耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌流行病學(xué)分析

陳燁 孫守棟 周芳美 楊雪靜

肺炎克雷伯菌屬于革蘭陰性條件性致病菌，可引起肺炎、神經(jīng)系統(tǒng)感染、肝膿腫、皮膚軟組織感染、泌尿系感染及敗血癥等多種臨床感染［1］。碳青霉烯類(lèi)抗生素是治療產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶腸桿菌科感染的首選藥物［2］，但隨著該類(lèi)抗生素的廣泛使用，耐碳青霉烯類(lèi)肺炎克雷伯菌（CRKP）逐漸在各個(gè)國(guó)家及地區(qū)流行［3-4］，成為臨床治療的難點(diǎn)。如同時(shí)攜帶毒力因子，則對(duì)臨床治療構(gòu)成嚴(yán)重威脅［5］。肺炎克雷伯菌毒力因子主要分為脂多糖、莢膜、鐵攝取系統(tǒng)相關(guān)因子、外膜孔蛋白、尿囊素代謝相關(guān)基因等［5］，其中莢膜是重要的毒力因素，可促進(jìn)菌株的黏附、抗吞噬、抗血清殺菌和遠(yuǎn)處定植［6］。為進(jìn)一步明確本地區(qū)CRKP菌株耐藥特點(diǎn)及其攜帶毒力因子的情況，作者對(duì)臨床分離的CRKP菌株進(jìn)行耐藥表型及毒力因子檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源 收集2019年8月至2020年1月浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院分離的CRKP菌株43株，剔除同一患者重復(fù)菌株。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922。

1.2 主要試劑及儀器 細(xì)菌核酸提取盒、10×Ace Taq PCR Buffer（含Mg2+）、dNTP mix、Ace Taq與DNA Marker購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；質(zhì)譜儀（Bruker）、Vitek-2 Compact 全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)（法國(guó)生物梅里埃公司）、PCR 儀（美國(guó) Bio-Rad 公司）、電泳儀及紫外凝膠成像儀（上海天能科技有限公司）；擴(kuò)增引物合成及PCR產(chǎn)物測(cè)序由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司完成。

1.3 菌株鑒定 挑取血平板上24 h培養(yǎng)的菌落，涂布細(xì)菌于靶板，經(jīng)MALDI-TOF質(zhì)譜儀鑒定確認(rèn)，鑒定率需達(dá)到2.0以上。

1.4 藥敏試驗(yàn) 采用Vitek-2 Compact微生物分析系統(tǒng)進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，瓊脂稀釋法確認(rèn)碳青霉烯類(lèi)藥物敏感性，藥敏結(jié)果采用美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLIS）推薦標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷。

1.5 高黏液表型檢測(cè) 用接種環(huán)挑取血平板待測(cè)菌株，挑起的黏液絲長(zhǎng)度若≥5 mm，為黏液絲試驗(yàn)陽(yáng)性，重復(fù)≥3次確定為高黏液菌株。

1.6 毒力因子PCR擴(kuò)增及序列分析 采用PCR檢測(cè)莢膜血清型K1、K2、K57、K5、K20、K54，毒力基因uge、wabG、ycf、ureA、fimH、rmpA、rmpA2、aerobactin、iucA、peg-344、magA、wcaG、ybtA、kfuB、iroB、alls、iutA、entB，Hcp和外膜孔蛋白Ompk35、Ompk36基因。陽(yáng)性產(chǎn)物送北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測(cè)序，序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)。Hcp引物由Primer5軟件設(shè)計(jì)而成（Hcp-F：CCACATTCACCAGGAAACCC；Hcp-R：GCATCGGACAGCCAAAGG）。反應(yīng)體系、反應(yīng)條件及引物合成參照文獻(xiàn)［7-11］。

2 結(jié)果

2.1 科室及臨床來(lái)源分布 CRKP菌株來(lái)源及科室分布見(jiàn)表1、表2。

表1 CRKP標(biāo)本分布

表2 CRKP科室分布

2.2 CRKP藥敏結(jié)果 43株菌對(duì)頭孢菌素、β-內(nèi)酰胺酶抑制劑、碳青霉烯類(lèi)耐藥率最高，對(duì)氨曲南、環(huán)丙沙星、左旋氧氟沙星、復(fù)方新諾明、多西環(huán)素及米諾環(huán)素耐藥率均>90%，對(duì)替加環(huán)素及粘菌素耐藥率較低。見(jiàn)表3。

表3 CRKP耐藥性情況

2.3 高黏液及莢膜型檢測(cè) 黏液絲試驗(yàn)顯示16.3%菌株為高黏液表型。發(fā)現(xiàn)1株K5莢膜陽(yáng)性菌株，且為高黏液表型，未檢出其他莢膜血清型。

2.4 毒力基因檢測(cè) 18種毒力基因中uge、wabG、ycf、ureA、entB及fimH基因檢出率最高，均>90%，未檢測(cè)到iroB、alls、magA和wcaG基因。見(jiàn)表4。攜帶12種毒力基因菌株所占比例最高，均攜帶uge+wabG+fimH+rmpA+ycf+ureA+ybtA+iutA+entB+rmpA2+iucA+peg-344基因。見(jiàn)表5。

表4 CRKP毒力基因攜帶情況分析

表5 CRKP攜帶毒力基因種數(shù)分析

2.5 Hcp、Ompk35、Ompk36基因檢測(cè) 4.7%菌株缺失Hcp基因，9.3%菌株缺失外膜孔蛋白基因，2株缺失Ompk35、Ompk36和Hcp基因菌株未檢測(cè)到毒力基因。見(jiàn)圖1、圖2。

圖1 Hcp基因產(chǎn)物測(cè)序峰圖

圖2 Ompk36基因電泳圖

3 討論

肺炎克雷伯菌是引起社區(qū)獲得性及院內(nèi)感染的重要腸桿菌科細(xì)菌，隨著碳青霉烯類(lèi)抗生素的廣泛使用，CRKP不斷增多，耐藥性逐漸增強(qiáng)。中國(guó)細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)報(bào)告顯示，2017、2018年肺炎克雷伯菌對(duì)亞胺培南和美羅培南的耐藥率分別為20.9%、24.0%和25.0%、26.3%，呈逐步上升趨勢(shì)［12-13］。CRKP對(duì)臨床常用抗生素耐藥率高，僅對(duì)粘菌素和替加環(huán)素顯示出較好的敏感性，產(chǎn)碳青霉烯酶是CRKP耐藥的主要機(jī)制之一，轉(zhuǎn)座子、質(zhì)粒等遺傳元件傳播可使CRKP感染爆發(fā)流行。本資料結(jié)果顯示，CRKP對(duì)頭孢菌素類(lèi)、氨基糖苷類(lèi)、喹諾酮類(lèi)、磺胺類(lèi)、單環(huán)內(nèi)酰胺類(lèi)、多肽類(lèi)等均有不同程度耐藥，且多為ICU患者，預(yù)后不佳，病死率較高，給臨床抗感染治療帶來(lái)困難。

CRKP可通過(guò)鐵攝取系統(tǒng)毒力因子（aerobactin、iutA、iucA、ybtA、entB、iroB、alls、kfuB）、黏附因子（fimH、mrkD）、莢膜因子（uge、wabG、ycf）、毒素因子（magA、rmpA、rmpA2、wcaG）、尿囊素調(diào)節(jié)因子（ureA）等增加黏附、侵襲、抗吞噬等能力。將aerobactin基因插入低毒力肺炎克雷伯菌可增強(qiáng)肺炎克雷伯菌毒力與侵襲性。李喜紅等［14］發(fā)現(xiàn)CRKP菌株aerobactin基因攜帶率較低，本資料中僅發(fā)現(xiàn)1株攜帶aerobactin基因菌株，與其結(jié)果相符。CANDAN等［15］發(fā)現(xiàn)>80% CRKP菌株含有黏附因子、鐵攝取系統(tǒng)毒力基因，本資料中>74% CRKP菌株攜帶uge、wabG、ycf、entB、ureA、fimH、ycf、ybtA、iucA、iutA、rmpA2基因，這些因子不僅可以增強(qiáng)黏附、侵襲力，且能夠表達(dá)自我保護(hù)成分，對(duì)菌株致病性具有重要意義。有報(bào)道稱(chēng)rmpA、rmpA2、iroB、iucA及peg-344能夠作為高毒力肺炎克雷伯菌的鑒定指標(biāo)，準(zhǔn)確率>95%［16］，本資料未發(fā)現(xiàn)此類(lèi)菌株，可能與肺炎克雷伯菌獲得高耐藥表型時(shí)丟失毒力因子以及高毒力肺炎克雷伯菌難以獲得耐藥質(zhì)粒有關(guān)。

莢膜多糖是肺炎克雷伯菌重要的毒力因子，可對(duì)抗中性粒細(xì)胞的吞噬作用，其中K1、K2、K57、K5、K20和K54莢膜型與人類(lèi)的侵襲性感染密切相關(guān)。K1莢膜型易見(jiàn)于肝膿腫、菌血癥等，K1、K2及K5莢膜型致病性強(qiáng)，且與嚴(yán)重感染有關(guān)。耐碳青霉烯類(lèi)高黏液肺炎克雷伯菌（CR-HMKP）會(huì)引起難以治愈的感染，報(bào)道稱(chēng)高黏液菌株K抗原檢出率達(dá)85%［17］，本資料中，7株CR-HMKP菌株僅1株檢測(cè)到K5莢膜型，考慮可能存在其他莢膜型亞型或高耐藥表型減弱了莢膜型的表達(dá)；另外K5莢膜型CR-HMKP菌株攜帶10種毒力基因，且為ICU患者，糖尿病慢性病史，住院時(shí)間長(zhǎng)，有多種抗生素使用及侵襲性操作史，治療效果不佳，應(yīng)引起臨床高度重視。Hcp是VI型分泌系統(tǒng)（T6SS）核心組成部分，在細(xì)菌的致病性發(fā)揮重要作用，DU等［17］發(fā)現(xiàn)攜帶Ompk36基因的菌株毒力較強(qiáng)。本資料中Hcp、Ompk35和Ompk36基因陽(yáng)性率高，同時(shí)Ompk35、Ompk36和Hcp基因缺失菌株未檢測(cè)到毒力基因，3種基因缺失是否影響菌株毒力基因攜帶需進(jìn)一步探究。