高寒草原天然牧草營養品質近紅外光譜預測模型的建立

姚喜喜 孫海群 李長慧 張振西 陳善晶 謝久祥

(青海大學農牧學院，西寧 810016)

牧草營養品質是評價草地資源最為重要的指標之一，牧草營養品質包括牧草常規營養成分含量和養分消化率，其直接決定家畜的生長和發育，也間接影響畜產品的產量和質量[1]。干物質(dry matter，DM)、粗脂肪(ether extract，EE)、粗蛋白質(crude protein，CP)、酸性洗滌纖維(acid detergent fiber，ADF)、中性洗滌纖維(neutral detergent fiber，NDF)、體外干物質消化率(in vitro dry matter digestibility，IVDMD)和估算代謝能(estimated metabolizable energy，EME)是評價天然牧草營養品質的重要指標。牧草的營養品質與牧草種類、生育期、成熟期、施肥、氣候條件等有著密切關系[2-3]。研究表明，不同種類牧草營養品質差異較大[4]，同類牧草營養品質也會隨其生育期的推移而顯著下降[3,5]。牧草營養價值廣泛，但變異較大。因此，如何高效、快速、準確地對天然牧草營養品質進行無損檢測，對如營養成分含量和養分消化率這些參數的簡單和準確預測，是評估天然牧草營養供給和家畜能氮均衡需要的基礎，也是合理開發利用和有效保護草地資源的重要依據[6]。

動物營養學家長期以來一直認識到測定牧草中營養成分含量的重要性。已經建立了用于量化諸如蛋白質、能量或礦物質含量之類的飼料質量參數的各種傳統的分析化學技術，并預測其營養價值[7-9]。然而，傳統的天然牧草營養品質檢測方法耗時、費力、成本昂貴，而且在某些情況下涉及到危險化學藥品，檢測方式難以與實際生產同步。因此，快速、及時、準確、廉價測定天然牧草營養品質，是解決當前草原生態保護和草地畜牧業生產的關鍵問題。

本試驗從研究樣地廣泛收集不同天然牧草樣品共計1 280份，測定其DM、CP、EE、ADF、NDF含量及IVDMD和ME這7項營養指標，并評價各個指標的變異程度；建立天然牧草中營養品質的近紅外光譜(NIRS)預測模型，并通過比較其定標集和驗證集樣品對營養品質的預測效果評價，初步建立祁連山高寒牧區高寒草甸天然牧草DM、CP、EE、ADF、NDF含量及IVDMD和ME定量分析模型，以期為祁連山高寒牧區天然牧草營養價值數據庫的建立提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 樣品收集與制備

本試驗于2015—2018年，每年6—9月份，從研究樣地收集不同放牧強度(0、3.6、5.3、7.6只/hm2)的混合和4個優勢種(莎草科矮生嵩草、蓼科珠芽蓼、薔薇科金露梅和豆科錦雞兒)牧草樣品共計1 280份。對所收集的1 280份牧草樣品分別采用四分法進行取樣，將取樣后大約250 g樣品使用立體式粉碎機(CS200A，河北辰盛農業科技有限公司)粉碎后過40目網篩。制備好的樣品分成3份，1份用于實驗室濕化學分析，1份用于NIRS收集和掃描，1份作為預留樣品。

1.2 營養指標測定及方法

牧草DM含量測定以風干牧草樣品為基礎[10]，EE含量采用烘干法和傳統索氏抽提法測定[10]，CP含量采用全自動凱氏定氮儀(Foss Kheltec 8400)測定[11]；ADF和NDF含量使用全自動纖維分析儀(ANKOM 2000 Fiber Analyzer)，采用Van Soest纖維分析法測定[12]；IVDMD的測定采用體外發酵裝置(DaisyPIIPIncubator)，應用Tilley等[13]的體外兩步消化法測定；EME采用模型計算[14]，公式為：

EME=0.17×IVDMD-2.0。

1.3 儀器參數及光譜采集

使用可見近紅外快速成分光譜分析儀(XDS-RCA，美國FOSS公司)進行NIRS采集，該儀器采用硅檢測器(400～1 100 nm)和硫化鉛檢測器(1 100～2 500 nm)雙檢測器系統；光譜分辨率為2 nm；儀器同時配備固定式和移動式樣品掃描杯；樣品裝載于移動式樣品杯中，掃描光譜范圍為400～2 500 nm，波長間隔為2 nm；波長準確度小于0.05 nm；數據采集頻率為2次/s，取平均值，并轉化為log1/R數據形式記錄數據。所有牧草營養品質測定指標均以DM基礎表示。每份樣品平行測定3次，取其均值作為建模的參比值，采用Kovalenko等[15]提出的牧草樣品實驗室檢測誤差(stardard error of laboratory，SEL)進行樣品誤差檢測，計算公式為：

相對實驗室檢測誤差(relative standard error of laboratory，RESL)根據以下公式計算：

RESL(%)=100×SEL/總體平均值。

1.4 模型的建立與驗證

NIRS技術流程主要分為校正模型的建立和未知樣品的預測，如圖1所示[16]。樣品按照3∶1的比例，隨機從1 280份牧草樣品中選擇854份作為定標樣品集(n=854)，用來建立定標模型；剩余的426份作為預測樣品集(n=426)，對定標模型的預測結果進行外部驗證。在所建立的定標模型中，CP、DM、IVDMD、EME、ADF和NDF在400～2 499 nm波長定標效果最佳，最佳定標方式分別為改進偏最小二乘法+矢量歸一化+去散射處理+二階導數處理、改進偏最小二乘法+矢量歸一化+去散射處理+一階導數處理、改進偏最小二乘法+矢量歸一化+去散射處理+二階導數處理、改進偏最小二乘法+矢量歸一化+去散射處理+二階導數處理、改進偏最小二乘法+矢量歸一化處理+一階導數處理和改進偏最小二乘法+矢量歸一化+去散射處理+二階導數處理，光譜間隔點均為4，一次平滑處理光譜間隔點均為4，二次平滑處理光譜間隔點均為1。利用WinISI Ⅲ定標分析軟件，對定標集樣品進行聚類分析和運算，選擇具有代表性樣品，剔除異常樣品，輸入牧草營養成分和消化率等數據后利用WinISI Ⅲ軟件建立定標模型。

圖1 NIRS技術分析流程

表1 校準性能標準

2 結 果

2.1 牧草樣品光譜掃描結果

1 280份牧草樣品原始NIRS掃描光譜曲線圖如圖2-a所示。牧草樣品原始光譜在可見光和NIRS區域均有吸收，表現出了明顯的吸收峰，不同樣品由于散射所表現出的掃描吸收曲線表現出各樣品之間的平行移動特點，各吸收曲線變化一致且能互相區分，吸收峰較寬、基線垂直漂移，表明可以用于進一步分析和建模。原始樣品NIRS通過二階導數處理后(以2,4,4,1為例)，樣品的光譜差異更加明顯，吸收峰也得到明顯的增強，同時，基線垂直漂移狀況得到了有效的校正(圖2-b)。二階導數+去散射法處理后(以標準正態變量校正結合去除趨勢校正為例)，消除了原始樣品NIRS受去散射現象的影響，各牧草樣品NIRS平移現象得以改善(圖2-c)。

a：全集樣品圖譜 spectra of all samples；b：二階導數(2,4,4,1) second derivative (2,4,4,1)；c：二階導數+標準正態變量校正結合去除趨勢校正(SNVD) second derivative+stamdard normal variate plus derend correction (SNVD)。

2.2 全集、定標集和驗證集樣品營養品質測定

牧草中全集、定標集和驗證集的常規營養成分含量、IVDMD和EME見表2，所有營養品質指標均以DM為基礎。全集牧草樣品的DM、CP、EE、ADF、NDF含量及IVDMD和EME分別為80.38%～98.91%、3.13%～25.10%、0.91%～7.70%、19.98%～58.71%、36.95%～79.38%、38.77%～75.21%和4.88～11.07 MJ/kg，平均值分別為94.33%、11.38%、2.88%、38.15%、62.52%、56.96%和7.97 MJ/kg。定標集牧草樣品的DM、CP、EE、ADF、NDF含量及IVDMD和EME分別為91.20%～96.78%、3.13%～21.54%、1.18%～7.47%、27.61%～55.64%、38.47%～75.47%、40.90%～68.84%和5.24～9.99 MJ/kg，平均值分別為94.12%、10.81%、2.71%、38.33%、62.88%、56.57%和7.91 MJ/kg。驗證集牧草樣品的DM、CP、EE、ADF、NDF含量及IVDMD和EME分別為80.38%～98.91%、4.31%～25.10%、0.91%～7.70%、19.98%～58.71%、36.95%～79.38%、38.77%～75.21%和4.88～911.07 MJ/kg，平均值分別為94.43%、11.64%、2.95%、38.07%、62.35%、57.14%和8.00 MJ/kg。所測全集、定標集和驗證集牧草營養品質標準差和變異系數分別為0.97%～9.35%、10.11%～27.03%、0.91%～7.76%和10.12%～30.81%、0.03%～0.94%和10.02%～33.38%。

表2 牧草中常規營養成分含量、IVDMD和估算代謝能(干物質基礎)

2.3 定標集樣品的最佳定標方式及模型參數

通過對854個定標集牧草樣品NIRS進行預處理，確定了牧草中常規營養成分含量、IVDMD和EME的最佳定標方式，定標結果如表3所示。在所建立的定標模型中，CP、DM、IVDMD、EME、ADF和NDF的定標標準偏差(SEC)分為0.001 1、0.902 2、0.378 9、4.454 8、0.171 7和0.344 5，內部交互驗證標準偏差(SECV)分別為0.008 7、0.007 1、0.020 4、0.336 2、0.024 2和0.035 8，而內部交互驗證相關系數(1-VR)分別為0.967 2、0.947 1、0.929 5、0.925 1、0.915 9和0.909 5。

表3 牧草營養品質的最佳定標方式及定標結果

2.4 驗證集樣品定標模型的外部驗證結果

表4 牧草營養品質定標模型的外部驗證結果

3 討 論

自1976年最早開展了對牧草8種營養成分進行NIRS預測飼料營養成分潛力的研究以來，NIRS技術在預測牧草營養成分的研究和應用已走過了40余年的時間[19-26]。迄今為止，NIRS技術用于檢測牧草營養成分的相關研究資料已有很多，主要檢測成分包括DM、CP、EE、粗灰分(Ash)、ADF、NDF、鈣(Ca)、磷(P)含量及IVDMD等，相應地在建立了一些適用于部分地區特定牧草的NIRS預測模型[8,20,27-30]。但由于牧草營養品質受牧草種類組成、生長年際降雨量、生長季節、土壤肥力等多種因素的綜合影響，現已有的模型并沒有完全考慮上述因子的影響，開發的模型實用性和完整性非常欠缺，不能較好的適應特定區域草地牧草生產和家畜放牧營養均衡管理[31-32]。為保證NIRS技術對特定牧區牧草營養品質的準確預測，實現放牧家畜的精準管理和補飼，對于評價草畜營養均衡需要、更好地利用和保護天然草地資源、實現草原永續發展來說，建立針對牧草種類、年際降雨、生長季節不同和不同載畜量的NIRS快速檢測模型非常必要。

本研究對祁連山高寒牧區高寒草甸2015—2018年，每個放牧年份6—9份，從研究樣地收集的不同放牧強度(0、3.6、5.3、7.6只/hm2)的混合和4個優勢種(莎草科矮生嵩草、蓼科珠芽蓼、薔薇科金露梅和豆科錦雞兒)牧草樣品共計1 280份，進行了DM、CP、EE、ADF、NDF含量及IVDMD和EME營養品質測定，并試圖建立NIRS預測模型，通過對初步建立的天然牧草營養品質NIRS預測模型進行定標和校驗，結果表明了所建立的定標模型對DM、CP、ADF、NDF含量及IVDMD、EME營養品質指標的驗證結果最佳，其中，模型對于DM、CP含量及IVDMD、EME的RPD均在4以上；對于ADF、NDF含量的RPD在3～4；對于EE的外部驗證預測效果較不理想，RPD為2.3，說明所建立的定標模型對EE指標的粗略定量分析是可行的，但精度有待提高。本研究建立的模型預測與李潔等[33]利用新疆伊犁昭蘇草原5—10月份的5種單一品種牧草及混合牧草建立的牧草營養成分相關預測模型進行對比發現，本研究所建立的NIRS預測模型在預測DM、CP、ADF、NDF含量及IVDMD和EME營養品質指標時預測準確性評價指標RPD均高于李潔等[33]的建模結果，而對EE含量預測效果與李潔等[33]建模效果一樣僅能用于粗略測定；與薛祝林等[34]利用紫花苜蓿草捆樣品建立的營養品質和消化率預測模型CP、NDF、ADF含量和IVDMD預測的RPD介于2.5～3.0相比，本研究的RPD介于3.8～5.9，模型預測準確性顯著提高；與聶志東等[9]建立的對紫花苜蓿青干草DM、CP、ADF、NDF含量預測模型，陳鵬飛等[35]建立的用于青貯苜蓿鮮樣DM、CP、ADF、NDF含量及IVDMD預測模型相比，預測準確性均有所提高；與De Boever等[7]和Shenk等[25]建立的青貯玉米DM、EE、CP、ADF、NDF含量測定預測模型和紅三葉中DM、CP、NDF、Ca、P含量預測模型相比，本研究在DM、CP和ADF含量預測的準確性上有所提高。本研究對EE含量的預測效果較差，這一結論與李潔等[33]、薛祝林等[34]和De Boever等[7]的研究結果一致，可能的原因除實驗室測定誤差較大和樣品間差異較小之外，也與EE在牧草樣品中的含量少和靈敏度低有關。因此，在今后的研究工作中，需要進一步降低實驗室測定誤差、進一步擴充樣本量等多種方法對定標方程進行逐步校正，從而實現NIRS預測模型對高寒草地天然牧草EE含量的準確預測。

目前，國內外有關NIRS技術在農業方面的研究應用主要體現在新疆昭蘇草原、人工牧草和青貯飼料營養成分預測幾個方面，由于高寒草地天然牧草營養成分和品質易受氣候、海拔、牧草種類、生長季節、放牧及土壤養分等因素的影響[36-40]，目前NIRS技術在祁連山高寒草原天然牧草營養成分和品質評價方面的應用未有報道，尚未建立不同年份、不同季節、不同放牧強度和不同物種營養品質定量分析模型，在祁連山高寒草地天然草原牧草營養成分、消化率、代謝能預測方面的研究更是鮮見報道，因此，建立祁連山高寒草原天然牧草營養品質NIRS預測模型非常必要。

4 結 論

本試驗利用NIRS技術建立了祁連山高寒牧區高寒草甸天然牧草DM、CP、ADF、NDF、EE含量及IVDMD和EME的近紅外預測模型。其中，模型對于DM、CP、ADF、NDF含量及IVDMD和EME的外部RPD均大于3.82，可用于實際測定；而對于EE含量的外部RPD為2.30，模型預測效果不太成功，但適度可用。