去盲腸法、套管法和屠宰法測定雞飼糧氨基酸表觀消化率的比較

陳 將 于 耀 鄒 軼 杜中原 王鈺明 譚會澤 劉松柏 曾述禮 賀 喜 趙 峰*

(1.湖南農業大學動物科學技術學院，長沙 410128；2.中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，動物營養學國家重點實驗室，北京 100193；3.溫氏食品集團股份有限公司，新興 527439)

在家禽飼料氨基酸消化率的測定中，消化后食糜樣品的來源直接影響氨基酸的消化率及結果的變異。因此，比較不同方法獲得的回腸末端食糜的差異及其變異對氨基酸消化率的準確測定非常關鍵。目前，在家禽回腸食糜的獲取上，主要通過屠宰法收集回腸食糜[1-4]，或采用去盲腸手術后獲得大量的排泄物樣品[5-6]；也有少量研究通過回腸套管收集雞的食糜[7-8]。屠宰法獲得回腸食糜測定的氨基酸消化率受取樣位置、取樣方式及指示劑的影響[9-10]；此外，從每只雞獲取的樣品量很少(干食糜0.6～3.9 g)，指示劑回收率低[9,11]，因此，其代表性存在質疑。去盲腸法受手術操作復雜，存在術后恢復期等因素的限制，因此，用于測定氨基酸消化率的試驗雞重復數通常不大，且多用于成年公雞。回腸套管法可以多次收集回腸食糜，但仍然受指示劑類型及指示劑在食糜固液相分布的影響。Rezvani等[6]比較了屠宰法與去盲腸法測定雞飼料原料氨基酸消化率的差異，得出去盲腸法的變異系數約為屠宰法的1/3。然而，鮮見關于去盲腸法、屠宰法和套管法采集的回腸食糜在處理重復內的變異及其對氨基酸消化率測定變異的影響。為此，本研究對試驗雞進行去盲腸或回腸套管手術，并觀察術后恢復狀況，在確保試驗雞術后生長正常的基礎上，比較去盲腸法、套管法和屠宰法采集的回腸食糜在氨基酸和指示劑含量的差異與變異及其對氨基酸消化率測定變異的影響，為篩選準確地測定氨基酸消化率的方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

本試驗分為2部分。第1部分考察去盲腸和回腸套管手術的過程及術后恢復情況，對186只雄性黃羽肉雞實施去盲腸手術(第1批39只，55日齡，平均體重1.52 kg；第2批147只，65日齡，平均體重1.40 kg)，47只55日齡的雄性黃羽肉雞(平均體重1.51 kg)實施回腸末套管手術，觀察其術后恢復狀況。第2部分考察黃羽肉雞消化后樣品來源對飼糧氨基酸消化率的影響，采用單因素完全隨機設計，飼糧經黃羽肉雞消化后的樣品來源設3個處理，即去盲腸法排泄物、套管法回腸食糜及屠宰法回腸食糜。選擇42只76日齡雄性黃羽肉雞，其中12只去盲腸雞(平均體重2.327 kg)從第1部分第1批去盲腸雞中選擇；12只回腸套管雞(平均體重2.282 kg)從第1部分回腸套管雞中選擇；術后恢復期均達到21 d以上。18只未做手術的試驗雞(平均體重2.253 kg)從50只雞中選擇。通過去盲腸雞和回腸套管雞獲得樣品每個處理6個重復，每個重復2只雞。通過屠宰獲得的雞回腸食糜每個處理6個重復，每個重復3只雞。參考Zuber等[12]關于采用去盲腸雞測定飼料原料的氨基酸消化率中，試驗雞對飼糧的適應期為4 d、排泄物樣品收集期4 d以及歐洲測定肉雞代謝能參考方法的程序[13]。本試驗中試驗雞術后恢復21 d以上進入正式試驗期，其中試驗期第1～4天為適應期，去盲腸雞在試驗期第5～9天(第5天09：00開始，第9天09：00結束)收集全部排泄物。參考Van Leeuwen等[14]的方法在試驗期第5～7天通過回腸套管收集回腸食糜。在試驗期的第5～9天屠宰完整雞獲取回腸食糜。每次樣品收集后，同一個重復內的樣品合并，放入冰箱冷凍。

1.2 試驗飼糧

根據黃羽肉雞(溫氏廣西土2公雞)的營養需要及生產實際配制玉米-豆粕型飼糧。將玉米過3.5 mm篩片粉碎，豆粕、棉籽粕過2.5 mm篩粉碎，預混料與豆粕逐級稀釋后將所有原料混合冷制粒成試驗飼糧。

表1 玉米-豆粕型飼糧組成及營養水平(風干基礎)

續表1項目 Items含量 Content精氨酸 Arg1.02組氨酸 His0.44異亮氨酸 Ile0.64亮氨酸 Leu1.66賴氨酸 Lys0.96蛋氨酸 Met0.44蘇氨酸 Thr0.69苯丙氨酸 Phe0.85纈氨酸 Val0.76丙氨酸 Ala0.97天冬氨酸 Asp1.43半胱氨酸 Cys0.28谷氨酸 Glu3.02甘氨酸 Gly0.63脯氨酸 Pro1.08絲氨酸 Ser0.79

1.3 試驗動物及飼養管理

試驗在溫氏食品集團股份有限公司養禽事業部肉雞代謝室進行。雄性黃羽公雞單籠飼養于代謝籠(0.42 m×0.42 m×0.52 m)中，代謝室的溫度維持在23～25 ℃，自由采食和飲水，每日光照16 h。飼養管理按動物營養學國家重點實驗室常規程序進行。日常消毒及免疫等管理工作按照溫氏食品集團雞場的正常程序進行。

1.4 肉雞去盲腸手術及回腸套管安裝過程

根據Payne等[15]描述的關于成年公雞去盲腸的外科手術方法進行去盲腸手術，其過程描述如下：首先去除試驗雞腹部泄殖腔以上5 cm×5 cm的羽毛，然后用自制保定架將試驗雞保定后，用手術刀小心打開腹腔，術口打開約4 cm左右。用鈍性鑷子小心勾出試驗雞盲腸端(盲腸部位在試驗雞中部偏左的位置)。結扎所有通向盲腸的血管(注意結扎時要看清血管通路，不要造成其他腸段血液供應中斷)(圖1)。結扎完成后再剪開連接的系膜。盲腸在結扎過程中會遇到難以拉出的現象，觀察牽連部位血管分布，切斷韌帶后再將盲腸輕輕拉出(圖2)。分離完盲腸后在距離回盲連接處1 cm處結扎并剪下盲腸。取出盲腸后，用甲硝唑溶液清洗腹腔，取出殘留的血塊。然后分別縫合腹膜、腹脂層、肌肉層和皮膚。腹脂層采用連續縫合法，肌肉層和皮膚采用鎖邊縫合。皮膚傷口處用碘酒消毒并涂抹青霉素。術后絕食12 h，補飼30 g/dL的葡萄糖溶液50 mL，每日2次，連服3 d。術后第3天開始飼喂飼糧，術后第3～5天分別以30%、60%、100%自由采食的方式喂飼糧。手術當天及術后3 d內每日肌肉注射青鏈霉素100 000 IU/只。術后7 d內每日進行術部消毒，第7天拆除皮膚處手術縫合線。

圖1 結扎盲腸與系膜連接的毛細血管

圖2 游離出2根盲腸

根據趙峰等[16]描述的關于安裝家禽腸道套管的外科手術方法在回腸末端安裝套管。其過程簡述如下：術部除毛、消毒及術口位置與去盲腸手術類似，找到盲腸后牽出回腸，在距離回盲結合處3～5 cm處的回腸部位作約1 cm左右切口，插入套管后荷包縫合(圖3、圖4)。腹腔及皮膚縫合和術后護理同去盲腸手術。

圖3 距回盲結合處5～8 cm的回腸作荷包縫合

圖4 腸壁作1 cm左右小切口，插入套管

1.5 樣品的采集

去盲腸法排泄物和套管法回腸食糜的收集采用在皮膚縫合采樣蓋，采樣袋擰到采樣蓋上后收集。屠宰法回腸食糜的收集參考Poureslami等[17]和Osho等[18]的過程進行，取從距離回盲結合處1 cm往卵黃囊憩室方向2/3的腸道，分成2段后用去離子水沖洗到培養皿中。然后轉入-20 ℃冰柜冷凍保存。試驗結束后所有排泄物或食糜樣品轉入原位凍干機(SCIENTZ-50ND，寧波新芝生物科技股份有限公司)冷凍干燥。

1.6 測定指標

1.6.1 手術及術后恢復評價指標

分別在術前及術后第7天、第14天和第21天，空腹8 h后稱重。記錄切除盲腸的長度、重量。記錄術后死淘試驗雞只數，計算術后死亡及淘汰率。

1.6.2 化學成分分析

水分含量參考GB/T 6435—2014進行測定，粗蛋白質含量采用GB/T 6432—1994以凱氏定氮法測定。飼糧及食糜或排泄物中二氧化鈦(TiO2)含量參考Myers等[19]和Wang等[20]的方法進行測定。樣品氨基酸含量參考AOAC(1997，方法994.12)進行測定，其過程為：樣品先在過氧甲酸溶液中0 ℃氧化16 h，將蛋氨酸和半胱氨酸氧化成蛋氨酸砜和磺基丙氨酸，反應結束后加入焦亞硫酸鈉分解過量的過氧甲酸，再用6 mol/L鹽酸溶液(含苯酚)在110 ℃下水解23 h；水解液用氨基酸分析儀(biochrom 30，英國)進行色譜分離；分離后的氨基酸與茚三酮混合并且在加熱的反應線圈中生成特定的顯色物質(柱后衍生)，通過紫外570 nm波長或者440 nm波長檢測，使用OPENLAB軟件對色譜圖積分。

1.7 數據處理與統計分析

全收糞法表觀氨基酸消化率(%)=100-
(氨基酸排泄量/飼糧氨基酸攝入量)×100；
指示劑法表觀氨基酸消化率(%)=100-[(飼糧
TiO2含量×食糜或排泄物氨基酸含量)/
(食糜或排泄物TiO2含量×飼糧
氨基酸含量)]×100。

采用SAS 9.0軟件Means模塊計算基本統計量，并計算每個處理下重復數據的75%(Q3)和25%(Q1)分位數。四分位距(IQR)=Q3-Q1；Q1-1.5×IQR～Q3+1.5×IQR以外的數據為異常數據予以剔除。采用ttest模塊對第1、2批去除盲腸的長度進行t檢驗，其他處理采用GLM模塊進行方差分析，并以Duncan氏法進行多重比較。P<0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 肉雞去盲腸和回腸套管手術過程及術后恢復狀況

如表2所示，在去盲腸手術中，第2批去盲腸手術切除的短盲腸長度和長盲腸長度顯著長于第1批(P<0.05)，手術時長顯著短于第1批(P<0.05)。回腸套管手術時長顯著短于去盲腸手術(P<0.05)。第2批去盲腸手術肉雞的術前及術后第7天、第21天體重顯著低于第1批去盲腸手術和回腸套管手術(P<0.05)。而3組肉雞的術后第7天、第14天和第21天增重均無顯著差異(P>0.05)。第1批、第2批去盲腸手術和回腸套管手術肉雞術后3個月的合計術后死亡及淘汰率分別為23.1%、20.4%和33.9%。

表2 肉雞去盲腸和回腸套管手術過程其術后恢復狀況

2.2 去盲腸法排泄物、套管法回腸食糜和屠宰法回腸食糜氨中基酸含量的差異

如表3所示，去盲腸法排泄物中TiO2含量顯著高于套管法回腸食糜(P<0.05)，但顯著低于屠宰法回腸食糜(P<0.05)；套管法回腸食糜中TiO2含量顯著低于屠宰法回腸食糜(P<0.05)。去盲腸法排泄物中半胱氨酸、蘇氨酸和脯氨酸含量顯著低于套管法回腸食糜(P<0.05)，組氨酸、賴氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸含量顯著高于套管法回腸食糜和屠宰法回腸食糜(P<0.05)。套管法回腸食糜中半胱氨酸、蘇氨酸和脯氨酸含量顯著高于屠宰法回腸食糜(P<0.05)。

表3 去盲腸法排泄物、套管法回腸食糜和屠宰法回腸食糜中氨基酸含量(干物質基礎)

2.3 去盲腸全收糞法、去盲腸指示劑法、套管法和屠宰法對飼糧氨基酸表觀消化率的影響

如表4所示，去盲腸全收糞法和去盲腸指示劑法測定的飼糧氨酸表觀消化率無顯著差異(P>0.05)。去盲腸全收糞法測定的飼糧半胱氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、天冬氨酸和脯氨酸表觀消化率均顯著高于套管法(P<0.05)，而甘氨酸表觀消化率顯著低于套管法(P<0.05)。去盲腸全收糞法測定的飼糧組氨酸、賴氨酸、甘氨酸和苯丙氨酸表觀消化率顯著低于屠宰法(P<0.05)。套管法測定的飼糧半胱氨酸、組氨酸、賴氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸和總氨基酸表觀消化率均顯著低于屠宰法(P<0.05)。

表4 去盲腸全收糞法、去盲腸指示劑法、套管法和屠宰法對飼糧氨基酸表觀消化率的影響

續表4項目Items去盲腸全收糞法Cecectomy total collection method 去盲腸指示劑法Cecectomy indicator method 套管法Cannulation method屠宰法Slaughter methodSEMP值P-value天冬氨酸 Asp78.7a78.5a74.0b81.0a1.20.003 8半胱氨酸 Cys69.4a69.0a56.3b73.2a1.8<0.000 1谷氨酸 Glu86.185.984.587.50.90.168 5甘氨酸 Gly56.5c56.3c67.4b76.6a2.8<0.000 1脯氨酸 Pro80.7a80.4a73.6b81.4a1.20.000 3絲氨酸 Ser79.279.075.880.31.20.074 2總氨基酸 Total amino acids 82.0ab81.8ab79.9b84.3a0.90.028 1

如表5所示，去盲腸法排泄物與屠宰法回腸食糜中TiO2含量的變異系數接近，而套管法回腸食糜中TiO2含量的變異系數是去盲腸法排泄物和屠宰法回腸食糜中TiO2含量的變異系數的2.35倍。在氨基酸含量的變異上，去盲腸法排泄物中5種氨基酸含量、套管法回腸食糜中10種氨基酸含量、屠宰法回腸食糜中8種氨基酸含量的變異系數超過10%。去盲腸法排泄物、屠宰法回腸食糜和套管法回腸食糜中氨基酸含量的變異系數依次增加。在氨基酸表觀消化率的變異上，去盲腸全收糞法測定的8種氨基酸表觀消化率、去盲腸指示劑法測定的3種氨基酸表觀消化率、套管法測定的12種氨基酸表觀消化率、屠宰法測定的1種氨基酸表觀消化率的變異系數超過3%。

表5 氨基酸含量和氨基酸表觀消化率的變異系數

續表5項目Items氨基酸含量變異系數 CV of amino acid contents去盲腸法排泄物Excreta in cecectomy套管法回腸食糜Ileal digesta in cannulation method屠宰法回腸食糜Ileal digesta in slaughter method氨基酸表觀消化率變異系數CV of amino acid apparent digestibilities 去盲腸全收糞法Cecectomy total collection method 去盲腸指示劑法Cecectomy indicator method套管法Cannulation method屠宰法Slaughter method半胱氨酸Cys7.389.349.905.164.3812.664.07谷氨酸Glu9.8211.7214.272.202.043.362.24甘氨酸Gly17.949.087.3917.1713.787.272.55脯氨酸Pro6.859.4010.812.202.186.192.90絲氨酸Ser7.9610.149.443.562.835.192.61平均值Mean9.9210.4510.594.904.094.912.41總氨基酸 Total amino acids6.689.7710.212.712.094.062.12所有氨基酸平均值Mean of all amino acids9.0110.629.963.823.164.922.22

3 討 論

3.1 肉雞飼糧氨基酸消化率測定中消化后樣品的獲取方法

飼糧蛋白質在畜禽體內水解成氨基酸或小肽后主要在回腸末端前被吸收，未消化的蛋白質進入后腸后，微生物對蛋白質的降解會影響排泄物氨基酸的組成及含量[21]，導致氨基酸消化率與動物體內實際可利用的氨基酸不相符。在成年公雞(體重約2.0 kg)中，流經回盲結合處進入盲腸的干物質約占排泄物的18%，水分約占17%[22]，由此導致雞糞末端的氨基酸消化率比回腸末端的氨基酸消化率高[23-25]。因此，在飼糧氨基酸表觀消化率的測定中，需要獲得排除微生物參與降解的消化后樣品。目前，主要通過3種手段獲取樣品。1)去盲腸手術切除盲腸后獲得排泄物樣品，該方法在德國使用較多[5-6,26]。其優點是可以收集全部消化后的樣品，代表性好。缺點是去盲腸手術耗時長，盲腸腸系膜的毛細血管不通過結扎止血容易發生感染而導致死亡。因此，測定1個樣品氨基酸表觀消化率的去盲腸雞數量一般在10只以下[12, 27]。在1個試驗中測定多個樣品的氨基酸消化率時，為了滿足重復數要求，可能需要采用拉丁方設計[27]。在本試驗中，去盲腸手術在1 h以上，術后增重恢復符合預期，術后3個月以上仍正常健康的肉雞為77%～80%。在2個批次的去盲腸手術中，第2批去盲腸手術時間更短，切除盲腸的長度比第1批次長約1 cm；在術后1個月內死亡及淘汰率遠高于第1批，而在術后1～2個月內死亡及淘汰率遠低于第1批。這主要是第2批手術前試驗雞從籠養中移入代謝籠中2～3 d開始進行手術，應激過大而導致術后1周內術后死亡及淘汰率較高。上述結果也表明，隨著外科手術人員去除盲腸操作的嫻熟，手術耗時更少，去除盲腸的根部更加徹底，成活率更高。因此，本試驗的手術可以獲得大批量去盲腸試驗雞。2)在雞的回腸末端安裝套管，收集食糜。該方法在20世紀80～90年代有很少量的文獻報道[7-8]。其優點是類似于豬回腸末端氨基酸表觀消化率的測定，可以多次收集流經回腸末端的部分食糜樣品，樣品量可以滿足要求。其缺點是禽用套管的內徑小，容易出現回腸食糜固液分離。本試驗中套管法回腸食糜中TiO2含量顯著低于去盲腸法排泄物和屠宰法回腸食糜中，而其中7個氨基酸含量與去盲腸法排泄物有顯著差異，且氨基酸含量的變異系數高于去盲腸法排泄物和屠宰法回腸食糜。這可能與套管法收集的食糜出現固液分離(液體更多)有關，由此也說明，套管法收集回腸食糜雖然可以多次采集樣品，但樣品的代表性并不滿意。3)屠宰后收集后段回腸食糜是目前文獻報道最多的方法[1-4]。其缺點是回腸食糜的氨基酸含量受取樣位置、取樣方式的影響[9,17]。其次，每只雞獲取的樣品量較少，每個重復需要屠宰較多的試驗雞才能獲得足夠的樣品用于分析。為了盡可能采集到每只雞的回腸食糜，需要嚴格規定屠宰前試驗雞集中采食的時間[28]。再次，該方法所采集的回腸食糜占每天流經回腸食糜總量的比例較少，其代表性存在質疑。本研究中，屠宰法回腸食糜中有4個氨基酸(賴氨酸、組氨酸、苯丙氨酸和甘氨酸)含量與去盲腸法排泄物有差異，且重復變異系數僅稍高于去盲腸法排泄物(9.96% vs. 9.01%)，這表明屠宰獲得的回腸食糜的代表性與去盲腸法收集的排泄物是接近的。

3.2 去盲腸全收糞法、去盲腸指示劑法、套管法和屠宰法對飼糧氨基酸表觀消化率的影響

套管法或屠宰法收集回腸食糜均需要通過外源指示劑估測流經回腸的食糜總量，因此，指示劑的測定精度將直接影響氨基酸表觀消化率的計算值。本試驗中，去盲腸全收糞法與去盲腸指示劑法測定的飼糧氨基酸表觀消化率非常接近，且無顯著差異，這表明本試驗測定TiO2含量準確度高。因此，套管法或屠宰法收集回腸食糜測定氨基酸表觀消化率與去盲腸全收糞測定氨基酸表觀消化率的比較上可以排除因指示劑的引入而導致的差異。Rezvan等[6]報道，屠宰法收集回腸食糜測定15種氨基酸的表觀消化率比去盲腸全收糞法平均低4.7個百分點，而標準誤約為去盲腸全收糞法的3.3倍。在本研究中，回腸食糜來自于卵黃囊憩室至回盲結合處前2 cm的腸道內容物。Kluth等[9]的試驗結果表明，沿Ross肉雞卵黃囊憩室至回盲結合處縱向分布的前1/3段、中間1/3段和后1/3段食糜作為消化后樣品計算氨基酸表觀消化率的差異中，前1/3段食糜樣品比中間1/3段和后1/3段食糜樣品計算的氨基酸表觀消化率低3%～10%。而Poureslami等[17]報道，肉雞回腸末端食糜樣品測定的氨基酸表觀消化率與全回腸食糜(卵黃囊憩室至回盲結合處)樣品測定的氨基酸表觀消化率無顯著差異。Kim等[29]比較去盲腸全收糞法與屠宰法測定的氨基酸表觀消化率總體上相一致，但不同的原料間有所差異。本試驗中，屠宰收集回腸中后段(2/3)食糜，其氨基酸表觀消化率與去盲腸收集排泄物測定的氨基酸表觀消化率，除3個氨基酸外，其他氨基酸的消化率均無顯著差異。在變異系數上，屠宰法甚至低于去盲腸全收糞法(2.22% vs 3.82%)。這表明去盲腸全收糞法與屠宰法在測定飼糧氨基酸表觀消化率上具有可比性。Johns等[7]報道套管收集回腸末端食糜測定的氨基酸表觀消化率顯著低于屠宰收集回腸食糜。本研究也呈現類似的規律，且套管法測定的氨基酸表觀消化率的變異系數明顯高于屠宰法和去盲腸全收糞法。從套管法回腸食糜中TiO2含量偏低，變異系數為去盲腸法排泄物和屠宰法回腸食糜的2倍以上，可以推斷套管法收集回腸末端食糜很可能出現所采集的樣品不能代表流經回腸末端的全部食糜，從而導致氨基酸表觀消化率測定不準確。

4 結 論

去盲腸法收集排泄物與屠宰法收集回腸食糜在TiO2、氨基酸含量、氨基酸表觀消化率及其變異系數比較接近，且與套管法收集回腸食糜法有較大差異。因此，去盲腸法收集排泄物與屠宰法收集回腸食糜在測定氨基酸的消化率上具有可比性，而套管法收集回腸食糜法不適合用于測定氨基酸表觀消化率。

致謝：感謝北京農學院動物科技學院張華老師在雞去盲腸手術方面給予的悉心指導！