竹鼠腸道纖維素降解菌的分離鑒定及其產酶特性研究

曾文婷 覃紹敏 吳健敏* 梁小莉 白安斌 劉金鳳 陳鳳蓮 秦樹英 馬 玲

(1.廣西大學動物科學技術學院，南寧 530004；2.廣西壯族自治區獸醫研究所，廣西獸醫生物技術重點實驗室，南寧 530001；3.廣西農業職業技術學院動物科學技術學院，南寧 530007)

纖維素是植物中主要的多糖化合物[1]，廣泛存在于秸稈、稻草、谷物、豆類、麥類及其加工產品等動物飼料中[2]。然而，植物細胞壁的復雜結構嚴重阻礙了富含纖維素的植物在畜牧業生產中的應用[3]，為了解決這一問題，常使用纖維素酶將植物細胞壁等植物纖維降解為葡萄糖，以提高其利用率和轉化率。微生物是纖維素酶的主要來源，據不完全統計，迄今為止，國內外共報道了約53個屬的幾千個菌株可產纖維素酶，包括細菌、真菌、放線菌等[4]。幾乎所有哺乳動物，包括草食性哺乳動物，自身不能產生纖維素酶，而是依靠腸道微生物的幫助來消化纖維素，因此，哺乳動物腸道中有豐富的纖維素降解菌資源。此外，動物來源的纖維素降解菌在粗纖維飼料應用上有天然的優勢，其大多是腸道固有菌，較容易適應畜禽體內的腸道內環境并發揮作用。因此，從動物腸道中篩選獲得有效的纖維素降解菌，對粗纖維飼料的開發利用具有重要意義。

動物源纖維素降解菌的研究主要集中在植食性動物上，其腸道和糞便是纖維素降解菌的重要來源，研究表明，反芻動物瘤胃中存在的白色瘤胃球菌(Ruminococcusalbus)、黃色瘤胃球菌(Ruminococcusflavefaciens)和產琥珀酸絲狀桿菌(Fibrobactersuccinogenes)是公認的瘤胃三大優勢纖維素降解菌[5]；何靜等[6]在雙峰駝的瘤胃內容物中分離獲得1株纖維素降解菌，該菌株能明顯分解纖維素。此外，在大熊貓[7-8]、豬[9]等雜食性動物的糞便或腸道中也分離到了產纖維素酶的細菌，這些細菌普遍集中在瘤胃球菌屬、梭菌屬、擬桿菌屬、普雷沃氏菌屬、纖維桿菌屬、芽孢桿菌屬和毛螺旋菌屬。

竹鼠(Rhizomys)又稱竹鼬、竹根鼠、芒貍等，是一種皮肉兼用且營養和藥用價值較高的珍貴特種動物[10]。竹鼠以采食植物性食物為主，對粗纖維和木質素的消化率較高，耐粗飼，是所有飼養動物中粗纖維利用率最高的動物，并且是唯一和大熊貓類似，能在腸道中高效降解纖維素的單胃哺乳動物。研究表明，大熊貓體內并不存在編碼纖維素酶的基因，而是依靠腸道內微生物進行食物中纖維素的降解[11]。雖然未見對竹鼠進行全基因組測序的報道，但可以推測，竹鼠腸道內微生物對食物中纖維素的降解應該起到了關鍵的作用。目前，從竹鼠體內分離纖維素降解菌的研究鮮有報道，僅寧俊平[12]從竹鼠體內分離到7株兼性厭氧的纖維素降解菌以及曹曉燕[13]從竹鼠體內分離到2株具有纖維素酶活性的嚴格厭氧的細菌，證實竹鼠體內也存在能分解纖維素的細菌。上述研究均集中在對厭氧菌的分離。本試驗改進傳統的纖維素降解菌初篩方法，旨在從竹鼠腸道內容物中篩選獲得具有較高纖維素酶活性的需氧菌，以期為秸稈、象草等高粗纖維含量飼料的開發利用提供候選菌株。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品來源

廣西桂林市某竹鼠養殖場成年健康竹鼠腸道內容物。

1.1.2 主要試劑

革蘭氏染色液、芽孢染色液、莢膜染色液、普通營養肉湯培養基、普通營養瓊脂培養基、LB液體培養基、LB瓊脂培養基、MRS液體培養基、MRS瓊脂培養基、TSA瓊脂培養基、麥康凱瓊脂培養基、PDA瓊脂培養基為北京陸橋技術股份有限公司產品，細菌微量生化管為杭州濱和微生物試劑有限公司產品，細菌DNA抽提試劑盒為北京康為世紀公司產品，羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)、CMC-Na瓊脂培養基、CMC-Na剛果紅培養基為山東拓普生物科技有限公司產品，DNA Ladder Marker、PCR Mix為TaKaRa公司產品，微晶纖維素為COOLABER生物科技有限公司產品，D-水楊苷為源葉生物有限公司產品，3，5-二硝基水楊酸(DNS)為國藥集團化學試劑有限公司產品，其他常規試劑均為分析純。

1.1.3 培養基及主要溶液

鮮血瓊脂培養基：將無菌脫纖維羊血按照5%的量加入到冷卻至55～60 ℃的普通瓊脂培養基中，混合后倒入平板中冷卻至室溫。

種子培養基：氯化鈉5 g，牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，蒸餾水1 000 mL，自然pH。

發酵培養基：CMC-Na/微晶纖維素/D-水楊苷10 g，磷酸氫二鉀1 g，硫酸鎂0.5 g，硫酸銨2 g，氯化鈉2.5 g，酵母粉2.5 g，蛋白胨5 g，蒸餾水1 000 mL，自然pH。

濾紙培養基：濾紙條(每條：1.0 cm×3.6 cm，約0.03 g)5 g，酵母粉2 g，磷酸二氫鉀 0.5 g，硫酸鎂0.5 g，蒸餾水1 000 mL，自然pH。

DNS試劑：稱取DNS(10±1) g，置于約600 mL水中，逐漸加入氫氧化鈉10 g，在50 ℃水浴中攪拌溶解，再依次加入酒石酸甲鈉200 g、苯酚(重蒸)2 g和無水亞硫酸鈉5 g，待全部溶解并澄清后，冷卻至室溫，用水定容至1 L，過濾。濾液貯存于棕色試劑瓶中，于暗處放置7 d后使用。

1.2 樣品處理

稱取竹鼠腸道內容物1.0 g，轉移至盛有100 mL無菌水的三角瓶中，在80 ℃電熱恒溫振蕩水浴鍋中振蕩30 min，分別取上清液1 mL于LB、MRS和普通營養肉湯液體培養基中，37 ℃、220 r/min振蕩培養12 h后，取1 mL發酵液于裝有9 mL無菌水的試管中，進行梯度稀釋，分別取10-4、10-5、10-6稀釋液200 μL，分別涂布到LB、MRS、TSA、普通營養、麥康凱、CMC-Na、PDA和鮮血瓊脂平板上，每個稀釋梯度3個重復，涂布后的平板置于37 ℃恒溫箱培養24 h。

1.3 菌株純化及纖維素降解菌的初篩

在培養基上，分別挑取單個不同形態的菌在平板上劃線純化，直到平板上只有單菌落生長為止。

將剛果紅平板打孔，孔徑為0.5 cm，對單個純化后的菌落進行稀釋。用移液槍將其轉移到剛果紅平板的孔中，單個菌落重復3次，在37 ℃下培養24 h后用游標卡尺測量剛果紅平板上透明圈的直徑，選取透明圈直徑(除去打孔孔徑)(D)與菌落直徑(d)比值(D/d值)較大的菌株進行復篩。

挑取D/d值較大的菌落培養，在平板上反復劃線純化并培養4～5代后，將純化培養后的菌種加甘油于-80 ℃保存備用。

1.4 產酶特性研究

1.4.1 發酵液的制備

取純化培養好的各平板菌種接種于種子培養基，于37 ℃、220 r/min恒溫搖床振蕩培養14～16 h。取液體菌種，按1%的接種量分別接種于以3種底物(CMC-Na、微晶纖維素、D-水楊苷)為碳源的發酵培養基和濾紙培養基中，于37 ℃、180 r/min恒溫搖床振蕩培養24 h，在8 000 r/min條件下離心5 min，去除菌體，取上清液，得粗酶液[14]。

1.4.2 標準曲線的繪制

分別吸取不同濃度(0、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mg/mL)的葡萄糖標準溶液0.5 mL、緩沖溶液1.5 mL和DNS試劑3 mL于各標準管(每樣做3個平行)中，混勻。將標準管同時置于沸水浴中，反應10 min。取出，迅速冷卻至室溫，用純水定容至25 mL，蓋塞，混勻。用10 mm比色杯，在分光光度計波長540 nm處測量吸光度(OD)值。以葡萄糖量為橫坐標，以OD值為縱坐標，繪制標準曲線，獲得線性回歸方程。線性回歸系數在0.999 0以上時方可使用。

1.4.3 纖維素酶活性的測定

內切葡聚糖酶(Cen)、外切葡聚糖酶(Cex)、β-葡萄糖苷酶(BG)和濾紙酶(FPA)活性的測定按李日強等[15]的方法進行。分別吸取各菌株粗酶液、緩沖溶液和DNS試劑于各標準管(每樣做3個平行)中，混勻。將標準管同時置于沸水浴中，反應10 min。取出，迅速冷卻至室溫，用純水定容至25 mL，蓋塞，混勻。用10 mm比色杯，在分光光度計波長540 nm處測量OD值，以滅活后的粗酶液作為空白對照。以(50.0±0.1) ℃、pH為6.0時1 min水解纖維素底物產生出相當于1 μmol葡萄糖的還原糖量為1個酶活性單位，以U/mL表示。

1.4.4 培養條件對菌株產酶能力的影響

1.4.4.1 培養時間對菌株產酶能力的影響

將篩選出的菌株按1%接種量接種于種子培養基，于37 ℃、220 r/min恒溫搖床振蕩培養14～16 h后，得菌株種子液。取100 μL菌株種子液接入20 mL發酵培養基(pH為7.0)中，于37 ℃、185 r/min恒溫搖床振蕩發酵培養6、12、24、36、48、60、72 h，測定其OD600 nm值和FPA活性。

1.4.4.2 pH對菌株產酶能力的影響

將發酵培養基pH分別調至3、4、5、6、7、8、9和10，取菌株種子液100 μL接入20 mL發酵培養基中，于37 ℃、185 r/min恒溫搖床振蕩發酵培養24 h，測定其OD600 nm值和FPA活性。

1.4.4.3 溫度對菌株產酶能力的影響

取菌株種子液100 μL接入20 mL發酵培養基(pH為7.0)中，分別于30、37、43、50、57、65 ℃，185 r/min恒溫搖床振蕩發酵培養24 h，測定其OD600 nm值和FPA活性。

1.5 產纖維素酶菌株的種屬鑒定

1.5.1 生理生化鑒定

取菌液于普通瓊脂培養基上劃線培養，37 ℃下培養24 h觀察菌落形態；采用革蘭氏染色、芽孢染色和莢膜染色法，顯微鏡下觀察菌株形態；參考《常見細菌系統鑒定手冊》[16]和《伯杰氏細菌鑒定手冊》[17]進行生化試驗，挑取純化培養的單菌落分別接種于生化管中，根據顏色的變化，判定試驗結果。

1.5.2 分子生物學鑒定

使用細菌DNA抽提試劑盒提取細菌DNA，采用16S rDNA通用引物16sRp1(5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′)和16sRp2(5′-GTGTGACGGGCGGTGTGTAC-3′)，預計擴增長度1 380 bp，PCR反應體系(25 μL)為：上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，細菌基因組(208 ng/μL)3 μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL。反應條件為：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，35個循環，72 ℃ 10 min。PCR產物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序，在NCBI數據庫中進行BLAST比對。

1.6 數據處理與分析

利用 Excel 2010對試驗數據進行初步整理，采用SPSS 23.0和GraphPad Prism 7軟件對試驗數據進行統計分析和圖表繪制。

2 結果與分析

2.1 產纖維素酶菌株的篩選

采用LB、MRS、TSA、普通營養、麥康凱、CMC-Na、PDA和鮮血瓊脂平板分離獲得10株菌，依此命名為GL1～10。通過剛果紅培養基上產生透明圈的大小，篩選能降解纖維素的菌株，如圖1所示，GL-4、GL-5、GL-6和GL-8具有一定的產纖維素酶活性，其中GL-4的透明圈最大，直徑為23.54 mm；GL-6的透明圈最小，直徑為12.49 mm。

圖1 剛果紅培養基上形成的透明圈

通過測量透明圈直徑和菌落直徑，計算得出D/d值，詳見表1。由表中數據可知GL-4的D/d值最大，為3.45±0.05；GL-6的D/d值最小，為1.85±0.06。

表1 D/d值結果

2.2 纖維素酶活性

在篩選出的4株纖維素降解菌GL-4、GL-5、GL-6和GL-8中，GL-4的Cen和FPA活性最高，分別為49.32和25.13 U/mL；GL-8的Cex活性最高，為30.59 U/mL；GL-5的BG活性最高，為35.08 U/mL(圖2)。

圖2 纖維素酶活性測定結果

2.3 培養條件對菌株產酶能力的影響

選擇產CMC和FPA活性最高的菌株GL-4進行最佳培養條件篩選。

溫度對產酶能力的影響見圖3-a。GL-4的生長性能(OD600 nm)和產酶能力(FPA活性)在30～37 ℃時隨溫度升高而升高，在37～57 ℃時隨溫度升高而急劇降低，在57 ℃時菌株不再生長和產酶。上述結果說明菌株GL-4產纖維素酶的最適溫度為37 ℃。

培養時間對產酶能力的影響見圖3-b。對于GL-4，0～6 h是生長調整期，6～36 h是對數生長期，36～48 h是穩定期，48 h后進入衰亡期。發酵時間在0～24 h時，GL-4的產酶能力隨發酵時間的延長而升高，并在24 h時達到頂峰，之后產酶能力隨發酵時間的延長逐步降低，所以菌株GL-4的最佳培養時間為24 h。培養時間在0～24 h時，生長曲線與FPA活性活性曲線的變化呈正相關，培養24 h之后，2個曲線的變化沒有明顯的相關性。

圖3 不同培養條件對菌株生長和產酶能力的影響

pH對產酶能力的影響見圖3-c。當發酵培養基的pH為3～4時，GL-4的生長性能和產酶能力隨著pH的升高而升高；在pH為4～6時，隨pH的升高稍微有所降低；之后又隨著pH的升高而升高，在pH為8時達到峰值；當pH達到9時，菌株失活而無法產生纖維素酶。結果顯示，菌株GL-4在弱堿性的環境下能很好的生長和產酶，其產纖維素酶的最適pH為8。

2.4 產纖維素酶菌株的鑒定

選擇D/d值較大，且產纖維素酶活性較高的菌株GL-4、GL-5和GL-8進行鑒定。

2.4.1 形態學鑒定

3株菌在普通瓊脂培養基平板上的形態學鑒定結果(表2)顯示，GL-4和GL-8菌落形態相似，呈邊緣整齊、表面光滑凸起的圓形菌落；鏡檢結果(表2、圖4)顯示，3株菌均為革蘭氏陽性短桿菌。

表2 菌株的形態結構

圖4 GL-4的顯微形態

2.4.2 生化鑒定

生化鑒定結果見表3。3株菌的生化試驗結果大致相似，均能利用明膠、葡萄糖、蔗糖、淀粉和過氧化氫，分解糖類產生乙酰基甲醇，不能利用木糖、阿拉伯糖、吲哚、硝酸鹽和枸櫞酸鹽，不能分解糖類產酸。另外，3株菌中僅GL-8可利用甘露醇。生化試驗結果符合芽孢桿菌的生化特性，初步確定3株菌均為枯草芽孢桿菌。

表3 生化鑒定結果

續表3項目 Items菌株 StrainsGL-4GL-5GL-8甘露醇 Mannitol--+枸櫞酸鹽 Citrate---乙酰甲基甲醇 V.P. +++甲基紅 MR-VP---淀粉 Starch+++過氧化氫 H2O2+++

2.4.3 16S rDNA鑒定

采用PCR方法擴增菌株GL-4、GL-5和GL-8的16S rDNA序列，將克隆測序后序列進行BLAST比對，并用MEGA 7.0軟件構建16S rDNA的系統進化樹。BLAST比對結果顯示，GL-4、GL-5和GL-8的16S rDNA基因與枯草芽孢桿菌的基因序列一致性均大于98%。使用MEGA 7.0軟件進行遺傳進化分析，結果顯示，GL-4、GL-5和GL-8分別位于3個不同的枯草芽孢桿菌分支(圖5)，表明這3株菌均為枯草芽孢桿菌，與生理生化鑒定結果一致。

Bacillus sp.：芽孢桿菌屬；Bacteria：細菌；Uncultured Bacillus sp. clone RB-77：不可培養芽孢桿菌克隆 RB-77；Bacillus subtilis：枯草芽孢桿菌；Bacillus subtilis subsp.：枯草芽孢桿菌亞種；Bacillus cereus：蠟樣芽孢桿菌；Bacillus tequilensis：特基拉芽孢桿菌；Bacillus licheniformis：地衣芽孢桿菌；Bacillus pumilus：短小芽孢桿菌；Bacillus anthracis：炭疽芽孢桿菌；strain：菌株。

3 討 論

3.1 纖維素降解菌的分離篩選

剛果紅染色法是用于纖維素降解菌初篩的經典方法，Ghezelbash等[18]采用的傳統剛果紅染色法是先在平板上培養細菌，再用剛果紅進行染色，這個方法在用氯化鈉進行清洗的過程中容易產生菌落脫落現象，造成菌落之間發生混雜，導致無法獲得準確結果，且該方法操作繁瑣，不利于細菌的大量篩選。本研究對該方法進行了部分改進，在制備平板時即加入剛果紅，并在平板上進行打孔，然后將菌落稀釋后加入孔內，繼續培養24 h即可測量透明圈直徑。整個過程不需要對平板進行清洗，克服了傳統方法的不足，試驗結果更加準確，且操作簡便。本研究通過改進的剛果紅染色法從竹鼠腸道內容物中初步篩選獲得4株纖維素降解菌，通過測定纖維素酶活性，最終獲得3株產纖維素酶活性較強的菌株GL-4、GL-5和GL-8，經鑒定均為枯草芽孢桿菌。GL-4的纖維素酶總活性高于寧俊平[12]和曹曉燕[13]在竹鼠腸道內分離出的酪酸梭狀芽孢桿菌、沙雷氏菌、肺炎克伯雷氏菌等厭氧菌，其中最高的Cen活性為0.502 9 U/mL；也高于沈琦等[19]和樊程等[8]分別在豬和大熊貓的糞便中分離的解淀粉芽胞桿菌，前者Cen活性為7.64 U/mL，后者FPA活性為0.228 3 U/mL。

3.2 纖維素酶活性測定

纖維素酶降解纖維素的過程被認為是3種酶協同作用的結果，有觀點認為，纖維素酶發揮作用首先由Cen在纖維素分子內部的無定形區進行酶切產生新的末端，然后由Cex以纖維二糖為單位從末端進行水解,每次切下1個纖維二糖分子，最后由BG將纖維二糖以及短鏈的纖維寡糖水解為葡萄糖。纖維素酶的3種組分作用的底物不同，Cen的水解底物包括羧甲基纖維素和磷酸溶脹纖維素等無定形纖維素；Cex的水解底物包括棉纖維和微晶纖維素等結晶度較高的纖維素；BG的水解底物是纖維寡糖和纖維二糖[20]。本試驗對初篩菌株的3種纖維素酶和總酶(FPA)的活性均進行了測定，能全面評估菌株的纖維素降解能力，結果顯示GL-4的FPA和Cen活性最高，說明該菌株對于多種成分的纖維素底物和無定形纖維素底物有較強的降解解能力；GL-8的Cex活性最高，說明該菌株對葡聚糖和纖維二糖有較強的降解解能力；GL-5的BG活性最高，說明該菌株對纖維寡糖和纖維二糖的降解能力較強。因此，在后續的應用研究中，可根據不同的發酵原料，選擇其中的1個或多個菌株混合使用，達到最佳的纖維素降解效果。

根據本試驗中纖維素酶活性測定結果可知，不同菌株所產纖維素酶活性存在差異，同一株菌所產纖維素酶活性在不同碳源存在時也存在差異，本研究獲得的菌株GL-4是目前竹鼠源分離菌中產纖維素酶活性最強的細菌，對常見的4種纖維素底物均有較好的降解能力。

3.3 不同培養條件對菌株產酶能力的影響

纖維素降解菌的產酶能力受到培養條件的影響，培養基的pH和培養溫度的改變均影響菌株的生長，從而間接影響產酶能力，在強酸強堿和高溫條件下，菌株無法生長及產酶。根據本研究結果，培養時間在0～24 h時，菌株GL-4的生長與產酶能力呈正相關，即隨著菌量的增加，產酶量也隨之增加，并且在培養24 h時達到最高，24 h后，菌株依然處于對數生長期，但產酶能力卻不再升高，直到48 h后，兩者又重新呈正相關。出現這種現象的可能原因如下：1)GL-4的生長曲線與殷曉敏等[21]的研究大致相同，但其對數生長期持續時間較長，達30 h，在24 h后隨著菌株生長代謝的增強，培養基中的營養物質不斷被消耗，菌株死亡率上升，產酶量下降；2)GL-4對溫度的變化較敏感，除37 ℃培養外，在其他溫度培養24 h后，其產酶能力均不高，在細菌發酵培養過程中的溫度升高可能也會導致纖維素酶活性的降低，這與菌株的熱穩定性有關[22]；3)GL-4在pH為4～8時，其所產纖維素酶活性一直保持較高狀態，但當培養基pH離開這個區間后，纖維素酶活性急劇下降，根據劉陽等[23]的研究，枯草芽孢桿菌在發酵時會產生乳酸，從發酵開始分泌直至48 h到達峰值，乳酸的生成導致培養基的pH發生改變，從而使纖維素酶活性發生改變。本研究中，GL-4在培養基pH為4～8時，纖維素酶活性均較高，這與Irfan等[24]的研究結果一致，說明芽孢桿菌的產酶能力在一定pH范圍內保持穩定。本試驗中GL-4的最適pH為8，與崔海洋等[25]的研究結果一致。

本研究僅改變單一條件來分析培養條件對GL-4產酶能力的影響，未考慮各培養條件間相互影響的情況，有一定的局限性。柴秀娟等[26]采用響應曲面回歸分析法對菌株進行產酶條件優化，優化效果明顯。響應曲面回歸分析法是一種通過對影響過程的因子及其交互作用進行評價來優化過程的有效方法[27]，可以彌補傳統單因素變量優化試驗的不足。下一步，我們將使用響應曲面法進一步優化產酶條件，使分離菌株更好的在飼料發酵中發揮作用。

4 結 論

① 本試驗從竹鼠腸道內容物中獲得了3株纖維素降解菌——GL-4、GL-5和GL-8，經形態特征、生化特性和分子生物學鑒定，確定均為枯草芽孢桿菌。

② 3株纖維素降解菌所產纖維素酶的活性有一定差異，GL-4的D/d值最大，為3.45±0.05，其Cen和FPA活性最高，分別為49.32和25.13 U/mL；GL-8的Cex活性最高，為30.59 U/mL；GL-5的BG活性最高，為35.08 U/mL。

③ 對GL-4進行培養條件優化，該菌株具有培養pH范圍廣和耐高溫的特點，在培養基pH為3～8、溫度為50 ℃時仍具有產酶能力。該菌株產酶的最適條件為發酵時間24 h、發酵培養基pH 8和發酵溫度37 ℃，是一株可用作粗纖維飼料添加劑的優良候選菌株。