利用HS-SPME-GC/MS法分析橫坑切梢小蠹危害細葉云南松誘導抗性揮發物質*

吳東山 賈 婕 陳 虎 顏培棟 徐榮勛 楊柳琴 楊章旗

(1.廣西壯族自治區林業科學研究院 廣西馬尾松工程技術研究中心 南寧 530002；2.廣西國有雅長林場 樂業 533200)

植物在進化過程中對昆蟲的脅迫會形成一套獨特的防御機制，在這一過程中，植物通過調節自身次生代謝產物及營養物質的變化等一系列反應來抵御昆蟲的危害。因此，植物的次生代謝物質常被看作是一種潛在抗性因素(鄭宏，2013)。萜烯類化合物(Terpenes)是針葉樹中重要的抗蟲性物質，分泌含有高濃度萜類的揮發物抑制昆蟲取食或使昆蟲中毒是針葉樹抗蟲的主要手段(Louetal.，2000)。油松 (Pinustabulaeformis)、馬尾松(Pinusmassoniana)、華北落葉松(Larixprincipis-rupprechtii)3種松樹在受到松毛蟲中等程度危害后，針葉中昆蟲生存所必需的氨基酸(Amino acid)、脂肪酸(Fatty acid)、萜烯類環氧化合物(Terpene epoxides)等物質減少，寄主能迅速產生誘導抗性抵御昆蟲的進一步入侵(戈峰等，2002)。植物次生代謝物質在防御昆蟲的侵害中起到重要的作用(Carmonaetal.，2011)。因此，研究植物次生代謝物質在不同受害個體中的變化規律，有助于更好地揭示植物體對昆蟲脅迫防御機制的形成過程。

細葉云南松(Pinusyunnanensisvar.tenuifolia)是產于云南、貴州、廣西交界的南盤江及紅水河上游干熱河谷地帶云南松的一個地理變種，也是一個生態、經濟效益很高的優良用材、產脂樹種，在干熱河谷退化生態系統植被恢復中具有重要價值。由于該區域特殊的地理位置，常年焚風肆虐，形成干熱河谷生態環境，各類昆蟲尤其是橫坑切梢小蠹(Tomicusminor)(鞘翅目Coleoptera：小蠹科Scolytidae)的危害是細葉云南松天然林資源處于瀕臨滅絕的主要原因(吳東山等，2016)。橫坑切梢小蠹的危害從幼蟲蛀食嫩梢及針葉開始，成蟲期侵入樹干蛀成橫切坑道，切斷樹干韌皮部水分和養分輸導，加速松樹死亡(李麗莎等，2006)。目前主要的防治方法仍是依靠人工清理以及化學藥劑輔助，依然缺乏安全、環保的防治技術(徐長山等，2004)。因此，有必要從松樹本身對昆蟲危害的防御機制角度探討新的防治技術。迄今為止，學者們的研究主要在云南松(Pinusyunnanensis)松針揮發物方面(丁靖凱等，1987；殷彩霞等，2002)，而南盤江及紅水河上游流域的細葉云南松受橫坑切梢小蠹危害與松針揮發物的關系，尤其是松針揮發物的特異性是否為誘導松小蠹選擇寄主的決定因素的研究尚未見報道。本研究應用頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用技術(headspace solid phase microextraction-gas chromatography/mass spectrometry,HP-SPME-GC/MS)研究細葉云南松對橫坑切梢小蠹危害的防御反應機制，以及危害程度與松樹松針揮發物的變化關系，探討其與抗蟲性有關的揮發化學物質，可為篩選、培育抗蟲品種及綜合防治該害蟲提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

按照橫坑切梢小蠹蟲危害程度分級標準進行嫩梢樣品采集。A.輕度危害：嫩梢及針葉30%以下被蠶食、針葉淡綠色；B.中度危害：嫩梢及針葉31%～50%被蠶食、針葉黃綠色；C.重度危害：嫩梢及針葉51%以上被蠶食、針葉黃褐色;D.對照(蟲害期間無機械損傷的健康植株)。

取樣方法與處理：在廣西樂業縣雅長林場林區不同受害程度和對照的植株中各選4株，選擇每個等級材料每株樹冠中上部東、南、西、北4個方向上直徑為2～3 cm的受害和對照嫩梢(每個等級材料重復采集混合樣品3次)，用小刀直接將其外皮和韌皮部及其附帶針葉削下組成樣品，迅速放入50 mL具塞離心管中密封后，放入加有冰袋的保溫箱保存。

1.2 頂空固相微萃取條件優化單因素試驗

使用健康的細葉云南松枝梢對照材料進行SPME條件優化試驗。采用單個因素逐步優化的方法(Steffenetal.，1996)對萃取頭類型、萃取溫度和萃取時間進行優化。取嫩梢針葉樣品0.3 g研碎，置于配有聚四氟乙烯膠墊的頂空瓶(規格15 mL，中國上海安譜科學儀器有限公司)中，密封瓶口。將其置于 90 ℃ 水浴鍋內預熱 5 min 后，采用手動 SPME 進樣器(美國 Supelco 公司)，將老化好的萃取頭插入樣品瓶頂空部分，吸附 30 min 后抽回，立即插入 GC-MS 聯用儀的氣相色譜進樣口，于 250 ℃解吸 3 min，進行數據采集分析。

根據極性及涂層厚度的不同，采用的萃取頭(產地：美國，Supeclo公司)有50/30 μm碳分子篩/二乙烯基苯/聚二甲基硅氧烷(PDMS/CAR/DVB)、75 μm 碳分子篩 /聚二甲基硅氧烷(CAR/PDMS)、100 μm聚二甲基硅氧烷(PDMS)、65 μm二乙烯基苯/聚二甲基硅氧烷(DVB/PDMS)4種類型；萃取溫度分別為45、55、65、75、85 ℃5個梯度；萃取時間為10、15、20、25、30 min 5個梯度；測試的平衡時間點為0、5、10、15、20 min共5個梯度。正構烷烴混標(C8—C20，上海 Sigma-Aldrich 公司)。根據不同梯度下色譜峰的總面積確定萃取頭類型、萃取溫度和時間的優化條件。

1.3 揮發化學物質測定的GC-MS 分析條件

氣相色譜儀(5973，美國，安捷侖公司)GC條件:色譜柱為BP-20(30.0 m×250 μm×0.25 μm)彈性石英毛細管柱,柱溫60 ℃(保留2 min)，以5 ℃· min-1升溫至240 ℃,保持20 min;進樣口溫度250 ℃;載氣為高純He(99.999%);柱前壓0.035 MPa,載氣流量1.0 mL·min-1;進樣量1 μL;采用不分流模式進樣。

質譜儀(6890，美國，安捷侖公司)MS條件:離子源為EI源;離子源溫度250 ℃;四極桿溫度180 ℃;電子能量70 eV;發射電流34.6 μA;倍增器電壓1 982 V；接口溫度280 ℃;質量范圍10～450 u。通過HPMSD化學工作站，結合Nist98標準質譜圖、Wiley275質譜圖庫和部分標準樣品譜圖進行定性，按峰面積歸一化法計算各化學成分的相對含量。

1.4 數據統計與分析

采用SPSS19.0 版軟件進行差異顯著性分析及判別分析，采用 Kruskal-Wallis檢驗進行非參數檢驗。

2 結果與分析

2.1 HS-SPME 條件優化

2.1.1 不同固相萃取頭對萃取效果的影響 4種固相微萃取頭的萃取結果如圖1所示。具有極性和非極性涂層的CAR/DVB/PDMS萃取頭吸附的揮發組分總峰面積最大，其次是CAR/PDMS，而PDMS的涂層不具有極性和非極性的特性，難以吸附揮發物中許多極性差異較大的物質，故吸附范圍較窄，僅為CAR/DVB/PDMS效率的57.58%。可見，細葉云南松蟲害嫩梢中的揮發性物質是極性與非極性物質的混合體，且各組分之間具有極性差異大的特征。因此，確定CAR/DVB/PDMS萃取頭用于本試驗，以獲得更多揮發性組分。

圖1 固相微萃取頭對揮發成分萃取總峰面積比的影響Fig.1 Effect of SPMH fibres on total peak area ratio of volatile components extraction

2.1.2 不同平衡時間對萃取效果的影響 如圖2所示。隨著平衡時間的增加，揮發物的總峰面積呈先升后降的變化，在15 min時，頂空已基本達到平衡。

圖2 平衡時間對揮發成分萃取總峰面積的影響Fig.2 Effect of equilibrium time on total peak area ratio of volatile components

2.1.3 不同溫度對萃取效果的影響 采用CAR/DVB/PDMS萃取頭，研究不同溫度對萃取效率的影響，結果如圖3所示。隨著萃取溫度的增加，萃取頭的吸附量先降后升，在75 ℃時吸達到最大值，之后隨著溫度升高，吸附量又有所降低。這表明細葉云南松嫩梢揮發物中低沸點的組分較多，且含量也較大，為了防止萃取溫度過高導致揮發性組分發生化學結構的轉變影響實驗結果，選擇萃取溫度為75 ℃。

圖3 萃取溫度對揮發成分萃取總峰面積的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on total peak area ratio of volatile components

2.1.4 不同吸附時間對萃取的影響 采用CAR/DVB/PDMS萃取頭，在三相平衡時間達到15 min及萃取溫度達到75 ℃條件下研究吸附時間對萃取效率的影響，結果如圖4所示，在最優萃取溫度下，隨著萃取時間的增加，揮發峰面積不斷增加，但時間越長，揮發組分含量反之下降，在15 min時總峰面積已經達到最大，說明細葉云南松嫩梢中的揮發物質已經達到吸附與解析的平衡狀態。故選擇15 min吸附時間為最優條件。

圖4 吸附時間對揮發成分萃取總峰面積的影響Fig.4 Effect of absorption time on total peak area ratio of volatile components

2.2 細葉云南松蟲害嫩梢揮發成分的差異分析

在75 ℃固相萃取儀上平衡15 min，用75 μm萃取頭(DVB/CAR/PDMS)萃取15 min后，經 GC-MS 分析，得到總離子流圖如圖5所示，檢出的揮發物成分及相對含量如表1所示。

圖5 細葉云南松嫩梢揮發成分的總離子流圖Fig.5 Total ion flow map of volatile components in tender shoots of Pinus yunnanensis var. tenuifolia

由表1可知，不同類型的細葉云南松嫩梢受到蟲害后分離得到的化學成分不同，主要包括碳氫類化合物(hydrocarbons)、醇類(alcohols)、醛類(aldehyde)、酮類(ketones)、酯類(esters)以及環氧化合物(epoxy compound)。碳氫類化合物、醇類是揮發成分的主要物質，兩者占總物質的87.7%以上，2類化合物的含量均隨危害程度加深而增加。醛類和酮類占比最少，均低于0.1%。重度危害C類嫩梢分離鑒定出的揮發物質最多，達到50種，占總離子流出峰面積的96.364%，其中，碳氫化合物(共29種)占總峰面積的87.12% ，醇類物質(11種)占6.626%，、醛類物質(1種)占0.057% ，酯類物質(8種)占1.863%，環氧化合物質(2種)占 0.55%。所有嫩梢類型揮發物中僅有未受害植株檢測到長葉烯成分，其含量為0.123%。

揮發物中含氧化合物含量不同，其抗性也有所不同。從表1可知，各類型嫩梢的揮發物質中的含氧化合物含量和數量也存在差別，重度危害嫩梢中的單萜類及倍半萜類含氧化合物種類最多，其含量也是最高的，分別達到2.117%、7.274%，而倍半萜類含氧化合物所占比例遠高于單萜類型，結合危害程度及其揮發物中的含氧物質含量可以看出，危害程度越重，2種類型含氧物質含量越多。

表1 細葉云南松嫩梢揮發物成分及相對含量的 GC-MS 分析①Tab.1 GC-MS analysis of volatile components and relative contents in tender shoots of Pinus yunnanensis var. tenuifolia

不同類型嫩梢中含量大于1%的主要成分是：α-蒎烯、β-蒎烯、3-蒈烯、檸檬烯、異松油烯、β-欖香烯、β-石竹烯、β-畢澄茄烯、甘香烯、γ-杜松烯、δ-杜松醇。為研究揮發物中主要成分的差異對嫩梢的抗性產生的作用，將各危害類型嫩梢與對照進行顯著性差異比較，見表2。

表2 不同危害梢主要揮發成分含量差異顯著性分析①Tab.2 Analysis of contents of main volatile components in young shoots with different damagements

由表2可知，從嫩梢揮發物主要成分的變化規律上看，細葉云南松嫩梢受到切梢小蠹危害的應激反應主要表現在萜類次生代謝含量上的不同。其中單萜類的α-蒎烯(X1)、3-蒈烯(X3)以及倍半萜中的β-欖香烯(X6)的含量在重度危害類型上與對照有顯著差異，β-蒎烯(X2)、β-石竹烯(X7)、β-畢澄茄烯(X8)含量在重度及中度危害類型上與對照有顯著差異，其余組分含量與未受害對照差異不顯著。另外，在對揮發組分與對照有顯著差異的分析中發現，隨著危害程度的加重，α-蒎烯、3-蒈烯、β-石竹烯、β-畢澄茄烯的含量隨之增加，僅有β-蒎烯含量逐漸減少。在重度危害類型中，β-蒎烯含量最低，僅為對照的47.85%，而3-蒈烯是含量上升比例最高的組分，其升高比例達62.83%，其次為β-石竹烯，增加26.76%，α-蒎烯含量僅增加10.91%。由此可見，揮發物中與對照存在顯著差異的主要成分對嫩梢的抗性產生主導作用。

2.3 細葉云南松蟲害嫩梢揮發成分的判別分析

為了分析揮發物主要差異成分與危害程度分組中的重要性依次關系，對揮發物主要成分指標進行判別分析，在兼顧到較少的樣本量對分析產生的誤差影響，結合Kruskal-Wallis檢驗對變量指標進行非參數檢驗。結果如表3所示。

結合表2的差異顯著性分析結果及表3的F值檢驗可以看出，β-蒎烯(X2)、3-蒈烯(X3)、β-欖香烯(X6)、β-石竹烯(X7)、β-畢澄茄烯(X8)在中度、重度及對照組別中具有顯著的差異，經過Kruskal-Wallis非參數修正檢驗也得到與顯著性分析相同的結論。最佳判別函數變量組合是β-蒎烯(X2)、3-蒈烯(X3)、β-欖香烯(X6)、β-石竹烯(X7)、β-畢澄茄烯(X8)。判別函數組如下：

F1=314.365X2-4 772.047X3-11 284.045X6-
8 543.329X7-5 505.857X8-30 455.259;
F2=295.842X2-3 998.851X3-11 944.335X6-
9 004.377X7-5 118.902X8-30 884.551;
F3=356.258X2-4 148.387X3-11 747.702X6-
8 848.341X7-5 758.774X8-30 224.547。

對判別函數檢驗，具有顯著性(P=0.023)，對表1中的12株松樹的不同危害程度判別分組正確率為100%。F1、F2、F3分別代表中度、重度及對照組，將每一個觀察值代入3個判別函數，以函數的大小作比較，函數值最大值，表明該對象屬于該組。如果依據F大小，6個指標的重要性依次為：β-蒎烯(X2)、β-欖香烯(X6)、3-蒈烯(X3)、β-石竹烯(X7)、β-畢澄茄烯(X8)。

3 討論

細葉云南松是云南松的一個地理變種，在植物分類學中兩者屬于同一物種，兩者的次生代謝產物也存在著許多共性，它們的揮發成分主要成分為萜烯類、醇類、醛類、酮類、酯類及環氧衍生化合物等大部分分子量低于200的物質。對闊葉及松針類等用材類的葉梢其韌皮組織中揮發物的萃取常采用水蒸氣蒸餾法(楊燕等，2009；田玉紅等，2012)，水蒸氣蒸餾法-萃取法(信平等，2008；Muetal.，2007)會使活潑、容易受到溫度等因素影響的萜類化合物熱異構化或快速的揮發而損失。本研究在分析細葉云南松松梢揮發物成分中首次運用頂空固相微萃取法(head space solid-phase microextraction)，其具有重現性好、對樣品無溶劑干擾、效率高等優點(Steffenetal.,1996)，避免了傳統方法中溫度以及有機溶劑的干擾，也提高了萃取效率，減少了化合物在萃取過程中的流失。通過調整萃取頭、平衡時間、萃取溫度、萃取時間等得出了實驗優化條件為：在75 ℃固相萃取儀上平衡15 min，用75 μm萃取頭(DVB/CAR/PDMS)萃取15 min，在此基礎上得到了最大的萃取效率。這與利用頂空固相微萃取技術研究香椿嫩芽的效率(李聚英等，2011)相近。這也同時表明，頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用技術適用于松針揮發性成分的快速分析。

植物的揮發物質是植物與外界進行聯系的一種重要的信息化合物，并且在昆蟲-寄主識別過程中起主導作用(Lightetal.，2005；Pauletal.，1999)。細葉云南松梢中的萜類、醇類、醛類等揮發物質就是其與昆蟲進行聯系的信號物質，揮發物質的成分和含量的差異會對不同的昆蟲產生或抑制或吸引的應激響應。通過分析不同危害程度的細葉云南松梢的揮發物成分及含量發現，受到重度危害的松梢其分泌出的揮發物質種類最多，且含量也達到最大。所有揮發物中碳氫類化合物含量最高，達到82.245%以上，其次為醇類物質。細葉云南松橫坑切梢小蠹侵害松梢及松針中未檢測到長葉烯成分，而正常松梢中卻含有0.123%的長葉烯，這與馬尾松松針揮發物含有較多的長葉烯成分的特征有所不同，而切梢小蠹危害馬尾松的現象卻較少發生。在研究切梢小蠹的寄主選擇、取食危害等行為與云南松本種揮發物的關系中也發現類似情況，聚集信息化合物含量的差異對切梢小蠹成蟲的活動起到重要的誘導作用(周楠等，2000)。由此推斷長葉烯可能是細葉云南松抗松小蠹危害的揮發物之一。

不同類型松梢的揮發物中含有不同比例的含氧化合物，主要為醇類、醛類、酮類、酯類等，其含量在7.572%～9.225%之間，且倍半萜類含氧衍生物含量遠高于單萜類含氧物，研究松梢揮發物含氧物質的含量與受害程度發現，危害程度加重時揮發物中的含氧化合物含量增加，這表明含氧物質增加抗蟲性下降。這也許是因為揮發物中這些含氧的雜原子化合物，其本身能夠產生典型的焙烤、堅果似的香氣，且具有極高的香氣強度和極低的香氣閾值誘導松小蠹成蟲尋找適合于攻擊、繁殖的寄主材料(Schroeder，1987；Byersetal.，1987；曾茜等，2014)。

不同類型松梢的揮發物主要成分的含量差異也有所差別，其中α-蒎烯、β-蒎烯、3-蒈烯、β-石竹烯、β-畢澄茄烯、β-欖香烯含量與對照比較在中度、重度類型松梢中達到顯著差異水平，這些主要差異成分中單萜與倍半萜各有3個成分，但成分含量差異最大的是單萜中的β-蒎烯、3-蒈烯。且在重度危害類型中β-蒎烯含量最低，而3-蒈烯含量則達到最大值。揮發物中與對照存在顯著差異的主要成分對嫩梢的抗性產生主導作用。這與相關學者研究α-蒎烯、β-蒎烯、3-蒈烯萜類調節松科(Pinaceae)害蟲取食和產卵行為過程中扮演的重要信號作用結果相一致(孟昭軍等，2008；寧眺等，2006；耿樹香等，2006)。通過判別分析表明這些主要成分與危害程度關系依次為：β-蒎烯、β-欖香烯、3-蒈烯、β-石竹烯、β-畢澄茄烯。

4 結論

切梢小蠹危害細葉云南松揮發性物質以重度危害檢測出的組分最多，其中主要為萜烯類、醇類物質。主要代謝揮發產物與其受危害程度密切相關，隨著受害程度的增加，單萜類物質中的主要組分及含量差異顯著。單萜類及倍半萜類含氧衍生物總量隨受害程度增加而增加，含氧化合物增多則其抗蟲性減弱。3-蒈烯、β-蒎烯、β-欖香烯、β-石竹烯和β-畢澄茄烯含量差異是導致細葉云南松誘導橫坑切梢小蠹蟲抗性的主要原因。頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用技術適用于松針揮發性成分的快速分析，本文通過對細葉云南松上橫坑切梢小蠹危害的松梢中的揮發性成分進行分析及評價，為細葉云南松小蠹誘導抗性物質研究及其防治提供了科學參考。