牛胚胎移植技術(shù)產(chǎn)業(yè)化推廣模式探索

□文/李樹靜 王志仙 馮春濤 藺惠良 劉玉 趙增元 朱宏波 張普 孫貴來 余文莉

家畜胚胎移植技術(shù)（ET），尤其是牛胚胎移植技術(shù)經(jīng)過幾十年的研究日趨成熟并在生產(chǎn)中得到了廣泛的應(yīng)用，成為家畜育種和快速擴繁的重要技術(shù)方法。牛胚胎移植技術(shù)是加速遺傳進展及在國家和國際上引種的重要工具。同時，將胚胎冷凍保存有助于保護現(xiàn)有的遺傳資源。目前，可移植胚胎通過在體內(nèi)超數(shù)排卵和胚胎采集（MOET）及活體采卵體外受精（OPU-IVF）獲得。無論是MOET還是OPU-IVF技術(shù)，大量胚胎的產(chǎn)生依賴于對供體母牛使用促卵泡激素（FSH）進行卵巢超數(shù)排卵處理。世界上每年大約產(chǎn)生130萬余枚胚胎，超過90%的經(jīng)過基因選擇模式獲得的種公牛來自胚胎移植。2002年至今，作者團隊累計對全國25個省市自治區(qū)293家企業(yè)、事業(yè)及個體養(yǎng)殖戶進行荷斯坦奶牛及各品種純種肉牛的胚胎生產(chǎn)和移植，包括奶肉牛進口與自產(chǎn)常規(guī)冷凍胚胎、奶牛PCR性別鑒定凍胚及鮮胚及X精子性控胚胎的移植，累計生產(chǎn)高產(chǎn)奶牛胚胎139788枚，移植66570頭次，生產(chǎn)純種肉牛胚胎18013枚，移植10965頭。

供體牛超排反應(yīng)和優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)量的差異是制約牛胚胎移植技術(shù)發(fā)展的一個主要問題，移植妊娠率的波動也會影響其推廣的接受度。在奶牛上，該技術(shù)還受到胚胎性別的制約。對供體牛胚胎生產(chǎn)能力評估、提高胚胎性別鑒定技術(shù)效率和受體牛移植妊娠率有助于該技術(shù)的推廣應(yīng)用。

供體母牛胚胎生產(chǎn)能力的差異性分析

如表1所示，對980頭12月齡以上荷斯坦奶牛連續(xù)4年重復(fù)超排，期間將連續(xù)3次可用胚胎數(shù)低于3枚的供體牛停止沖胚，根據(jù)停止超排時所獲得的可用胚胎總數(shù)和沖胚次數(shù)分組，每組98頭，共分為10組。結(jié)果表明，排名前30%的供體牛沖胚的次數(shù)占總沖胚次數(shù)的60.22%，可用胚胎數(shù)占總可用胚胎的73.07%；排名后30%的供體牛沖胚的次數(shù)占總沖胚次數(shù)的10.33%，可用胚胎數(shù)占總可用胚胎的3.86%。隨著排名次數(shù)的下降，沖胚次數(shù)和平均可用胚數(shù)相應(yīng)下降。排名前30%與后30%的供體牛，平均超排次數(shù)（14.59vs2.5）、平均采胚數(shù)（11.66vs4.78），以及平均可用胚數(shù)（7.36vs2.27）均差異極顯著。

如表2示，獲得可用胚胎最多的10頭供體牛，頭均超排36.3次，可用胚胎392.7枚，每次沖胚可用胚胎10.82枚/頭，其中獲得可用胚胎最多的供體牛連續(xù)超排46次，獲得可用胚胎568枚，平均每次獲得可用胚胎12.35枚。

表1 供體母牛胚胎生產(chǎn)能力的差異性分析Table 7 Analysis on the difference of embryo production capacity of donor cows

表2 荷斯坦奶牛連續(xù)沖胚可用胚胎數(shù)量TOP-10Table 8 The number of embryos available for continuous embryo flushing of Holstein cows is top-10

表3 荷斯坦奶牛連續(xù)沖胚可沖胚次數(shù)TOP-10Table 9 Top-10 times of continuous embryo washing in Holstein cows

如表3所示，沖胚次數(shù)最多的10頭供體牛，頭均超排41.3次，可用胚胎341.7枚，每次沖胚可用胚胎8.27枚/頭，其中最高的供體牛連續(xù)超排了48次，獲得可用胚胎269枚。

選擇性重復(fù)超數(shù)排卵的作用

選擇連續(xù)超排次數(shù)大于等于6次的供體470頭，分別統(tǒng)計每頭供體1～3次、2～4次、3～5次的平均可用胚數(shù)作為自變量，每頭供體牛第4、5、6次的可用胚數(shù)作為因變量，超強度重復(fù)超排前3次與后3次的可用胚數(shù)存在弱正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.13。見圖1。

圖1 選擇性重復(fù)超數(shù)排卵Fig.3 Selective Repeated Superovulation

種公牛凍精對超排結(jié)果的影響

表4 不同種公牛凍精的胚胎生產(chǎn)能力比較Table 10 Comparison of embryo production capacity of different kinds of bull frozen semen

對2016-2020年所使用的21頭供體牛輸精頭數(shù)達100頭以上的荷斯坦種公牛凍精進行胚胎生產(chǎn)效果的評估。如表4所示，不同凍精可用胚率在54%-67%之間，總體平均62.23%。通過不同公牛凍精的可用胚胎比例與未受精卵率關(guān)聯(lián)分析，如圖2所示，在平均獲得未受精卵比例和可用胚胎比例方面存在弱相關(guān)性，R2=0.4405。

凍精 沖胚 未受精 退化 可用 回收 未受精卵可用胚號 頭數(shù) 均數(shù) 均數(shù) 均數(shù) 均數(shù) 比例 比例31911.722.357.6011.6714.76%65.14% 41142.241.627.0610.9320.53%64.63% 51631.651.465.638.7418.88%64.43%63651.531.775.909.2016.62%64.16%71081.062.075.608.7312.09%64.16%82441.571.405.308.2718.95%64.13%91061.402.637.1411.1712.50%63.94%105372.101.836.8210.7419.53%63.47%113101.461.775.508.7316.75%62.96%122682.151.566.219.9221.69%62.62%134351.711.385.108.1920.90%62.31%144842.431.626.5710.6222.92%61.85%154531.801.665.418.8720.29%61.01%167812.311.806.3310.4522.14%60.63%172371.542.406.039.9715.42%60.51%183981.572.375.999.9415.82%60.30%191881.671.364.447.4822.37%59.40%201062.302.205.9210.4322.07%56.80%212213.382.517.0312.9226.14%54.40%合計62931.861.806.029.6819.21%62.23%

圖2 不同公牛凍精未受精卵與可用胚比例關(guān)系Fig.4 Relationship between unfertilized eggs and available embryos in different frozen semen of bulls

季節(jié)變化對超排效果的影響

對2015～2020年河北省12587頭次荷斯坦奶牛育成牛（12～15月齡）超排反應(yīng)隨季節(jié)的變化進行分析。平均總胚數(shù)和可用胚胎數(shù)隨季節(jié)的變化波動一致，4、5、12月份的平均總胚數(shù)和可用胚胎數(shù)極顯著或顯著高于其它月份，而8、9月份的平均總胚數(shù)和可用胚胎數(shù)極顯著或顯著低于其它月份，詳見圖3和表5。平均未受精卵數(shù)8月份極顯著低于3月份（P＜0.01），退化胚胎數(shù)9月份顯著低于5月份（P＜0.05），其余月份差異不顯著。

表5 沖胚月份對沖胚效果影響Table 11 Effect of the month of embryo flushing on the effect of embryo flushing

不同的大寫字母間差異極顯著（P＜0.01）；不同的小寫字母間差異極顯著（P＜0.05）

圖3 沖胚月份對沖胚效果影響Fig.5 Effect of the month of embryo flushing on the effect of embryo flushing

性別鑒定胚胎的移植妊娠率和產(chǎn)犢準(zhǔn)確率

在奶牛場，應(yīng)用胚胎性別鑒定技術(shù)可增加所期望性別的后代數(shù)量并節(jié)省受體成本，保證以最低的成本獲得所需性別的犢牛。胚胎性別鑒定已被證明能優(yōu)化受體的

表6 性別鑒定胚胎的移植妊娠率和產(chǎn)犢準(zhǔn)確率的分析Table 12 Analysis of pregnancy rate and calving accuracy of sex identification embryo transfer

不同的大寫字母間差異極顯著（P＜0.01）；不同的小寫字母間差異極顯著（P＜0.05）。

*僅統(tǒng)計客戶準(zhǔn)確記錄并反饋了犢牛性別的犢牛頭數(shù)。**受體牛均為荷斯坦育成牛或黃牛，用CIDR-PG法進行同期發(fā)情處理。

表7 產(chǎn)后母牛雙同期首配實施雌性胚胎移植對年度產(chǎn)母犢率的影響（2019.7～2020.6）Table 13 Effect of female embryo transfer on the annualcalving rate of postpartum cows（July 2019 to June 2020）

不同的大寫字母間差異極顯著（P＜0.01）。奶牛產(chǎn)后65±3天和72±3天分別用常規(guī)凍精人工授精或用雌性胚胎移植。利用。如表6所示，PCR胚胎性別鑒定技術(shù)雌性率極顯著高于常規(guī)凍胚，但移植妊娠率顯著低于后者（P＜0.05）。如表7所示，該基地近1年雌性胚胎移植占經(jīng)產(chǎn)牛參配牛的42.47%，雌性胚胎準(zhǔn)確率99.29%，年度產(chǎn)母犢率極顯著高于單純使用常規(guī)凍精輸精（68.96%vs51.05%）。

季節(jié)對受體母牛移植妊娠率的影響

對2003～2019年全部移植數(shù)據(jù)分析，10月份移植妊娠率顯著低于4、6、7、9月，其余月份差異不顯著。

圖4 不同月份對受體移植效果的影響Fig.6 The effect of different months on recipient transplantation

自然發(fā)情和同期發(fā)情的效果分析

如表8所示，盡管自然發(fā)情的受體牛移植妊娠率低于同期發(fā)情牛，但因其利用率極顯著高于后者，因此以處理牛計算其受胎率顯著高于同期發(fā)情牛。

產(chǎn)后奶牛首配實施胚胎移植的效果

如圖5所示，對產(chǎn)后奶牛用雙同期-定時輸精程序處理，分別在產(chǎn)后65±3天和72±3天用常規(guī)凍精人工授精或用雌性胚胎移植，各月份及年度總移植妊娠率和人工授精發(fā)情期受胎率之間均無顯著差異（總計：42.33%vs43.28%）。

圖5 產(chǎn)后奶牛首配實施胚胎移植的效果Fig.7 Effect of embryo transfer on postpartum cows

未來10年，我們?nèi)砸泽w內(nèi)胚胎產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用為主，并加大OPU-IVF技術(shù)研發(fā)與推廣力度，提高效率，最終形成可與現(xiàn)有體內(nèi)胚胎性別鑒定技術(shù)體系相媲美的牛體外性控胚胎生產(chǎn)技術(shù)體系。

表8 自然發(fā)情和同期發(fā)情的效果分析Table 14 Effect analysis of natural estrus and synchronous estrus

馬亞賓團隊成員查看剛采集的奶牛卵細胞

奶牛活體采卵作業(yè)