濕態發酵豆粕對肉雞生長性能、抗氧化能力和腸道健康的影響

魯春靈 李軍國 蔣萬春 于紀賓 楊 潔*

(1.中國農業科學院飼料研究所，北京 100081；2.河北工程大學生命科學與食品工程學院，邯鄲 056038)

發酵飼料原料是指將單一飼料原料作為發酵底物，接種單一或復合菌種再通過發酵工程技術發酵3～5 d后制成的原料[1]。發酵飼料原料具有較低的抗營養因子、較小的蛋白分子質量以及富含活性益生菌等特點。飼糧中添加一定比例的發酵飼料原料不僅能提高動物的飼料轉化效率和生長性能，而且可以抑制有害菌的生長和疾病發生，特別是緩解動物營養性腹瀉的問題。因此，從動物健康水平以及動物食品安全性角度出發，發酵飼料原料可以在一定程度上減少抗生素等藥物的使用[2]。

豆粕粗蛋白質含量為43%～46%，不但蛋白質含量高，而且氨基酸平衡良好，除了半胱氨酸與蛋氨酸外，必需和非必需氨基酸比例都很高[3]。然而，豆粕中含有一定的抗營養因子，這降低了蛋白質和礦物質等的消化率，降低了豆粕蛋白質的營養價值，導致畜禽消化和代謝疾病，從而降低了畜禽的生長性能和價值。與豆粕相比，發酵豆粕降低了豆粕中的抗營養因子含量，半纖維素和植酸磷含量也顯著下降，而且還能利用發酵微生物的菌體蛋白質，粗蛋白質含量提高約10%，并且三氯乙酸可溶性蛋白、小肽和游離氨基酸的含量也提高了6.5倍；同時，發酵豆粕中的高濃度乳酸和低pH抑制了腸桿菌科細菌的增殖[4]。因此，發酵豆粕在畜禽生產中被廣泛應用。

相關研究表明，發酵濕飼料飼喂肉仔雞可降低胚胎死亡率，提高雛雞的出欄數[5]。發酵飼料飼喂雛雞后，十二指腸和盲腸中乳桿菌總數顯著升高，而乳酸菌分泌乳酸降低胃腸道pH，從而抑制大腸桿菌生長。濕發酵芝麻粕和黑曲霉發酵銀杏葉對肉仔雞、肉鴨的脂肪代謝、胸肌肉品質和脂肪酸組成都有積極的影響，黑曲霉發酵銀杏葉還可以減少脂質過氧化[6-7]。發酵豆粕、發酵橄欖葉和發酵濕飼料均可以顯著提高肉雞的生長性能和屠宰性能，降低腹脂率[8-10]。復合菌制劑和發酵木薯廢漿通過提高盲腸內容物中丁酸和丙酸含量來改善肉雞腸道對病原體的過度炎癥反應[11-12]。發酵豆粕和發酵濕飼料可以抑制沙門氏菌在腸道和內臟器官的定植和侵襲，降低異嗜性細胞與淋巴細胞比值，改善腸道組織形態和健康[13-14]。肉雞飼喂益生菌發酵飼料后，發現消化性能、血清白細胞介素-4含量以及淀粉酶、蛋白酶等消化酶活性都顯著提高[15]。研究還表明，發酵豆粕和菜籽粕能通過提高肉雞血漿中免疫球蛋白含量、血清中新城疫病毒的酶聯免疫吸附試驗(ELISA)效價、細胞介導的免疫反應(CMI)值以及新城疫病毒抗體滴度來改善免疫應答[16-19]。

發酵飼料原料在畜禽養殖中應用廣泛，但固態發酵烘干過程增加了飼料企業成本同時還降低了益生菌活性。濕態發酵原料可以降低飼料加工成本的同時保護益生菌活性，但是濕態發酵原料由于水分含量高，在畜禽養殖中添加量受到限制，實際生產中濕態發酵原料添加比例在5%左右，益生菌活性得不到很好的利用，濕態發酵原料在畜禽生產應用中鮮有報道。因此，本文旨在通過研究飼糧添加不同比例濕態發酵豆粕對肉雞生長性能、抗氧化能力和腸道健康的影響，從而為肉雞養殖提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

試驗選取1日齡科寶肉仔雞768只，按體重相近原則隨機分為4組，每組12個重復，每個重復16只雞(公母各占1/2)。對照組(F0組)飼喂不添加濕態發酵豆粕的基礎飼糧，基礎飼糧為參照NRC(1994)[20]營養需要配制的配合飼料；試驗組飼喂在基礎飼糧中分別添加6%(F6組)、8%(F8組)和10%(F10組)濕態發酵豆粕(活菌數為4.34×106CFU/g)的試驗飼糧，其中濕態發酵豆粕和玉米粉按3∶7比例預混合后再添加到配合飼料中。各組飼糧組成及營養水平見表1。試驗期42 d，期間肉仔雞自由采食、充足飲水，按正常免疫程序進行免疫接種。

表1 飼糧組成及營養水平(風干基礎)

1)濕態發酵豆粕水分含量為44.01%。The moisture content in wet fermented soybean meal was 44.01%。

1.2 指標檢測

1.2.1 飼糧中有益菌數量

飼糧中芽孢桿菌、乳酸菌和酵母菌數量測定參考劉曉明等[21]的方法。

1.2.2 生長性能

每日觀察并記錄雞群發病和死亡只數，分別于21和42日齡每個重復隨機選取1只雞進行個體空腹稱重，統計試驗期內的采食量，計算各組前期(1～21日齡)、后期(22～42日齡)和全期(1～42日齡)的平均體重、平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G)。計算公式為：

ADFI(g/d)=總耗料量/(只數×天數)；
ADG(g/d)=總增重/(只數×天數)；
F/G=總耗料量/總增重。

1.2.3 屠宰性能

42日齡時，每重復隨機挑選1只肉雞，頸靜脈放血處死，測定屠宰率、全凈膛率、胸肌率和腿肌率。計算公式為：

屠宰率(%)=100×屠體重/活體重；
全凈膛率(%)=100×全凈膛重/活體重；
胸肌率(%)=100×胸肌重/全凈膛重；
腿肌率(%)=100×腿肌重/全凈膛重。

1.2.4 免疫器官指數

42日齡時，每個重復隨機選取1只肉雞，頸靜脈放血處死，分離脾臟和法氏囊并稱重，計算免疫器官指數。

免疫器官指數(mg/g)=免疫器官重/活體重。

1.2.5 肉品質

42日齡時，每個重復隨機選取1只肉雞，屠宰解剖后，統一取左側和右側整塊胸肌和腿肌，測定肉品質。

1)肉色：取樣現場立即測定。采用CR-10全自動色差計測定胸肌和腿肌新鮮切面的亮度(L*)值、紅度(a*)值和黃度(b*)值。

2)滴水損失：試驗第42天時，將肉雞胸肌修整為3 cm×2 cm×1 cm的肉塊，稱重(W1)，然后用細鐵絲鉤住肉樣，使肌纖維垂直向下，懸吊于4 ℃，24 h后取出肉樣后稱重(W2)，計算24 h滴水損失；再過24 h后取出肉樣稱重(W3)，計算48 h滴水損失；再過24 h后取出肉樣稱重(W4)，計算72 h滴水損失。每個樣品2個平行，計算公式為：

24 h滴水損失(%)=100×(W1-W2)/W1；
48 h滴水損失(%)=100×(W1-W3)/W1；
72 h滴水損失(%)=100×(W1-W4)/W1。

3)pH：胸肌置于4 ℃中保存24 h后，將HANNA HI8424C酸度計(意大利)的電極頭插入肌肉中(深度不小于1 cm)，電極頭部完全包埋后讀取pH。每個樣品于不同位置測量3次，結果取其平均值。

4)蒸煮損失：試驗第42天，屠宰肉雞，用取樣器切取肉塊，并去除結締組織，再用密封袋包裝。在4 ℃條件下熟化24 h，稱取胸肌重量(W1)。之后在Thermopet NTT-1100恒溫水浴鍋(日本)中75 ℃水浴15 min，用濾紙擦干，稱胸肌重量(W2)，蒸煮損失計算公式為：

蒸煮損失(%)=100×(W1-W2)/W1。

5)剪切力：將測定蒸煮損失后的樣品順著肌纖維方向切為截面為1 cm×1 cm的3個肉條，再以垂直肌纖維方向采用TA-XY2i質構儀(美國)對其進行剪切，每個肉條剪切1次，讀取3次剪切力讀數的平均值。

1.2.6 血清生化和抗氧化指標

42日齡時，每個重復隨機選取1只肉雞，頸靜脈放血處死，取血，4 000 r/min離心5 min分離血清，-20 ℃保存待測。測定血清中總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)、尿素氮(UN)和丙二醛(MDA)含量、總抗氧化能力(T-AOC)以及谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)活性。上述指標采用科華ZY KHB-1280全自動生化儀(上海)測定。

1.2.7 小腸組織形態

42日齡時，每個重復隨機選取1只肉雞，剪取十二指腸、空腸和回腸組織，用生理鹽水洗凈內容物后，置于4%多聚甲醛中固定。組織經脫水、包埋后，制作厚度為4 μm組織切片，并進行蘇木精-伊紅(HE)染色。每例樣本選取3個完整的典型絨毛和隱窩，使用醫學圖像分析軟件ImagePro Plus 7.0測量絨毛高度和隱窩深度，并計算絨毛高度/隱窩深度(V/C)值。

1.2.8 盲腸微生物

盲腸微生物測定參考劉鳳美等[22]的方法。

1.3 數據統計分析

試驗數據采用SPSS 20.0統計軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，采用Duncan氏法進行多重比較，顯著性水平為P<0.05，結果用“平均值±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 濕態發酵豆粕對飼糧中有益菌數量的影響

由表2可知，與對照組(F0組)相比，試驗組1～21日齡飼糧中芽孢桿菌和乳酸菌數量以及22～42日齡飼糧中芽孢桿菌、乳酸菌和酵母菌數量均顯著提高(P<0.05)，F10組1～21日齡飼糧中酵母菌數量顯著提高(P<0.05)。

表2 濕態發酵豆粕對飼糧中有益菌數量的影響

2.2 濕態發酵豆粕對肉雞生長性能的影響

由表3知，與F0組相比，F10組肉雞1～21日齡平均體重顯著提高(P<0.05)，其他各試驗組差異不顯著(P>0.05)；與F0組、F6組和F8組相比，F10組肉雞1～21日齡料重比顯著降低(P<0.05)，F0組、F6組和F8組之間差異不顯著(P>0.05)；各組肉雞1～21日齡平均日采食量和平均日增重之間差異均不顯著(P>0.05)。

與F0組和F6組相比，F8組和F10組肉雞22～42日齡平均體重顯著提高(P<0.05)，平均日采食量顯著提高(P<0.05)；與F0組相比，F10組肉雞22～42日齡平均日增重顯著提高(P<0.05)，其他各試驗組差異不顯著(P>0.05)；與F0組相比，F8組和F10組肉雞22～42日齡料重比顯著降低(P<0.05)，F6組差異不顯著(P>0.05)。

與F0組相比，F8組和F10組肉雞1～42日齡平均日增重顯著提高(P<0.05)，F6組差異不顯著(P>0.05)；各組肉雞1～42日齡平均日采食量和料重比之間差異均不顯著(P>0.05)。

表3 濕態發酵豆粕對肉雞生長性能的影響

2.3 濕態發酵豆粕對肉雞屠宰性能的影響

由表4可知，隨著濕態發酵飼料添加比例的提高，各組肉雞屠宰率、全凈膛率和腿肌率均有升高的趨勢，但差異不顯著(P>0.05)，這說明添加濕態發酵豆粕可以獲得較多的可食用肉質[23]。

表4 濕態發酵豆粕對肉雞屠宰性能的影響

2.4 濕態發酵豆粕對肉雞免疫器官指數的影響

由表5可知，隨著濕態發酵豆粕添加比例的提高，各組肉雞脾臟指數和法氏囊指數有升高的趨勢，但差異不顯著(P>0.05)，這說明濕態發酵豆粕對機體的免疫機能有一定的促進作用。

表5 濕態發酵豆粕對肉雞免疫器官指數的影響

2.5 濕態發酵豆粕對肉雞肉品質的影響

由表6可知，隨著濕態發酵豆粕添加比例的提高，各組肉雞胸肌和腿肌的肉色有升高的趨勢，但差異不顯著(P>0.05)。肉的顏色是影響消費者購買肉產品的最主要因素，肉色提高可以得到更多消費者青睞[24]。

表6 濕態發酵豆粕對肉雞肉色的影響

由表7可知，與F0組、F6組和F10組相比，F8組肉雞胸肌pH顯著降低(P<0.05)，優質雞肉的pH為6.0～6.5[25]，F0組和F8組不符合優質雞肉標準。隨著濕態發酵豆粕添加比例的提高，各組肉雞胸肌蒸煮損失、剪切力和滴水損失有降低趨勢，但差異不顯著(P>0.05)，這說明濕態發酵豆粕可以提高肉雞肌肉系水力，進而改善肌肉嫩度和口感[26]。

表7 濕態發酵豆粕對肉雞胸肌肉品質影響

2.6 濕態發酵豆粕對肉雞血清生化和抗氧化指標的影響

由表8可知，隨著濕態發酵豆粕添加比例的提高，各組肉雞血清ALB、IgM和IgA含量有升高趨勢，但各組血清生化指標差異不顯著(P>0.05)。免疫球蛋白廣泛參與動物機體的體液免疫[27]，本試驗結果說明濕態發酵豆粕對肉雞的體液免疫具有一定的促進作用。

表8 濕態發酵豆粕對肉雞血清生化指標的影響

由表9可知，與F0組相比，F10組肉雞血清SOD活性顯著提高(P<0.05)，其他各試驗組差異不顯著(P>0.05)；與F0組相比，F6組、F8組和F10組肉雞血清MDA含量顯著降低(P<0.05)；各組間其他血清抗氧化指標差異不顯著(P>0.05)。

表9 濕態發酵豆粕對肉雞血清抗氧化指標的影響

2.7 濕態發酵豆粕對肉雞小腸組織形態和盲腸微生物的影響

由表10可知，與F0組和F6組相比，F8組和F10組肉雞十二指腸絨毛高度顯著提高(P<0.05)；與F0組、F6組和F8組相比，F10組肉雞十二指腸隱窩深度顯著降低，F8組肉雞十二指腸隱窩深度顯著低于F0組(P<0.05)；與F0組、F6組和F8組相比，F10組肉雞十二指腸V/C值顯著提高(P<0.05)，F8組肉雞十二指腸V/C值與F0組和F6相比顯著提高(P<0.05)，F0組和F6組差異不顯著(P>0.05)。

表10 濕態發酵豆粕對肉雞小腸組織形態的影響

與F0組相比，F6組、F8組和F10組肉雞空腸絨毛高度和V/C值顯著提高(P<0.05)；與F0組和F6組相比，F8組和F10組肉雞空腸V/C值顯著提高(P<0.05)；各組肉雞空腸隱窩深度差異不顯著(P>0.05)。

與F0組相比，F6組、F8組和F10組肉雞回腸絨毛高度和V/C值顯著提高(P<0.05)；F8組和F10組肉雞回腸隱窩深度顯著降低(P<0.05)，F6組差異不顯著(P>0.05)。各組肉雞十二指腸、空腸和回腸的組織切片見圖1。

圖1 肉雞十二指腸、空腸和回腸的組織切片

由表11可知，與F0組和F6組相比，F10組肉雞盲腸乳酸菌數量顯著提高(P<0.05)，F6組和F8組肉雞盲腸乳酸菌數量顯著高于F0組(P<0.05)；與F0組相比，F10組肉雞盲腸沙門氏菌數量顯著降低(P<0.05)，其他各試驗組差異不顯著(P>0.05)；各組肉雞盲腸大腸桿菌數量之間差異不顯著(P>0.05)。

表11 濕態發酵豆粕對肉雞盲腸微生物的影響

3 討 論

3.1 濕態發酵豆粕對肉雞生長性能的影響

豆粕中含有胰蛋白酶抑制劑等多種抗營養因子，然而家禽缺乏消化豆粕抗營養因子的內源性水解酶導致豆粕利用受到限制。豆粕在發酵過程中可降低抗營養因子含量，并將大分子蛋白質降解為動物機體易消化和利用的小分子蛋白，進而提高飼料轉化效率，這是發酵豆粕能改善肉雞生長性能的主要原因。魏蓮清等[28]和Niu等[29]研究發現，飼糧添加6%發酵棉籽粕可提高肉雞生長性能?？孪檐姷萚8]研究發現，飼糧添加10%發酵豆粕也可提高肉雞生長性能和屠宰性能。Akinola等[10]研究發現，飼糧按1∶1.3的比例與水混合發酵成發酵濕飼料飼喂肉雞提高了肉雞的平均體重。本試驗中，與F0組相比，F10組肉雞1～21日齡平均體重顯著提高；與F0組、F6組和F8組相比，F10組肉雞1～21日齡料重比顯著降低；與F0組和F6組相比，F8組和F10組肉雞22～42日齡平均體重和平均日采食量顯著提高；與F0組相比，F8組和F10組肉雞22～42日齡料重比顯著降低。這說明添加濕態發酵豆粕可以提高肉雞生長性能。這可能是因為濕態發酵豆粕中的芽孢桿菌、乳酸菌和酵母菌在發酵過程中將大分子蛋白質轉化為小肽和氨基酸，同時降低了抗營養因子、粗纖維和粗脂肪等含量，提高了必需氨基酸和營養物質消化率[30-31]。濕態發酵豆粕中的芽孢桿菌還可以降低pH，從而給乳酸菌提供合適的環境，乳酸菌產生乳酸又進一步使環境中pH下降，進而抑制有害菌繁殖，改善腸道健康，從而提高生長性能。芽孢桿菌還可增強免疫功能并促進腸道內源性抗菌肽的合成，進而提高生長性能[32]。然而，也有研究表明，益生菌對肉雞的生長性能影響沒有顯著影響[33]。這些結果的差異可能與益生菌的菌種、接種量、制備方法、禽齡、飼糧組成和衛生狀況有關[34]。

3.2 濕態發酵豆粕對肉雞血清免疫和抗氧化指標的影響

脾臟是一種外周免疫器官，對保護性免疫反應有重要影響。法氏囊被認為是肉雞免疫球蛋白合成的主要部位，與B淋巴細胞發育有關，并為B淋巴細胞的產生提供必要的微環境。免疫器官重量的增加表明肉雞的免疫健康狀況較好[35]。Naji等[16]研究發現，飼糧添加丁酸梭菌顯著提高了肉雞法氏囊指數。而本試驗發現，飼喂濕態發酵豆粕后，肉雞胸腺指數和法氏囊指數沒有顯著性差異，但有上升的趨勢，說明濕態發酵豆粕對機體的免疫機能有一定的促進作用，這可能是因為濕態發酵豆粕中芽孢桿菌有利于法氏囊的發育[35]。與本研究結果相似，Tang等[36]和Choi等[37]研究發現發酵海藻飼喂肉雞后，免疫器官指數沒有顯著變化，這可能與發酵菌種和發酵方法有關。

氧化應激是指體內氧化與抗氧化作用失衡的一種狀態，主要由活性氧引起?；钚匝醢ǔ蹶庪x子自由基、羥基自由基和過氧化氫，是正常耗氧代謝過程的產物[38]。SOD是一種抗超氧陰離子自由基的天然清除劑，在保護細胞免受由活性氧引起的損害中起著重要作用。MDA是重要的脂質過氧化產物之一，其含量可以間接反映細胞的氧化損傷程度[39]。發酵黃芪飼喂肉雞使得血清SOD活性提高，血清MDA含量降低[40]；在肉雞飼糧中添加黑曲霉發酵松針和黑曲霉發酵銀杏葉也有類似效果[6,41]；飼糧添加25%發酵豆粕可以提高肉仔雞的生長性能和血清免疫力[42]。在本試驗中，飼糧添加濕態發酵豆粕沒有引起大多數血清抗氧化指標的顯著變化，但是與F0組相比，F10組肉雞血清SOD活性顯著提高，血清MDA含量顯著降低，這說明濕態發酵豆粕可能通過其中益生菌的金屬離子螯合能力，調節信號傳導途徑來調節宿主的氧化還原狀態[43]。乳酸菌和芽孢桿菌可能通過增加抗氧化劑基因的表達來增強抗氧化劑酶的活性，抑制可能引起細胞損傷的過量活性氧，并最終降低組織的MDA含量[44-45]。同時，濕態發酵豆粕在發酵過程中芽孢桿菌可能產生抗氧化酶、氨基酸、乳酸和抗氧化維生素，進而提高肉雞抗氧化能力[43]。

3.3 濕態發酵豆粕對肉雞小腸組織形態和盲腸微生物的影響

腸道健康與肉雞的生長性能密切相關。腸道絨毛高度和隱窩深度被認為是評估腸道健康的重要指標[46]。絨毛高度增加，腸表面積增大，可以提高養分吸收效率，改善肉雞的生長性能。相反，較短的絨毛和較深的隱窩可能降低營養吸收效率，從而降低抵抗力和生長性能[45]。

發酵飼料可以提高肉雞腸道內乳酸菌數量[13,16,18]，增加有益菌的豐度和減少潛在有害細菌的豐度，抑制肉雞腸道內有害菌的增殖，從而改善腸道健康[42,47]。Feng等[48]研究發現，飼喂發酵豆粕飼糧能顯著提高肉雞十二指腸和空腸絨毛高度。Chachaj等[49]研究發現，飼糧添加6%發酵豆粕能夠提高肉雞腸道絨毛高度，減少空腸中真菌和大腸菌群總數。在本試驗中，飼糧添加濕態發酵豆粕能提高肉雞小腸各腸段絨毛高度，降低隱窩深度；還可以提高盲腸乳酸菌數量，降低沙門氏菌數量。這可能與芽孢桿菌產生的蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶降解豆粕中抗營養因子，促使小肽等小分子物質增加有關。Yang等[50]研究發現，肉雞飼糧中添加芽孢桿菌可以促進養分吸收進而誘導肉雞的腸道上皮細胞增殖，改善腸道健康。濕態發酵豆粕中的乳酸菌還可以產生短鏈脂肪酸，降低腸道不同部位的pH，從而形成天然的防御屏障，抵抗感染和沙門氏菌等病原菌，改善腸道菌群的平衡，從而提高腸道健康[51]。

4 結 論

飼糧添加濕態發酵豆粕可以顯著提高肉雞生長性能和抗氧化能力，改善小腸組織形態，提高盲腸乳酸菌數量，降低盲腸沙門氏菌數量，并且添加比例為10%時效果最佳。