急性冷刺激對斷奶仔豬十二指腸組織結構及核轉錄因子-κB/腸道堿性磷酸酶信號通路的影響

喬新月 高炳南 任雨龍 李金庫 陳 妍 崔一喆 王秋菊

(黑龍江八一農墾大學動物科技學院，大慶 163319)

冷應激給北方或寒區的畜牧業帶來了巨大損失，常導致畜禽幼仔免疫力及抗病能力下降，甚至死亡[1]。腸道是維持機體內環境穩態的先天性屏障。許多環境和生物應激源，包括輻射、熱應激、脂多糖、各種藥物和活性氧均可對腸上皮造成損害[2]。王雪潔等[3]研究發現，熱應激可影響家禽的腸道結構，干擾腸道微微生態的平衡，抑制腸道免疫功能，破壞腸黏膜完整性，從而使家禽的生長和健康受到影響。研究表明，冷應激可引起雞腸道免疫功能的改變，急性和慢性冷應激可導致肉雞小腸中白細胞介素(IL)-2、γ-干擾素(IFN-γ)、IL-4、IL-17和轉化生長因子-β4(TGF-β4)mRNA表達量隨冷刺激時間的延長呈先升高后降低的趨勢[4]。冷應激會促使體內許多生物活性分子參與到機體的調節中。核轉錄因子-κB(NF-κB)是一種快速誘導的轉錄因子，在炎癥、細胞增殖和分化、免疫反應和基因誘導中有廣泛的作用[5]。NF-κB家族中的轉錄因子在細胞的激活、生存和增殖中扮演著關鍵角色。它的異常活動可能導致癌癥、免疫缺陷或自身免疫性疾病[6]。Ye等[7]研究表明小鼠NF-κB亞基p50缺失可改善冷應激誘導的腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、巨噬細胞炎性蛋白-2(MIP-2)和細胞間黏附分子-1(ICAM-1)的表達，從而減少中性粒細胞的積聚和對胃黏膜的損傷。p65通過磷酸化、泛素化等作用對NF-κB進行轉錄激活，在炎癥性疾病中發揮重要作用[8]。研究表明，TNF-α、p65表達量升高可導致結腸通透性增加，進而導致過度炎癥免疫反應的發生[9]。腸道堿性磷酸酶(IAP)是一種經糖基磷脂酰肌醇鍵錨定于腸上皮細胞頂膜上的糖蛋白，在腸黏膜屏障的維護中發揮著重要作用，包括調節十二指腸表面pH、解除脂多糖和游離核苷酸的毒性、抑制腸道炎性反應、調節腸道菌群等[10]。Ferencz等[11]研究發現小腸組織中存在的垂體腺苷酸環化酶激活多肽-38(PACAP-38)在預防腸冷保存損傷中具有關鍵作用，冷應激會破壞PACAP-38缺陷小鼠的黏膜、黏膜下層和隱窩。近年來，冷刺激對腸道影響的研究較多，但急性冷刺激對斷奶仔豬十二指腸NF-κB/IAP信號通路的研究鮮有報道。為了進一步探究冷刺激對斷奶仔豬腸道的影響機制，本研究采用人工氣候室，從腸道形態觀察入手，研究不同冷刺激時間對斷奶仔豬十二指腸形態結構的影響，并檢測十二指腸NF-κB/IAP信號通路關鍵蛋白p65、核轉錄因子抑制蛋白(IκB)、磷酸化IκB(p-IκB)及IAP的表達情況，旨在從分子層面探討急性冷刺激對斷奶仔豬十二指腸損傷的機制，并探究急性冷刺激下NF-κB/IAP信號通路對十二指腸的保護作用，為早期檢測和防治北方寒冷地區仔豬冷刺激腸道疾病提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物

選取16頭體況相近、健康的30日齡“杜×長×大”三元雜交斷奶仔豬，隨機分成4組，每組4個重復，每個重復1頭豬。按照《國家實驗動物飼養管理條例》，在人工智能氣候室內預飼7 d，常規飼養管理，正常飼喂，正常飲水。

1.1.2 主要試劑

RIPA裂解液(強，P0013B)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(P0010S)、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠配制試劑盒(P0012A)、SDS-PAGE 5X蛋白上樣緩沖液(P0015)均購自碧云天公司。β-肌動蛋白(β-actin)免疫印跡所用的一抗鼠抗單克隆抗體(1∶15 000，60008-1-Ig)、NF-κB p65免疫印跡所用的一抗兔抗單克隆抗體(1∶2 000，10745-1-AP)以及IκB-α(1∶2 000，51066-1-AP)、辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠IgG(1∶10 000，SA00001-1)，辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG(1∶10 000，SA00001-2)均購自武漢三鷹生物技術有限公司。p-IκBα(1∶1 000，#2859)購自CST(Cell Signaling Technology)公司。IAP(1∶3 000，ab97532)購自Abcam公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 冷刺激試驗

4組分別為對照組、急性冷刺激2 h組、急性冷刺激6 h組和急性冷刺激12 h組。采用人工氣候室內模擬冬季寒冷氣候，3個急性冷刺激組斷奶仔豬在溫度為(4±2) ℃的人工氣候室中分別飼養2、6、12 h，而對照組斷奶仔豬飼養于溫度為(24±2) ℃的環境中，相對濕度維持在40%～50%。

1.2.2 切片制作及測定

分別在冷刺激0(對照組)、2、6、12 h后將斷奶仔豬在室溫中屠宰，取十二指腸中段，生理鹽水沖洗后，固定于4%甲醛固定液中，制作石蠟切片并進行蘇木精-伊紅(HE)染色，在光鏡下觀察腸組織病理變化，采用圖像分析系統觀測腸道絨毛高度和隱窩深度。

1.2.3 Western-blot法檢測十二指腸NF-κB/IAP信號通路關鍵蛋白表達情況

屠宰后取十二指腸，用冰生理鹽水沖洗干凈，并在十二指腸中段取5 cm樣品裝于1.5 mL離心管中，液氮凍存。液氮速凍后-80 ℃低溫冰箱保存。將十二指腸組織解凍后，用裂解液提取總蛋白，用BCA蛋白濃度試劑盒測定蛋白質濃度，100 ℃煮10 min。SDS-PAGE分離后轉印至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，4 ℃一抗過夜，次日TBST沖洗膜3次，每次10 min，二抗(1∶10 000)室溫孵育1 h，l×TBST沖洗膜3次，顯色液顯色。用ChemiDoc XRS(伯樂)成像系統成像，測定樣品灰度值，Image Lab分析目標條帶的灰度值，并計算目的蛋白的相對表達量。

1.3 數據處理與分析

試驗數據采用SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，結果用平均值±標準差表示，以P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 急性冷刺激對斷奶仔豬十二指腸組織結構的影響

從圖1可見，對照組仔豬十二指腸組織結構完整，絨毛排列緊密，急性冷刺激組腸絨毛出現斷裂和少數上皮細胞變性脫落現象，腸絨毛排列稀疏。表1顯示，3個急性冷刺激組十二指腸絨毛高度、隱窩深度和絨毛高度/隱窩深度均發生了變化。與對照組相比，急性冷刺激2和6 h后，斷奶仔豬十二指腸絨毛高度降低，差異不顯著(P>0.05)；急性冷刺激12 h后，斷奶仔豬十二指腸絨毛高度顯著降低(P<0.05)。與對照組相比，急性冷刺激2、6和12 h后十二指腸隱窩深度及絨毛高度/隱窩深度均下降，但差異不顯著(P>0.05)。

圖1 各組十二指腸組織結構

表1 急性冷刺激對斷奶仔豬十二指腸黏膜形態的影響

2.2 急性冷刺激對斷奶仔豬十二指腸中NF-κB信號通路關鍵蛋白表達的影響

如圖2所示，與對照組相比，急性冷刺激2 h時十二指腸中p65相對表達量升高，但差異不顯著(P>0.05)；急性冷刺激6 h時十二指腸中p65相對表達量基本恢復到冷刺激前(對照組)水平。急性冷刺激12 h時，十二指腸中p65相對表達量與對照組和急性冷刺激6 h時相比顯著升高(P<0.05)。與對照組相比，急性冷刺激2和6 h時十二指腸中IκB相對表達量有增加的趨勢，但差異不顯著(P>0.05)；急性冷刺激12 h時十二指腸中IκB相對表達量與對照組和急性冷刺激2和6 h時相比極顯著增加(P<0.01)。急性冷刺激2和6 h時十二指腸中p-IκB相對表達量與對照組相比略有增加，差異不顯著(P>0.05)；急性冷刺激12 h時十二指腸中p-IκB相對表達量與對照組相比極顯著增加(P<0.01)。上述結果表明急性冷刺激能夠影響斷奶仔豬十二指腸NF-κB信號通路的活化，促進通路蛋白的表達。

數據標注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)。下圖同。

2.3 急性冷刺激對斷奶仔豬十二指腸中IAP表達的影響

如圖3所示，與對照組相比，急性冷刺激2、6和12 h時，十二指腸中IAP相對表達量極顯著升高(P<0.01)。與急性冷刺激2 h時相比，急性冷刺激6和12 h時十二指腸中IAP相對表達量極顯著降低(P<0.01)。與急性冷刺激6 h時相比，急性冷刺激12 h時十二指腸中IAP相對表達量略有升高，差異不顯著(P>0.05)。

圖3 急性冷刺激對斷奶仔豬十二指腸IAP表達的影響

3 討 論

3.1 急性冷刺激對斷奶仔豬十二指腸組織結構的影響

越來越多的流行病學證據表明，異常的環境溫度可增加動物的死亡風險[12]。過強刺激會使機體產生免疫功能改變、胃腸潰瘍等病理現象[13]。有研究表明，長期冷刺激會促使雛雞的十二指腸和腺胃充血，同時經常遭受冷刺激也會導致胃腸道潰瘍等病癥[14]。在急性冷刺激對腸道組織結構影響的研究中，高靜雯等[15]研究表明，冷應激可導致綿羊空腸、回腸和十二指腸的組織結構發生相應的變化，主要表現為回腸絨毛變短變粗。強冷應激會抑制綿羊機體抗炎癥反應及免疫機能的調節。在本研究中發現斷奶仔豬十二指腸絨毛高度、隱窩深度和絨毛高度/隱窩深度均受到了急性冷刺激不同程度的影響。與對照組相比，急性冷刺激6和12 h時，斷奶仔豬十二指腸絨毛高度變短，隱窩深度變淺，且急性冷刺激12 h時斷奶仔豬十二指腸絨毛高度顯著降低，說明急性冷刺激對斷奶仔豬十二指腸組織結構產生了一定的損傷。呂建偉等[16]將小鼠長期置于低溫條件下，結果表明冷刺激會降低其十二指腸腸壁和腸道組織截面積，但顯著增加了絨毛高度。計紅等[17]研究表明，急性冷刺激12 h對大鼠腎臟、胃壁黏膜均有損傷，但十二指腸組織結構沒有明顯變化。上述研究與本試驗研究結果不完全一致，可能是由于動物種屬不同所致。

3.2 急性冷刺激對斷奶仔豬十二指腸NF-κB信號通路的影響

家畜應激與免疫調節之間的平衡對家畜健康和生產力具有重要影響[18]。NF-κB是細胞核內重要的轉錄調節因子，是細胞應激應答、炎癥反應和免疫應答的重要調節者。NF-κB被激活后與IκB解離并易位入核，結合靶基因增強子/啟動子上的κB位點，從而調控靶基因的表達[19]。Shi等[20]研究發現，當小鼠冷暴露2 h后，NF-κB被激活，p65的磷酸化也被激活。Lian等[21]研究表明，妊娠期冷應激可誘發胎盤細胞凋亡，并激活胎盤熱休克蛋白70(HSP70)/Toll樣受體4(TLR4)/NF-κB信號通路，進而影響胎兒胎盤的功能和發育。產前冷應激可促進妊娠母鼠肝臟中p65、HSP70的表達，進而產生炎癥反應[22]。Fu等[23]研究表明，急性和慢性冷應激均可引起鵪鶉十二指腸、空腸和回腸的炎癥反應，在急性和慢性冷應激下空腸、回腸和十二指腸的NF-κBmRNA表達量升高，TNF-α mRNA表達量降低。本試驗結果顯示，在斷奶仔豬十二指腸中，急性冷刺激2 h時，p65、IκB及p-IκB相對表達量與對照組相比略有升高，說明急性冷刺激2 h對斷奶仔豬十二指腸造成了一定損傷，十二指腸產生了炎癥；急性冷刺激6 h時，p65相對表達量基本恢復到冷刺激前水平，說明急性冷刺激使仔豬腸道產生炎癥反應后，機體通過激活全身炎癥反應和內部的抗炎效應來防止過度的炎癥反應，機體通過自身免疫調節使炎癥反應有所恢復；與對照組和急性冷刺激6 h時相比，急性冷刺激12 h時p65、IκB及p-IκB相對表達量均顯著升高。由此可以推斷，急性冷刺激激活NF-κB信號通路，并通過調節NF-κB信號通路對腸道造成一定損傷，之后機體通過自身免疫調節使炎癥反應有所恢復，繼續延長冷刺激時間，則急性冷刺激又重新對十二指腸產生損傷，表明在急性冷刺激時，斷奶仔豬的免疫機能調節及抗炎癥反應等功能均受到抑制。據報道，冷應激與免疫系統及補體系統有關，可導致局部和全身的損傷[24]。

3.3 急性冷刺激對斷奶仔豬十二指腸IAP信號通路的影響

IAP在調節十二指腸表面pH、腸道內細菌脂多糖(LPS)解毒、減少體內LPS毒性、控制腸道炎癥、防止體內細菌跨黏膜通道等方面均具有關鍵作用[25]。研究表明壞死性小腸結腸炎與IAP的表達和活性降低有關。IAP是一種內源性蛋白，已被證明能滅活LPS，最近已成功地作為一種輔助治療成人膿毒癥的藥物[26]。Rentea等[27]研究表明，早期腸內補充IAP可減輕壞死性小腸結腸炎相關性腸道損傷，有助于維持腸上皮屏障功能。早期斷奶仔豬腸道容易受到感染，發生腹瀉，造成生長遲緩，部分原因可能是空腸黏膜IAP的保護作用和功能減弱所致[28]。本試驗結果顯示，急性冷刺激能夠極顯著提高十二指腸中IAP的表達，并且，與急性冷刺激2 h時相比，急性冷刺激6和12 h時十二指腸中IAP相對表達量極顯著降低。IAP是斷奶仔豬腸道健康的促進因子，機體會通過提高IAP的表達進行自身的炎癥調節。與急性冷刺激6 h時相比，急性冷刺激12 h時十二指腸中IAP相對表達量略有升高。由此可以推斷急性冷刺激6 h時機體自身對損傷進行了一定的調節，急性冷刺激12 h時又重新對十二指腸產生了損傷。

4 結 論

急性冷刺激造成了斷奶仔豬十二指腸黏膜結構的損傷，使絨毛高度變短，隱窩深度變淺，這是引起斷奶仔豬消化吸收功能障礙的形態學基礎；急性冷刺激使斷奶仔豬十二指腸中NF-κB/IAP信號通路被激活，上調了p65、IκB、p-IκB和IAP的表達，進而導致斷奶仔豬十二指腸產生一定的炎癥反應。