晉南牛固醇結合原件蛋白1基因在不同組織中表達規律及其與肌內脂肪含量的相關性研究

程 景 張元慶 王 曦 張丹丹 李 博 靳 光 王棟才 徐 芳 孫銳鋒 梁 圓 薛麗娜

(山西農業大學(山西省農業科學院)動物科學學院，太原 030032)

隨著人們生活質量的提高，優質牛肉備受消費者的青睞。晉南牛是我國古老而優秀的黃牛品種，具有良好的肉用性能，是可向專門化肉牛品種方向選育的地方黃牛品種之一。肌內脂肪(intramuscular fat,IMF)是沉積在骨骼肌肌纖維和肌束間的脂肪組織，也稱為大理石花紋脂肪組織。IMF含量和分布決定了牛肉的大理石花紋的沉積[1]。作為衡量牛肉品質的重要指標，IMF含量和脂肪酸的組成是決定肉品質的重要因素，IMF對肉的感官品質和嫩度都有影響[2]，而不飽和脂肪酸(unsaturated fatty acid,UFA)和飽和脂肪酸(saturated fatty acid,SFA)的比例、UFA中脂肪酸的組成對改善肉的風味、提高營養價值具有重要意義[3]。

固醇調節原件結合蛋白(sterol regulatory element binding proteins,SREBPs)屬于堿性螺旋-環-螺旋亮氨酸拉鏈轉錄因子家族，是膜結合蛋白，其主要通過促進糖酵解和脂肪生成而在能量調節中發揮重要的作用[4]。哺乳動物SREBPs基因包括SREBP1、SREBP2 2種。從NCBI上GenBank中的數據可知，在牛上，SREBP1基因定位于19號染色體，mRNA長度3 983，編碼1 146個氨基酸；SREBP2基因定位于5號染色體，mRNA長度5 194，編碼1 140個氨基酸。其中SREBP1基因主要激活脂肪酸合成，SREBP2基因則主要調控膽固醇代謝[5]。SREBP1基因的增加均可顯著促進細胞中脂滴的形成[6]，且大量研究還表明，該基因與脂肪、膽固醇代謝紊亂等引起的諸多疾病和氧化應激等密切相關[7-9]。研究SREBP1基因在脂肪代謝中的調控作用，對闡明肌內脂肪形成、改善牛肉品質具有重要意義。

SREBP1基因在脂肪形成中具有重要作用，且目前未見對晉南牛SREBP1基因表達規律的相關報道，因此，本研究以晉南牛為研究對象，分析檢測不同組織中SREBP1基因的表達規律并分析不同IMF含量個體SREBP1基因在背最長肌(longissimusdorsi,LP)、皮下脂肪(subcutaneous fat,SF)、腹腔脂肪(abdominal fat,AF)、胸腔脂肪(chest fat,CF)中的表達規律，為研究牛SREBP1基因在IMF沉積過程中的作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選用12頭8月齡、體重為(264.00±30.49) kg的晉南牛，進行分階段育肥。飼糧按《肉牛營養需要和飼養標準》配制，飼養管理方式按照山西農業大學(山西省農業科學院)畜牧獸醫研究所實驗牛場日常飼養執行，所有牛只飼養管理條件一致。試驗牛散欄飼養，每日08：00和19：00各飼喂1次，自由采食，飲水充足。屠宰時體重為(615.17±43.40) kg，牛只采用上線屠宰，電擊后15 min內進行樣本采集。使用RNAnase清除劑(Solarbio,北京索萊寶科技有限公司)處理過的剪刀采集心臟、脾臟、腎臟、肝臟、LP、SF、AF、CF，每個部位3個重復，迅速投入凍存管并放入液氮罐中帶回實驗室-80 ℃保存，用于RNA提取；排酸24 h后，取第12～13肋間左側胴體LP，測定IMF含量后，選取IMF含量最高的3頭(IMF含量分別為11.50%、13.30%、12.10%)和最低的3頭(IMF含量分別為4.40%、4.50%、4.30%)，測定肉品質相關指標。

1.2 試驗方法

1.2.1 Total RNA的提取和cDNA的合成

采用百泰克(北京)試劑盒提取各組織中的Total RNA，經NanoDrop-2000超微量核酸蛋白測定儀(Thermo Fisher,德國)和電泳檢測純度和完整性后使用反轉錄試劑盒(TaKaRa)合成cDNA。

1.2.2SREBP1基因和內參基因的設計及合成

根據GenBank公布的牛SREBP1基因序列和β-微管蛋白(TUBB)基因序列，參照實時熒光定量PCR(real time-qPCR)引物設計原則，應用NCBI primer-BLAST(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi)設計引物。引物由北京擎科新業生物技術有限公司合成。引物信息見表1。

表1 引物信息

1.2.3 實時熒光定量PCR

以不同牛只、不同組織的cDNA為模板，以TUBB作為內參基因開展實時熒光定量PCR試驗。反應體系為20 μL：cDNA 2 μL，Format Primer 0.4 μL，Reverse Primer 0.4 μL，SYBR Premix PCR 10 μL，補充dd H2O至20 μL。使用Rotor-Gene Q實時熒光定量PCR(Qiagen,德國)進行檢測，反應條件：95 ℃變性1 min；60 ℃退火10 s，72 ℃延伸30 s，35個循環；70～95 ℃熔解20 s，每0.5 ℃讀取1次熒光值，每個樣品設置3個重復，每個個體進行3次技術重復，陰性對照為無cDNA模板的樣品。

1.2.4 LP脂肪酸及氨基酸組成的測定

將采集的肌肉樣品密封-4 ℃保存，在24 h內送至華測檢測認證集團股份有限公司，測定脂肪酸37種、氨基酸16種。樣品經研磨機低溫勻漿后備用，隨后對牛肉中的總脂肪酸和氨基酸組成進行檢測分析。其中脂肪酸含量測定方法依照GB 5009.168《食品安全國家標準 食品中脂肪酸的測定》，使用GC-2010Plus氣相色譜儀(Shimadzu,日本)測定，測定方法為內標法，內標物為十一碳酸甘油三酯，色譜柱選用SP-2560氣相毛細管柱(Supelco,美國)，規格為100 m×0.25 mm×0.20 μm(長度×內徑×膜厚)，固定相為聚二氰丙基硅氧烷；氨基酸含量測定方法依照GB 5009.124《食品安全國家標準 食品中氨基酸的測定》，使用LA-8080全自動氨基酸分析儀(Hitachi,日本)測定。為保證測定結果的準確性，同時加送2個樣品的平行樣。

1.3 數據分析

目標基因相對表達量采用2-ΔΔCt法[10]計算，原始數據使用Excel 2019處理。使用SPSS 21.0的一般線性模型進行單因素方差分析(one-way ANOVA,LSD)和Duncan氏多重比較，采用Pearson相關性分析。結果采用平均值±標準差表示，以P<0.05為差異顯著的判定標準，P<0.01為差異極顯著的判斷標準。

2 結果與分析

2.1 不同IMF含量晉南牛生長性能、屠宰性能及肉品質

由表2可知，HIF組平均日增重(0.76 kg)高于LIF組(0.73 kg)，但差異不顯著(P>0.05)；LIF組胴體重、屠宰率均顯著高于HIF組(P<0.05)。HIF組第12～13肋間LP的pH48 h、水分含量均小于LIF組(P>0.05)，滴水損失高于LIF組(P>0.05)；LIF組剪切力顯著高于HIF組(P<0.05)，LIF組IMF含量為4.40%，HIF組IMF含量為12.30%，兩者之間差異極顯著(P<0.01)。

表2 不同IMF含量晉南牛生長性能、屠宰性能和肉品質

2.2 不同IMF含量晉南牛LP中脂肪酸組成

由表3可知，2組均未檢出C14∶0以下的脂肪酸。其中，HIF組中LP的總脂肪酸(TFA)含量為9.698%，LIF組的TFA含量為4.064%，兩者之間差異顯著(P<0.05)。HIF組中豆蔻酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、花生四烯酸含量均顯著或極顯著高于LIF組(P<0.05或P<0.01)；HIF組中芥酸含量也高于LIF組，但差異不顯著(P>0.05)；亞麻酸含量在2組基本相同，均為0.018%。

表3 不同IMF含量晉南牛背最長肌中脂肪酸組成

2.3 不同IMF含量晉南牛LP中氨基酸組成

由表4可知，苯丙氨酸含量在2組中基本相同，均為0.84%，除苯丙氨酸外，HIF組LP中其余所測氨基酸含量均低于LIF組中對應氨基酸，差異均不顯著(P>0.05)；LIF組氨基酸總量高于HIF組，但差異不顯著(P>0.05)。

表4 不同IMF含量晉南牛背最長肌中氨基酸組成

2.4 晉南牛SREBP1基因的組織表達譜分析

利用實時熒光定量PCR檢測SREBP1基因在晉南牛個體組織中的表達差異，SREBP1基因在所測組織中均有表達(圖1)，其中在LP中的相對表達量較高，且顯著高于其他組織(P<0.05)；在腎臟、肝臟和脂肪組織中次之；在心臟、脾臟中相對表達量均顯著低于其他組織(P<0.05)。

數據柱形標注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.5 不同IMF含量晉南牛不同組織中SREBP1基因的表達水平

通過實時熒光定量PCR法檢測SREBP1基因在HIF組和LIF組中的表達水平(圖2)，結果顯示，在LP中，HIF組SREBP1基因相對表達量極顯著高于LIF組(P<0.01)；在SF中，HIF組SREBP1基因相對表達量略高于LIF組(P=0.052)；在SF和CF中，HIF組SREBP1基因相對表達量極顯著低于LIF組(P<0.01)。

2.6 不同組織中SREBP1基因表達水平與IMF含量的相關性

由表7可知，LP、SF中SREBP1基因相對表達量與IMF含量均呈正相關，其中LP中SREBP1基因相對表達量與IMF含量相關系數為0.987，呈極顯著正相關(P<0.01)；AF、CF中SREBP1基因相對表達量與IMF含量呈極顯著負相關(P<0.01)。

數據柱形標注**表示差異極顯著(P<0.01)。

3 討 論

3.1 不同IMF含量晉南牛屠宰性能及肉品質

本研究中，LIF組IMF含量為4.40%，HIF組IMF含量為12.30%，王小梅等[11]測定紅安格斯牛、中國西門塔爾牛、草原紅牛、夏洛萊牛的LP IMF含量在5.01%～5.34%，張海波[12]測定20月齡西雜閹公牛的IMF含量為4.08%和4.54%，Ueda等[13]測定和牛脂肪含量從4.8%到39.0%不等，說明不同品種肉牛IMF含量相差較大，這與試驗用牛年齡、品種等因素相關，且本試驗結果顯示，相同飼養條件下晉南牛LP IMF含量差異也較大，說明同一品種不同個體之間脂肪的合成、分解代謝也可能大不相同[14-15]。HIF組屠宰率、水分含量、剪切力均低于LIF組，這和毛衍偉等[16]的研究一致。Ueda等[13]認為牛肉水分含量與IMF含量呈負相關是因為脂肪替代了水分。多數研究認為，IMF含量提高，牛肉的剪切力降低[17-18]。本試驗條件下，LIF組的IMF含量為4.45%，剪切力為63.40 N，HIF組的IMF含量為12.40%，剪切力為57.45 N。而Liang等[19]數據中，IMF含量為4.26%時，剪切力為50.62 N，IMF含量為11.52%時，剪切力為40.08 N，雖然剪切力在數據上差異較大，這可能與樣品前處理有關，但其趨勢相同，均隨著IMF含量的增加，剪切力降低。本試驗委托當地牛肉加工企業屠宰，因企業對肉品質和經濟效益等需求，工人在胴體處理時過度修剪脂肪，是導致HIF組的肉牛的屠宰率和胴體重低于LIF組的肉牛最可能的原因。

表7 晉南牛不同組織部位SREBP1基因相對

3.2 不同IMF含量晉南牛LP中脂肪酸、氨基酸組成

脂肪酸沉積過程實質上是脂肪酸酯化為甘油三酯(TG)并沉積為體脂的過程。肉牛可從飼糧中攝取脂肪酸，通過小腸分解為游離脂肪酸，進一步氧化或者形成TG并逐漸沉積到體內[20-21]。也就是說如果機體內脂肪沉積較多，則相應的脂肪酸含量也高。本試驗條件下，HIF組的TFA含量遠遠高于LIF組，這與HIF組IMF含量高于LIF組有關。肌肉中氨基酸受動物品種、年齡等因素的影響[22]，多數人認為氨基酸和肉風味相關，很少有氨基酸和IMF含量之間關系的研究。Ueda等[13]發現，幾乎所有氨基酸和IMF含量均呈顯著負相關，肌肉中脂肪沉積可能降低氨基酸含量，其原因是育肥后期肉牛大量積累脂肪，肌肉生長速度慢，蛋白質合成和降解的速率降低。本研究中無論是所測氨基酸總量，還是各氨基酸含量(除苯丙氨酸含量基本相同外)，HIF組均低于LIF組，與上述結果一致。

3.3 晉南牛SREBP1基因的組織表達特性分析

本研究表明，SREBP1基因在晉南牛不同組織中廣泛表達，且有明顯的組織差異性。人類的研究上發現，SREBP1基因在脂肪組織和肌肉組織中表達量較為豐富，首先在棕色脂肪組織中表達，其次是肝臟、白色脂肪組織和腎臟[23]。本試驗條件下，晉南牛SREBP1基因的組織表達譜與人類基本一致，在LP和脂肪組織、肝臟相對表達量較高，隨之是腎臟，而在心肌和脾臟中相對表達量低。但本研究中SREBP1基因在晉南牛背最長肌中的相對表達量最高，與黃胥萊等[24]的研究不一致，這可能是因為LP中脂肪沉積明顯，而取樣方法與部位的不同導致樣品中脂肪組織含量的不同而影響測定結果。

3.4 不同IMF含量晉南牛LP、脂肪組織中SREBP1基因相對表達量及其與IMF含量的相關性

IMF沉積是脂肪酸合成與分解的綜合反映，受到脂肪酸合成關鍵基因和脂肪酸分解關鍵基因的調控。多項研究表明，SREBP1基因與機體脂肪生成基因的調節有很重要的相關性，SREBP1可以直接激活脂肪酸、膽固醇、TG以及磷脂的生物合成，脂肪代謝過程中的多個基因的表達[25-26]。官久強等[27]經試驗發現犏牛組IMF含量高于牦牛組，而LP中SREBP1基因的相對表達量犏牛組也高于牦牛組。這與本試驗研究結果一致。不同水平IMF含量晉南牛牛群，SF中SREBP1基因相對表達量HIF組略高于LIF組，AF、CF中SREBP1基因相對表達量均為LIF組高于HIF組，這可能是因為不同部位的脂肪組織具有特異性的基因表達模式[28]，也可能是因為IMF含量高的個體，脂肪在內臟生成已經很少，主要在肌肉和皮下，其他原因還有待繼續深入研究與探討。

金世杰等[29]證明肌肉組織中SREBP1基因表達在12～20月齡期間與IMF含量具有正相關性。徐麗[30]對SREBP1基因過表達可增加牛胎兒骨骼肌成纖維細胞內脂肪的合成，本研究中SREBP1基因在LP中的相對表達量與IMF含量呈極顯著正相關，與上述報道一致。這說明通過SREBP1基因表達對脂肪沉積有正向調控作用，對IMF的沉積有一定的積極作用，與SREBP1基因的生理作用一致。

4 結 論

晉南牛SREBP1基因在所測組織中均有表達，且不同個體所測組織中的表達規律基本相同，均以LP中相對表達量最高，脂肪組織中也相對豐富；不同IMF含量晉南牛SREBP1基因表達模式不同，LP中HIF組較高，而AF、CF中LIF組高；SREBP1基因正向調控LP中IMF沉積，可作為影響晉南牛IMF含量的候選基因。