的等位基因頻率和配對連鎖不平衡(n=485)

多態性等位基因頻率PTAFR/A+503G(+/-D)PTAFR/C-838/ex2ntT0.95/0.05-0.79PTAFR/A+503G0.78/0.14-

2.6PTAFR 基因多態性在 CAD患者和對照組的基因型分布 見表6。男性和女性之間的異質性差異不顯著。兩個PTFAR基因多態性基因型分布在兩組間沒有顯著差異。

表6 兩組PTAFR基因多態性基因型分布〔n(%)〕

2.7PTAFR基因多態性與隨訪期間心血管事件 見表7。PTAFR的 T-838A+503的C-838A+503與隨訪期間的心血管事件有較顯著的關聯(HRR=1.50，95%CI：0.98～2.30，P=0.061)。

表7 隨訪期間冠心病患者心血管事件發生率〔n(%)〕

3 討 論

血漿PAF-AH濃度于CAD時顯著增加。PAF-AH在高膽固醇血癥的中年男性人口與CAD的風險表現出強烈的正相關。PAF-AH是磷脂酶A2(PLA-2)家族中獨特的一組，具有明顯的底物選擇性〔4，5〕，可作用于PAF以及結構和生物學活性類似于PAF的氧化磷脂，這些底物的共同結構是在sn-2位置上具有酰基，而且在某些疾病中常有一定相關性。目前發現PAF-AH有分泌型(血漿型)和細胞內型等多種同工酶〔6，7〕。決定CAD臨床表現的因素，不單是動脈粥樣硬化斑塊的數量、分布和狹窄的嚴重程度，更為重要的是外在觸發因素與斑塊內在特性相互作用，導致斑塊病變基礎上血栓形成的斑塊損傷包括斑塊的淺表潰瘍和斑塊破裂。斑塊潰瘍暴露出內皮下的膠原纖維和血管性血友病因子(vWF)，血漿PAF-AH濃度升高。誘發血小板黏附和聚集。

大多數炎癥性疾病PAF-AH輕度升高，另外，妊娠、高血壓、血管性疾病、缺血性腦卒中、尿毒癥、艾滋病等可出現升高現象，升高的PAF-AH可減輕PAF和氧化磷脂的炎癥介質效應。炎癥反應標記物CAD往往伴有炎癥過程并釋放急性相蛋白，如CRP，淀粉蛋白A，總硅酸等。CRP可反映動脈硬化過程中，尤其是血栓閉塞并發癥中存在低度的炎癥過程。

接受他汀類藥物的患者也顯示較低的PAF-AH活性這一結論與Tsimihodimos等〔8〕的研究結果一致。

本研究結果顯示，PAF-AH被認為是誘發炎癥反應。因此，PAF-AH是否是CAD的風險指標，或直接促進動脈粥樣硬化。輕度炎癥和氧化壓力下，PAF-AH將作為對抗脂質過氧化保護酶，嚴重的壓力下，轉換成不利因素，例如，釋放過量脂肪酸的氧化產物，增強炎癥反應。另外，PAF-AH可能始終是一個保護因素，如果不上調，在疾病狀態，情況會更糟。事實上，在日本的研究發現，PAF-AH基因缺失突變Val279Phe由于已被證明是一個CAD和腦卒中的獨立危險因素〔9〕。研究人員發現〔10〕，PAF-AH活性增加男性和女性的年齡適應性機制，以防止年齡依賴性的血管壁損傷。

4 參考文獻

1Yamada Y，Yoshida H,Ichihara S,etal.Correlations between plasma platelet-activating factor acetylhydrolase (PAF-AH) activity and PAF-AH genotype，age and atherosclerosis in a Japanese population〔J〕.Atherosclerosis,2000；150：209-16.

2Hiramoto M,Yoshida H,Imaizumi T,etal.A mutation in plasma platelet-activating factor acetylhydrolase (Val279→Phe) is a genetic risk factor for stroke〔J〕.Stroke,1997；28：2417-20.

3Blankenberg S,Stengel D，Rupprecht H,etal.Plasma PAF-acetylhydrolase in patients with coronary artery disease.Results of a cross-sectional analysis〔J〕.J Lipid Res,2003；44：1381-6.

4Crte-Real R，Gomes RN，Castro-Faria-Neto HC，etal.The activity of platelet activating factor-acetyl hydrolase (PAF-AH) in the salivary glands of Rhodnius prolixus〔J〕.J Insect Physiol,2011；57(6):825-9.

5Wegner M，Araszkiewicz A，Pioruńska-Mikoajczak A,etal.The evaluation of IL-12 concentration，PAF-AH，and PLA(2) activity in patients with type 1 diabetes treated with intensive insulin therapy〔J〕.Clin Biochem,2009；42(16-17):1621-7.

6Mitsutake R，Miura S，Zhang B,etal.HDL-associated factors provide additional prognostic information for coronary artery disease as determined by multi-detector row computed tomography〔J〕.Int J Cardiol,2010；143(1):72-8.

7Balta G,Gurgey A,Kudayarov DK，etal.Evidence for the existence of the PAF-acetylhydrolase mutation (Val279Phe) in non-Japanese populations：a preliminary study in Turkey，Azerbaijan，and Kyrgyzstan〔J〕.Thromb Res,2001；101：231-4.

8Tsimihodimos V，Gazi I，Filippatos T,etal.Plasma triglyceride levels and body mass index values are the most important determinants of prebeta-1 HDL concentrations in patients with various types of primary dyslipidemia〔J〕.Atherosclerosis,2010；208(2):506-11.

9Shimokata K，Yamada Y，Kondo T,etal.Association of gene polymorphisms with coronary artery disease in individuals with or without nonfamilial hypercholesterolemia〔J〕.Atherosclerosis，2004;172(1):167-73.

10Nordin N，Jalil J，Jantan I,etal.Platelet-activating factor (PAF) receptor binding activity of the roots of Enicosanthellum pulchrum〔J〕.Pharm Biol,2012；50(3):284-90.