牛源復合微生態制劑的應用效果評價

趙 杰 徐靜茹 馬 立 陳佳雯 謝 昕 李璐鑫 楊克禮 馮士彬 李 玉 吳金節 王希春*

(1.安徽農業大學動物科技學院，合肥 230036；2.湖北省農業科學院畜牧獸醫研究所，武漢 430064)

我國農業農村部于2019年7月9日發布第194號公告，要求“自2020年7月1日起，飼料生產企業停止生產含有促生長類藥物飼料添加劑(中藥類除外)的商品飼料”，標志著我國全面進入藥物限抗、飼料禁抗新時代，尋求綠色環保型無抗生產已成為一種必然的趨勢。微生態制劑是一種根據微生態理論，使用益生菌提高免疫力，保持體內微生態平衡，進而提高宿主健康水平的活菌制劑[1]。一種有效的微生態制劑不僅能夠降低動物病死率，提高養殖產量，同時可以保障肉制品的質量安全，維護生態安全[2]。微生態制劑可以改善動物機體的健康水平，調節腸道菌群的紊亂，促進營養物質的消化吸收，具有防治消化道疾病和促進生長雙重作用，且體內無殘留[3]。此外，微生態制劑還可以產生免疫調節因子和干擾素等免疫活性物質，刺激局部免疫器官，增強機體免疫力，提高動物機體的抵抗力[4]。益生菌類微生態制劑可在改善宿主腸道菌群結構的同時提高宿主健康水平和健康狀態。動物胃腸道內擁有豐富的菌群，乳酸菌是動物胃腸道中一種固有優勢菌群，已作為飼料添加劑應用于生產中[5]。芽孢桿菌在腸道中主要通過微生物奪氧，維持腸道生態平衡[7]，在腸道短時間定植后，可以消耗大量的氧氣，維持腸道厭氧環境，增強腸道厭氧菌的定植，抑制病原微生物的同時促進乳酸菌等有益微生物的生長，具備提高動物生長性能、降低料重比和抑制致病菌生長等較多優點[8-9]。在養殖業的發展中，反芻動物占據著重要的地位。微生態制劑能夠穩定反芻動物瘤胃內環境，增加瘤胃微生物數量，促進氮代謝，提高機體對飼料的利用率。楊華等[6]研究表明，微生態制劑進入瘤胃后能激活奶牛瘤胃微生物的活性，促進瘤胃內有益菌的增殖，抑制有害菌的增殖，提高脂肪、蛋白質和纖維素等營養物質的消化率。

有研究表明，菌株的定植能力具有宿主特異性，來源不同的菌株在不同的動物胃腸道內具有不同的定植能力[10]。目前，市場上購買到的微生態制劑其菌株一般來源于體外環境，而在生產上應用的大多數益生菌株主要來自土壤、水環境中，這種生態環境與動物胃腸道生理環境相差甚遠，動物胃腸道內的酸性環境、膽鹽和厭氧環境在很大程度上制約了許多微生物的生長，因此這些微生態制劑被應用于動物時往往得不到很好的效果[11]。與此相比，附著于胃腸道內的微生物經過胃腸道自身的篩選，能適應胃腸道環境且能大量繁殖。為此，本研究擬從大別山黃牛腸道中針對性地篩選出具有益生菌潛質的菌株，通過細菌擴大培養后制成復合微生態制劑，在飼糧中添加后飼喂大別山黃牛，探討復合微生態制劑與單一芽孢桿菌相比，對大別山黃牛免疫、抗氧化能力和腸道菌群結構的影響，以期為復合微生態制劑在動物健康養殖領域的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

采樣及臨床飼喂用大別山黃牛由安徽省安慶市望江縣小月山農業發展有限公司提供。臨床飼喂用黃牛均在6月齡左右，共12頭，公母各占1/2。

1.2 試驗材料與儀器

LB瓊脂培養基和MRS瓊脂培養基，杭州百思生物技術有限公司；商品枯草芽孢桿菌菌粉(活菌數≥1.0×1010CFU/g)，拜耳(墨西哥)有限公司；牛源酶聯免疫吸附測定(ELISA)試劑盒，上海晶抗生物工程有限公司；TGL-18R型冷凍高速離心機，珠海黑馬醫學儀器有限公司；Smart Pure超純水儀，美國Thermo公司；AE224電子天平，上海舜宇恒平科學儀器有限公司；可控硅控溫水浴鍋，金壇市金城國勝實驗儀器；DW-86L388A-80 ℃冰箱，青島海爾特種電器有限公司；微量移液器，Eppendaorf有限公司；BK-500全自動生化分析儀，濟南鑫貝生物科技有限公司；Infinite M200 PRO酶標儀，澳大利亞帝肯TECAN公司；超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司。

1.3 菌株分離

1.3.1 樣品采集

選擇未經抗生素及微生態制劑處理過的健康成年大別山黃牛3頭，經放血屠宰。無菌采集各腸段的內容物，冰盒保存，帶回實驗室進行分離。

1.3.2 菌株的分離與純化

將采集的腸道內容物樣品置于80 ℃的水浴鍋中水浴處理20 min，采用稀釋平板法，無菌接種于LB固體培養基上，37 ℃培養24 h后挑取不同形態菌落，反復劃線純化篩選芽孢桿菌。采用稀釋平板法，將采集的腸道內容物分別無菌操作接種于MRS固體培養基上，37 ℃厭氧培養48 h后挑取不同形態菌落，反復劃線純化篩選乳酸菌。

1.3.3 菌株的鑒定

根據細菌的形態、染色和菌落生長情況進行鑒定。將純化后的菌液送往擎科生物公司進行16S rDNA基因序列測序，測序結果利用GenBank中的BLAST程序比對，對細菌種屬進行鑒定。

1.3.4 酸耐受性試驗

參考Guo等[12]的試驗步驟進行耐酸試驗。將磷酸鹽緩沖溶液(PBS)的pH分別調整為7.4、4.0、3.0、2.0，菌液按1∶10的體積比加入到上述配制好的PBS中，在37 ℃的搖床中孵育2 h后取出，倍比稀釋后涂板，培養計數，每組重復3次，取平均值，計算所測菌株的存活率，計算公式如下：

存活率(%)=(酸處理菌液活菌數/
未處理菌液活菌數)×100。

1.3.5 膽鹽耐受性試驗

參考宋獻藝[13]的試驗步驟進行耐膽鹽試驗。用PBS將牛膽鹽稀釋成濃度分別為0、0.15%、0.30%和0.60%的膽鹽溶液，菌液按1∶10的體積比加入到上述配制好的膽鹽溶液中，在37 ℃的搖床中孵育2 h后取出，倍比稀釋后涂板，培養計數，每組重復3次，取平均值，計算所測菌株的存活率，計算公式如下：

存活率(%)=(牛膽鹽處理菌液活菌數/
未處理菌液活菌數)×100。

1.4 微生態制劑的制備

將菌株接種于固體培養基上活化后接種于液體培養基內，制作一級種子液。以5%的接種量將一級種子液接種于液體培養基中培養16 h，將培養后的菌液搖勻后吸取100 μL，倍比稀釋后涂布于LB固體培養基，重復3次，培養24 h計數活菌數，根據結果稀釋菌液至1×108CFU/mL，作為二級種子液。將二級種子液送往南京阡晟源生物技術有限公司進行細菌擴大培養。對所得菌液進行活菌計數，測得芽孢桿菌菌液濃度約為0.96×108CFU/mL，乳酸菌菌液濃度約為1.24×108CFU/mL。

1.5 試驗設計

選取12只體型相近的健康斷奶大別山黃牛犢牛，隨機分為3組，分別為對照組(C組)、芽孢桿菌組(B組)、復合微生態制劑組(E組)，每組4頭，組與組之間隔離，與牛群隔離，采用栓系飼喂。C組飼喂正常的基礎飼糧，B組飼喂添加枯草芽孢桿菌菌粉的基礎飼糧，E組飼喂添加由牛源芽孢桿菌與乳酸菌制備的復合微生態制劑的基礎飼糧。枯草芽孢桿菌菌粉和復合微生態制劑均按照每天活菌數不低于1×1011CFU的劑量進行添加，根據菌液濃度計算得出每天牛源芽孢桿菌與乳酸菌的添加量各為500 mL。基礎飼糧組成及營養水平見表1。每日飼喂2次，每次飼喂后自由飲水。試驗期為30 d。

1.6 樣品采集

在試驗第0、15和30天，分別對各組牛進行空腹頸靜脈采血，分離血清，于-20 ℃凍存待測。在試驗第30天上午對各組牛進行無菌糞便采集，采集糞便樣品放入無菌凍存管內，立即放入液氮中淬滅并保存。

表1 基礎飼糧組成及營養水平(風干基礎)

1.7 指標測定

1.7.1 血清抗氧化指標的測定

采用ELISA試劑盒檢測血清中總抗氧化能力(T-AOC)及超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)活性與丙二醛(MDA)含量。

1.7.2 血清免疫指標的測定

采用ELISA試劑盒檢測血清中免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白G(IgG)含量。

1.7.3 血清細胞因子的測定

通過ELISA試劑盒檢測血清中白細胞介素-1(IL-1)、白細胞介素-2(IL-2)、白細胞介素-6(IL-6)、γ-干擾素(IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)含量。

1.7.4 腸道高通量測序

將糞便樣品送往北京諾禾致源科技股份有限公司進行測序分析，主要流程包括樣本檢測、DNA提取與檢測、PCR擴增、產物純化、文庫制備與庫檢、Illumina NovaSeq測序等。

1.8 數據統計分析

試驗數據使Excel 2019軟件進行統計。血清細胞因子、免疫與抗氧化指標數據使用SPSS 20.0軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，并采用LSD法進行多重比較，結果以平均值±標準差(mean±SD)表示。

2 結果與分析

2.1 16S rDNA基因序列的測定與細菌鑒定

從大別山黃牛各段腸道內容物中分離出的菌落經革蘭氏染色后，選擇6株革蘭氏陽性菌，分別編號為B1～B6；分離出5株疑似乳酸菌，分別編號為L1～L5。將反饋的16S rDNA基因序列與GenBank數據庫中進行同源性比對，同源性均在99%～100%，結果如表2所示。

表2 各菌株16S rDNA基因序列同源性比較

2.2 酸耐受性試驗

由圖1可知，隨著PBS pH的降低，所有菌株的存活率整體呈現下降的趨勢，其中B1、B4表現出對酸環境較為敏感，分別在pH為4和3時存活率降至0，因此選擇B2、B3、B5、B6這4株芽孢桿菌進行下一步膽鹽耐受性的篩選；同理，在pH為2時，L2的存活率降至0，因此選擇L1、L3、L4、L5這4株乳酸菌作為進一步膽鹽耐受性試驗的菌株。

圖A表示孵育2 h后各芽孢桿菌菌株在不同pH PBS中的存活率；圖B表示孵育2 h后各乳酸菌菌株在不同pH PBS中的存活率。

2.3 膽鹽耐受性試驗

由圖2可知，牛膽鹽對所有菌株均呈現抑制生長的作用，隨著膽鹽濃度的升高，各菌株的存活率整體呈現下降的趨勢。4株芽孢桿菌中，B6在0.3%的膽鹽溶液中存活率降至0，而B5的存活率則達到了68.16%，明顯高于B2、B3，因此最終選取B5(枯草芽孢桿菌)作為制作復合微生態制劑的芽孢桿菌菌株；4株乳酸菌中，L5對牛膽鹽的耐受力最差，在0.3%的膽鹽溶液中存活率已降至0，L1在0.6%的膽鹽溶液中存活率降至0，而L3在0.6%的膽鹽溶液中存活率最高，達到了50.57%，因此最終選擇L3(乳酸乳球菌)作為制作復合微生態制劑的乳酸菌菌株。

圖A表示孵育2 h后各芽孢桿菌菌株在不同濃度膽鹽溶液中的存活率；圖B表示孵育2 h后各乳酸菌菌株在不同濃度膽鹽溶液中的存活率

2.4 牛源復合微生態制劑對大別山黃牛血清抗氧化指標的影響

由表3可知，第0和15天時，所測血清抗氧化指標各組間差異均不顯著(P>0.05)。第30天時，與C組相比，B組與E組血清T-AOC及GSH-Px、CAT活性均顯著升高(P<0.05)，B組與E組間差異均不顯著(P>0.05)；B組和E組血清MDA含量顯著低于C組(P<0.05)；E組血清SOD活性極顯著高于C組(P<0.01)，B組顯著高于C組(P<0.05)，B組與E組間差異不顯著(P>0.05)。

表3 牛源復合微生態制劑對大別山黃牛血清抗氧化指標的影響

續表3項目 Items時間 Time組別 GroupsCBE谷胱甘肽過氧化物酶GSH-Px/(U/mL)第0天 Day 0644.68±69.78649.86±58.96646.85±70.16第15天 Day 15656.79±45.86713.78±76.24699.99±61.08第30天 Day 30624.10±41.96b729.11±55.52a726.38±64.74a過氧化氫酶CAT/(U/mL)第0天 Day 091.31±14.0490.91±14.6091.73±11.83第15天 Day 1592.14±12.6896.10±11.7596.74±10.34第30天 Day 3091.32±14.86b113.53±11.97a115.54±14.46a丙二醛 MDA/(nmol/mL)第0天 Day 06.09±0.916.14±0.956.02±0.93第15天 Day 156.41±1.965.90±0.995.32±1.07第30天 Day 306.23±0.98a4.80±0.60b4.50±0.88b

2.5 牛源復合微生態制劑對大別山黃牛血清免疫指標的影響

由表4可知，第15、30天時，與C組相比，B組、E組的血清IgG含量極顯著提高(P<0.01)，且第30天時E組血清IgG含量顯著高于B組(P<0.05)。第15、30天時，E組血清IgM含量極顯著高于C組與B組(P<0.01)；與C組相比，B組血清IgM含量雖有升高趨勢，但差異不顯著(P>0.05)。第0、15和30天時，B組與E組血清IgA含量與C組相比差異均不顯著(P>0.05)。

表4 牛源復合微生態制劑對大別山黃牛血清免疫指標的影響

2.6 牛源復合微生態制劑對大別山黃牛血清細胞因子的影響

由表5可知，第0、15和30天時，B組與E組血清IL-1含量與C組均差異不顯著(P>0.05)。第30天時，E組血清IL-2含量顯著升高(P<0.05)，B組具有上升趨勢，但差異不顯著(P>0.05)。第30天時，B組和E組血清IL-6含量較C組顯著升高(P<0.05)。在第15和30天時，B組與E組血清IFN-γ含量顯著高于C組(P<0.05)。第0、15和30天時，各組間血清TNF-α含量差異不顯著(P>0.05)。

表5 牛源復合微生態制劑對大別山黃牛血清細胞因子的影響

2.7 牛源微生態制劑對大別山黃牛腸道菌群結構的影響

2.7.1 樣品操作分類單元(OTU)統計結果及基于OTU的Venn圖

以97%的一致性閾值進行OTU聚類，每一個OTU都表示出一種微生物物種，OTU的豐度能夠初步表達物種的豐富程度。由表5可以看出，12個樣品通過拼接共產生1 065 589條Tag，Tag的平均長度為253nt，連接率均達到了99%以上，表明數據具有可靠性，3組樣品共產生16 397個OTU，其中C組有5 284個，B組有5 971個，E組有5 139個，表明3組之間的菌群豐度差異不明顯。

表6 測序數據統計結果及樣品OTU統計

Venn圖能夠直觀看出各組特有的OTU數目和不同組之間共有的OTU數目。由圖3可知，3組共含有2 604個OTU，3組共有1 471個OTU，C組特有65個OTU，B組特有647個OTU，E組特有69個OTU，C組與B組共有1 614個OTU，C組與E組共有1 547個OTU，E組與B組共有1 604個OTU。3組之間特有OTU數目存在一定的差異，且B組的OTU數目較多。

圖3 各組樣品基于OTU的Venn圖

2.7.2 基于OTU的α多樣性分析

由表7可知，B組的Observed species指數、Shannon指數、Shao1指數、ACE指數高于C組與E組，C組與E組的Observed species指數、Shannon指數、Chao1指數、ACE指數基本一致，Simpson指數與Goods coverage指數3組表現基本一致，且Goods coverage指數均≥0.997，表明基本覆蓋到樣品中所有的物種。

表7 各組樣品的α多樣性分析

2.7.3 物種累積箱型圖分析

物種累積箱型圖主要是用來描述隨著樣本量增加對物種多樣性的影響。由圖4可知，橫坐標為樣本量；縱坐標為抽樣后OTU數目。在樣本量為1～4時，OTU數目急劇上升，表明送檢樣本中有大量物種被發現，隨著樣本量繼續增加，OTU數目逐漸趨于平緩，說明物種數目不會隨著樣本數量繼續增加而急劇增加，表明樣本量充分，能夠用于估算物種豐富度。

圖4 物種累積箱形圖

2.7.4 腸道菌群結構

物種分布柱狀圖能夠直觀的看出每個門水平物種在樣品中的占比。由圖5可知，12個樣品中都羅列了豐度最高的10個菌門，其中厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和變形菌門(Proteobacteria)的豐度較高，這些微生物占據牛直腸微生物的94.24%以上。物種豐度聚類熱圖顯示物種分類豐度數據中每個樣品在屬水平的物種比例，圖中深紅色表示該OTU對樣品總OTU有較高比例貢獻值，高亮綠色表示該OTU對樣品總OTU有較低比例貢獻值。由圖6可知，厚壁菌門、變形菌門為優勢菌屬，其中厚壁菌門的乳酸菌屬(Lactobacillus)在E組占優，可調節腸道菌群紊亂，說明復合微生態制劑調節大別山黃牛腸道菌群處于動態平衡狀態中。

Others：其他；Melainabacteria：黑水仙菌門；Acidobacteria：酸桿菌門；Verrucomicrobia：疣微菌門；Tenericutes：軟壁菌門；Spirochaetes：螺旋體門；Actinobacteria：放線菌門；Proteobacteria：變形菌門；Bacteroidetes：擬桿菌門；Firmicutes：厚壁菌門。

Alistipes：另枝菌屬；Oscillibacter：螺旋菌屬；Anaerosporobacter：厭氧孢桿菌屬；Alloprevotella：普雷沃氏菌屬；Bacteroides：擬桿菌屬；unidentified_Ruminococcaceae：未鑒定瘤胃菌科；Ruminobacter：反芻桿菌屬；unidentified_Spirochaetaceae：未鑒定螺旋體科；Sphingomonas：鞘脂單胞菌屬；Variovorax：貪噬菌屬；Chitinophaga：鞘氨醇菌屬；Phascolarctobacterium：考拉桿菌屬；Akkermansia：阿克曼菌屬；Romboutsia：羅姆布茨菌屬；Dubosiella：杜氏桿菌屬；Lactococcus：乳球菌屬；Desulfovibrio：脫硫弧菌屬；unidentified_Clostridiales：未鑒定梭菌目；Blautia：布勞特氏菌屬；Anaerovibrio：厭氧弧菌屬；Roseburia：羅氏菌屬；Succinivibrio：琥珀酸弧菌屬；Odoribacter：氣味桿菌屬；unidentified_Lachnospiraceae：未鑒定毛螺旋菌科；Lactobacillus：乳桿菌屬；Butyrivibrio：丁酸弧菌屬；Bacteroidetes：擬桿菌門；Firmicutes：厚壁菌門；Proteobacteria：變形菌門；Spirochaetes：螺旋體門；Verrucomicrobia：疣微菌門。

由表8可知，厚壁菌門的豐度，B組與E組基本一致，較C組略有降低；擬桿菌門的豐度，E組和B組比C組有所升高；變形菌門的豐度，E組和B組比C組有所降低。

表8 腸道菌群在門水平上的多樣性比較

3 討 論

已有研究表明，微生態制劑對反芻動物具體營養和疾病防治等功能，但市場上購買到的微生態制劑其菌株一般來源于體外環境，由于缺乏針對性而無法得到良好的應用效果[2,11]。因此，本試驗將從大別山黃牛各段腸道內容物中分離出的菌落經革蘭氏染色、耐酸耐膽鹽篩選后，最終選取枯草芽孢桿菌與乳酸乳球菌為制作復合微生態制劑的菌株，并通過測定大別山黃牛血清細胞因子、抗氧化與免疫指標及腸道菌群，探究該牛源微生態制劑在大別山黃牛上的應用效果。

3.1 牛源復合微生態制劑對大別山黃牛血清抗氧化指標的影響

動物體內的抗氧化酶主要有SOD、GSH-Px、CAT，機體對氧自由基的清除能力與這些酶的活性有直接關系。MDA是脂質發生過氧化反應的終產物，具有細胞毒性，其含量的高低能夠反映機體過氧化損傷的程度。本試驗結果表明，試驗第30天時，與C組相比，B組和E組血清T-AOC及GSH-Px、CAT活性均顯著升高，B組血清SOD活性顯著高于C組；E組血清SOD活性極顯著高于C組。秦順義等[14]研究發現，在羔羊飼糧中加入富硒益生菌能夠使血清T-AOC與SOD活性顯著或極顯著升高，同時使血清MDA含量顯著或極顯著降低，與本試驗結果一致，說明微生態制劑能夠幫助機體提高抗氧化能力，且復合微生態制劑的效果要略好于單一菌株的微生態制劑。

3.2 牛源復合微生態制劑對大別山黃牛血清免疫指標的影響

IgG、IgA、IgM均是血清中常見的免疫球蛋白，也是反映機體中體液免疫強弱的3個重要指標。趙鵬等[15]在羔羊的微生態制劑應用試驗中得出，添加復合微生態制劑能夠顯著提高羔羊血清IgG、IgM含量。屈圣富等[16]研究發現，在豬飼糧中添加復合微生態制劑能夠使血清IgG含量顯著增加，但對血清IgA含量無顯著影響。從本試驗結果可以看出，血清IgG含量在第15天時B組和E組極顯著高于C組，且在第30天時E組顯著高于B組；血清IgM含量在第15和30天時E組比C組和B組極顯著升高，B組血清IgM含量隨飼喂時間的延長呈上升趨勢，本試驗結果與上述研究結果保持一致。試驗過程中大別山黃犢牛無感染疾病情況，可能是復合微生態制劑刺激腸道上皮細胞促使機體產生IgG和IgM，導致二者的含量升高，進而提高機體免疫力[17]。與B組相比，添加復合微生態制劑的E組提升血清IgG和IgM含量的能力要比單一菌株枯草芽孢桿菌的效果要好，可能是因為本試驗制備的牛源復合微生態制劑中的2種菌在腸道內能夠發揮協同作用，從而對機體免疫力的提升更加明顯。

3.3 牛源復合微生態制劑對大別山黃牛血清細胞因子的影響

細胞因子是由多種細胞被免疫原刺激進而誘導產生的具有調節免疫反應的小分子蛋白質，能夠參與機體的免疫反應，與機體的炎癥反應相關。鮑玉林等[18]研究發現，給犢牦牛應用微生態制劑能夠顯著提高血清IL-2和IFN-γ含量。本試驗中，第30天時，與C組相比，B組與E組血清IL-6和IFN-γ含量顯著升高，同時E組血清IL-2含量也顯著升高，而B組雖呈現上升趨勢，但差異不顯著，這一結果與上述研究結果基本一致，這說明復合微生態制劑進入腸道后作用于宿主的免疫系統，增強了宿主體內免疫細胞的活性，進而提高了動物機體的免疫力。

3.4 牛源復合微生態制劑對大別山黃牛腸道菌群結構的影響

腸道菌群結構的變化一般通過糞便菌群結構的變化來反映[19]，動物腸道內有超過100萬億的細菌等微生物，這些微生物具有抵御病原體侵襲、維持腸道黏膜體系的屏障作用。良好的腸道菌群結構對動物的健康生長至關重要，益生菌能夠幫助宿主消化營養物質，促進動物機體發育與維持腸道內環境的穩態，并參與機體的免疫反應[20]。Rey等[21]研究指出，犢牛瘤胃內的菌群會隨著日齡增長發生變化，隨著日齡增長，擬桿菌門會逐漸替代變形菌門，厚壁菌門中含有大量能夠對纖維起到消化作用的細菌。杜琪等[22]研究發現，犢牛胃腸道內厚壁菌門和擬桿菌門為主要優勢菌群。本試驗結果發現，厚壁菌門、擬桿菌門以及變形菌門構成犢牛腸道的優勢菌群，且從試驗結果可以看出，E組和B組擬桿菌門所占比例增加，且添加復合微生態制劑的E組比B組擬桿菌門豐度增加的更為顯著，而擬桿菌門能夠促進機體對多糖的消化吸收，提高纖維的利用率；同時，E組和B組變形菌門所占比例有所降低，且添加復合微生態制劑的E組厚壁菌門中乳酸菌屬占優，同時比B組變形菌門豐度降低的更為顯著，變形菌門中含有大腸桿菌及沙門氏菌等多種致病菌，說明復合微生態制劑能夠調節大別山黃牛腸道菌群處于動態平衡狀態中，抑制有害微生物的繁殖。綜上所述，本試驗所制備的牛源復合微生態制劑能夠改善大別山黃牛的腸道菌群結構，增加有益菌群數量，同時降低有害菌群數量。

4 結 論

① 本試驗通過耐酸與耐膽鹽試驗，從大別山黃牛腸道內篩選出對酸和膽鹽耐受性都較高的枯草芽孢桿菌和乳酸乳球菌，并將這2株菌進行擴大培養，制備成牛源復合微生態制劑。

② 該牛源復合微生態制劑能夠增強大別山黃牛的免疫功能和抗氧化能力，改善腸道菌群結構，且其應用效果優于單一菌株的微生態制劑。