實時熒光PCR檢測在臨床血流感染診斷中的應用

劉久磊 孟憲濤 龐瑞昌

調查資料證實，不論是兒童或者成人患者中，菌血癥均較為常見且發病率較高，若病原菌未能得到準確的鑒定而選擇錯誤的抗生素治療，非常容易導致患者死亡[1]。因此，采取快速有效的方法對病原菌快速診斷，以此選擇合理用藥具有重要的意義[2]。在當前臨床工作中，傳統血培養仍然被當作是診斷血流感染的最佳標準，不僅能夠從血流當中檢測出是否存在病原菌，同時還可對已經分離的病原菌進行藥敏試驗[3-4]。近年來，隨著現代化診斷技術的不斷發展，分子生物學及基因診斷技術在血流感染診斷中得到了更多的應用[5]。現將熒光聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）法應用于臨床血流感染診斷中，旨在獲得更好的檢測結果，報告如下。

1 資料及方法

1.1 一般資料

收集2018年3月—2020年3月醫院檢驗科微生物實驗室檢測的145份疑似感染血樣標本。該研究經過醫院醫學倫理會審核批準。全部血樣標本的采集按照嚴格相關標準執行，成人使用雙套瓶，每套包括了需氧瓶及厭氧瓶，確保每瓶采血量為8～10 mL。

1.2 方法

全部血樣標本均進行微生物培養及藥物敏感性檢測，取培養18～24 h的細菌菌落，采用法國生物梅里埃全自動微生物分析系統進行檢測，藥敏試驗結果按照美國臨床實驗室標準化委員會M100-S27標準進行判斷。質控菌株均購買自衛生部臨檢中心。

熒光PCR操作方法：嚴格按照《全國臨床檢驗操作規程（第4版）》的要求操作，抽取1 mL的培養物，嚴格按照操作試驗說明書，將樣本核酸提取出來后用于PCR反應；將樣本核酸、陰性對照品及陽性對照品分別加入到各個PCR混混合液的多聯管內，采用熒光定量PCR儀對采集到的樣本進行測量[6]。PCR擴增的操作方法如下：37℃×2 cm，94℃×2 min，循環1次；93℃×15 s，60℃×60 s，共循環40次；單點熒光檢測控制在60℃，熒光通道選擇為FAM、ROX、JOE，反應體系為20μL[7]。全部血培養瓶均按照常規程序進行染色處理，同時轉種在血品行板進行細菌培養與鑒定，對兩種檢測結果進行對比。

1.3 觀察指標

對比熒光PCR及傳統血培養法病原體檢出情況，記錄病原菌種類分布。采用熒光PCR法對各病原菌基因檢測，并將熒光PCR方法獲得的結果與傳統血培養細菌鑒定儀鑒定結果進行對比，并將后者作為“金標準”，探討熒光PCR在臨床血流感染診斷中的敏感度及特異度。同時記錄PCR方法檢測陽性病原菌的科室分布情況。

1.4 統計學處理

采用SPSS 20.0軟件對數據進行處理，計數資料表示為（n，%）。

2 結果

2.1 熒光PCR及傳統血培養法病原體檢出情況對比

該組樣本共145份，熒光PCR法檢出98株病原體陽性標本，陽性率為67.59%（98/145），傳統血培養法檢出95株病原菌陽性標本，陽性率為65.52%（95/145）。見表1。

表1 熒光PCR及傳統血培養法病原體檢出情況對比

2.2 熒光PCR及傳統血培養法血流感染病原體的敏感性及特異性分析

熒光PCR敏感度為98.95%（94/95）、特異度92.00%（46/50），兩種方法相符樣本140份，其一致性為96.55%（140/145）。見表2。

表2 熒光PCR及傳統血培養法血流感染病原體的敏感性及特異性分析（份）

2.3 PCR方法檢測陽性病原菌的科室分布

熒光PCR法檢出98株病原體陽性標本，行科室分布調查時可見，病原菌在ICU內科室分布率最高（22.45%）、其次是腎內科（18.37%）、血液內科（15.31%）。見表3。

表3 PCR方法檢測陽性病原菌的科室分布（n=98）

3 討論

血流感染作為臨床上一類發病率較高且較為嚴重的感染性疾病，當血流感染持續存在之后，則可引起一系列的高熱以及心動過速等表現，嚴重時可進一步加重病情而導致多器官功能衰竭，甚至引起患者死亡。因此，明確判斷血液中病原菌的種類在幫助診斷血流感染以及選擇抗菌方案上具有重要的臨床意義。既往臨床工作中所實施的常規血培養方法所獲得的陽性率并不高，同時存在著微生物培養時間過長的情況，無法充分滿足臨床應用需求。因此，在本次研究中，我院為了進一步的探討最佳檢測方法，對熒光PCR技術進行了探索及應用。

近年來的調查資料顯示，熒光PCR技術隨著當前醫療技術的不斷發展及革新，正在快速的替代傳統微生物檢測方法，該項操作技術可在反應管當中一次性的完成PCR反應及產物分析的過程，同時可自動的完成相應數據的動態監測與分析，極大程度的減少了交叉感染的發生率[8]。另外，熒光PCR技術的操作方法較為簡便，操作速度較快，定量比較精確，敏感度較高，且能夠重復操作，應用價值較為突出[9]。不過在當前的臨床工作中，可用于血流感染的分子定量測定方法較少，大多臨床工作者未能掌握血流感染患者血中病原菌DNA的真正含量[10]。現我院就PCR檢測在臨床血流感染診斷中的應用價值進行分析，旨在探討PCR操作技術的臨床優勢性。

本次結果顯示，該組樣本共145份，熒光PCR法檢出98株病原體陽性標本，陽性率為67.59%（98/145），傳統血培養法檢出95株病原菌陽性標本，陽性率為65.52%（95/145），兩組病原體檢出情況無明顯差異（P＞0.05）。結果證實了熒光PCR方法的應用同樣具有一定的優勢性，在本次結果當中，7種較為常見的血流感染微生物均表現出了單一擴增條帶，并具有著較為良好的區分度。另外，同時熒光 PCR 敏感度為 98.95%（94/95）、特異度92.00%（46/50），兩種方法相符樣本 140 份，其一致性為 96.55%（140/145）。在研究中我們發現，熒光PCR方法的應用相比于傳統血培養能夠操作簡便且能夠在短時間內完成相應的檢測，同時可根據熒光的對術增加及擴增曲線直接獲得結果，相比于普通PCR而言，省略了操作上比較復雜的步驟，應用前景更加的突出，符合以往報道[11-12]。另外，對PCR方法檢測陽性病原菌的科室分布進行觀察時可見，病原菌在ICU內科室分布率最高（22.45%）、其次是腎內科（18.37%）、血液內科（15.31%），原因是ICU患者的基礎情況比較差，病情重且合并癥較多，多需要進行侵入性檢查或插管等，而腎內科患者多為需要進行血液透析治療的尿毒癥及腎衰竭患者，且同樣需要置管操作，而血液科患者存在著白細胞功能缺陷或數目減少的等情況，這就使得絕大多數患者的免疫功能發育不全及抵抗力降低等情況，這也為血流感染也增加了機會。值得注意的是，不同科室之間的有創性操作均能夠對機體黏膜造成屏障，并增加血流感染的發生風險。在實際工作中發現，PCR方法同樣存在著一定的不足，主要表現為病原菌譜容易受到地區、人群及季節等多種因素的影響，同樣有一定的幾率出現誤差。因此，在對PCR檢測系統方法進行設計時，需要事先做好相應的調查研究，以此更好的提高陽性率。

綜上所述，熒光PCR方法與傳統血培養細菌鑒定儀鑒定血流感染的結果具有較高的一致性，但前者相比于后者不僅優化了操作上的流程，縮短了操作獲得報告的時間，同時也在一定程度上提高了檢出率。