2，2’-偶氮二(2-脒基丙烷)二鹽酸鹽誘導的氧化應激對豬腸上皮細胞活力及線粒體功能的影響

魯慧杰 張 瑩 田志梅 容 庭 劉志昌 鄧 盾 馬現永，2*

(1.廣東省農業科學院動物科學研究所，畜禽育種國家重點實驗室，農業農村部華南動物營養與飼料重點實驗室，廣東省畜禽育種與營養研究重點實驗室，廣東畜禽肉品質量安全控制與評定工程技術研究中心，廣州 510640；2.嶺南現代農業科學與技術廣東省實驗室茂名分中心，茂名 525000)

腸道系統具有機體最大的黏膜表面，由能夠持續自我更新的單層腸上皮細胞構成，是腸道微環境和黏膜免疫系統之間的屏障，一定程度上保護機體免受腸道內有毒物質和外界環境的傷害[1]。腸黏膜屏障通過腸上皮細胞感受和響應外界刺激，是機體抵御潛在有害微生物和抗原的第一道防線，也是機體應激狀態下最早和最易受到氧化損傷的位點[1-3]。動物生長中面臨的飲食、藥物、病原體、環境變化等應激因素會引起腸道氧化應激，刺激腸上皮細胞和免疫細胞產生大量的活性氧(reactive oxygen species，ROS)和促炎癥介質，破壞腸上皮穩定，導致腸黏膜屏障受損，引發吸收障礙、炎癥性腸病、消化系統退行性疾病甚至是癌癥[4-5]。

研究表明，斷奶、高溫、運輸、病原菌、營養缺乏、飼料污染等諸多應激因素導致動物腸道ROS過度積累，引起腸上皮細胞損傷，腸道通透性增加，破壞腸上皮屏障功能，引發吸收障礙、腹瀉等炎癥性腸病和腸道應激綜合征[6-8]。由斷奶引起的氧化應激反應會延緩仔豬生長，增加胃腸道系統對疾病的易感性，降低仔豬腸道消化酶活性，破壞緊密連接蛋白，損害腸道免疫系統和黏膜屏障功能，導致“斷奶后應激綜合征”[9-10]。Smith等[11]認為仔豬早期斷奶可能會對胃腸道系統產生長期影響，造成腸道黏膜屏障持續性損傷和永久性缺陷。Yu等[12]研究表明，高溫應激導致豬小腸上皮細胞脫落，暴露腸黏膜固有層，改變空腸基因表達模式；超微結構顯示空腸微絨毛變短、細胞線粒體腫脹、腸上皮細胞緊密連接破壞等。在這些生理過程中，腸上皮細胞具有獨特的代謝特性，這些特性由線粒體活性的變化反映出來。線粒體功能是決定細胞命運以及協調細胞代謝、免疫力、應激反應和細胞凋亡的關鍵因素，許多細胞特異性應激反應是響應線粒體功能障礙而引起的[13]。因此，建立穩定的腸上皮細胞氧化損傷模型，闡明氧化損傷對線粒體功能的影響，對于研究動物腸上皮細胞氧化損傷的響應機制、尋找調控氧化損傷的關鍵靶點、測試具有抗氧化活性的藥物具有十分重要的意義。

本研究使用廣泛報道的自由基引發劑2，2’-偶氮二(2-脒基丙烷)二鹽酸鹽(AAPH)作為氧化應激模型的自由基來源。AAPH是一種水溶性偶氮小分子化合物，可以通過誘導細胞氧化損傷引起各種類型的病理變化[14]。AAPH在37 ℃下以已知且恒定的速率持續分解生成1摩爾氮自由基和2摩爾碳自由基，其中碳自由基可以結合生成穩定的產物，也可以與分子氧反應生成過氧自由基(ROO·)[14-15]。其他常用的自由引發劑如過氧化氫(H2O2)的濃度和穩定性具有不可預測性，因其在過渡金屬存在的條件下能夠自發的或者由超氧化物歧化酶(SOD)介導的歧化作用轉化為極端活躍的羥基自由基(HO·)，極易被細胞培養液中存在的抗氧化劑淬滅[15]。因此，這些特性使AAPH相比H2O2而言是更為穩定可靠的自由基來源，更適用于抗氧化作用相關的研究[15-16]。目前，AAPH已被廣泛用作自由基引發劑，用于研究紅細胞、血漿、全血、Hela細胞、各種組織、胚胎甚至動物個體的氧化應激[17]。豬腸上皮細胞(IPEC-J2細胞)來源于初生仔豬空腸的未轉化的豬腸上皮細胞系，保留了豬腸上皮的特性，是研究豬腸道宿主與外界因子相互作用的良好模型[18-20]。本試驗以IPEC-J2細胞為對象，研究AAPH誘導的氧化應激對IPEC-J2細胞活力及線粒體相關功能的影響，旨在建立一種穩定的IPEC-J2細胞氧化損傷模型，有助于研究腸上皮細胞氧化損傷的響應機制和關鍵作用靶點，為生產應用中開發安全、高效的飼用抗氧化劑提供可靠的模型和潛在作用靶點。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

AAPH購于美國Sigma-Aldrich公司；DMEM培養基購于美國Gibco公司；Hank’s平衡鹽溶液(HBSS)、磷酸鹽緩沖液(PBS)(pH=7.2)、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶(0.25%)和雙抗(青霉素-鏈霉素)購于美國Thermo Fisher公司；動物基因組DNA快速抽提試劑盒、ROS檢測試劑盒、BeyoClickTMEdU-488細胞增殖檢測試劑盒、線粒體膜電位檢測試劑盒購于上海碧云天生物技術有限公司；iTap Universal SYBR Green Supermix定量預混液購于美國Bio-Rad公司；細胞計數試劑盒(cell counting kit-8，CCK-8)、細胞增殖-毒性檢測測試劑盒購自上海東仁化學科技有限公司。

1.2 細胞培養

IPEC-J2細胞在含有10% FBS和1%雙抗(青霉素-鏈霉素)的DMEM培養基中，置于37 ℃、5% CO2恒溫培養箱中培養。當細胞生長至85%～90%時進行細胞鋪板或傳代，鋪板前吸取10 μL細胞懸液于細胞計數板中計數。

1.3 指標檢測

1.3.1 細胞活力

將細胞懸液接種在96孔板中，密度為2×104個/孔，邊緣孔加入等體積的PBS，置于恒溫培養箱中培養24 h。觀察細胞生長狀態，用含有不同濃度AAPH的培養基處理細胞，每個處理8個重復。前期預試驗處理時間為0、4、8和24 h，后續正式試驗處理時間為24 h。

處理結束后，更換含有CCK-8溶液的DMEM完全培養基(DMEM∶CCK-8溶液=9∶1)，CO2恒溫培養箱中避光孵育1 h，酶標儀450 nm吸光度(OD)讀數。

1.3.2 細胞增殖

細胞計數后，將細胞懸液接種在24孔板中，密度為2.5×105個/孔，放入培養箱中培養24 h。更換新鮮的用含有不同濃度(0、30、32、34 mmol/L)AAPH的細胞培養基處理細胞24 h，每個處理6個重復。處理結束后，采用BeyoClickTMEdU-488細胞增殖檢測試劑盒檢測IPEC-J2細胞增殖情況，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.3 總ROS含量

采用ROS檢測試劑盒測定總ROS含量。細胞計數后，將細胞懸液接種在96孔板(黑色透明底)中，密度為2×104個/孔，邊緣孔加入等體積的PBS，放入培養箱中培養24 h。更換新鮮的用含有不同濃度(0、30、32、34 mmol/L)AAPH的細胞培養基處理細胞24 h，每個處理10個重復。處理結束后加入無血清DMEM稀釋2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)(終濃度為10 μmol/L)，37 ℃細胞培養箱中孵育20 min。用無血清細胞培養基洗滌細胞3次，充分去除游離的DCFH-DA，多功能酶標儀測定熒光強度，激發波長488 nm，發射波長525 nm。

1.3.4 線粒體膜電位

利用熒光探針JC-1檢測AAPH對線粒體膜電位的影響。用含有不同濃度(0、30、32、34 mmol/L)AAPH的細胞培養基處理細胞24 h后，DMEM洗滌細胞1次，加入JC-1探針(終濃度為5 μmol/L)，細胞培養箱中37 ℃孵育20～30 min。孵育結束后用DMEM洗滌細胞2次，加入新鮮的細胞培養液，熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.3.5 線粒體DNA(mtDNA)拷貝數

細胞計數后，將細胞懸液接種在48孔板中，密度為5×104個/孔，培養箱中培養24 h。更換新鮮的用含有不同濃度(0、30、32、34 mmol/L)AAPH的細胞培養基處理細胞24 h，每個處理8個重復。利用基因組DNA提取試劑盒提取細胞總DNA，熒光定量PCR檢測細胞mtDNA拷貝數。本試驗分別選取mtDNA編碼的基因細胞色素C氧化酶亞基1(COX1)、ATP合酶亞基6(ATPase6)、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶亞基2(ND2)、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶亞基3(ND3)用于定量分析，以保守的單拷貝核基因胰高血糖素(GCG)作為內參基因，定量細胞中mtDNA拷貝數。相關基因引物序列見表1。

表1 相關基因的引物序列

1.3.6 線粒體功能相關基因mRNA表達水平

細胞計數后，將細胞懸液接種在12孔板中，密度為5×105個/孔，培養箱中培養24 h。更換新鮮的用含有不同濃度(0、30、32、34 mmol/L)AAPH的細胞培養基處理細胞24 h后收集細胞提取RNA，每個處理6個重復。

根據Trizol試劑(美國Invitrogen公司)說明書抽提細胞總RNA，NanoDrop測定RNA濃度。根據反轉錄試劑盒M-MLV Reverse Transcriptase Kit(美國Invitrogen公司)說明書合成cDNA模板。利用熒光定量PCR檢測相關基因[線粒體轉錄因子A(TFAM)、線粒體轉錄因子B1(TFB1M)、線粒體轉錄因子B2(TFB2M)、解耦連蛋白1(UCP1)、解耦連蛋白2(UCP2)、解耦連蛋白3(UCP3)]mRNA的表達情況，根據geNorm分析方法從β-肌動蛋白(β-actin)、18S rRNA、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、β2微球蛋白(B2M)、次黃嘌呤磷酸核糖基轉移酶1(HPRT1)、核糖體蛋白L4(RPL4)和TATA結合蛋白(TBP)中選擇最為適當的3個基因作為本項目中定量結果分析的內參基因。相關基因引物序列見表1。

1.4 數據分析

試驗數據采用SPSS 24.0統計軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)和Tukey多重比較，數據用平均值±標準誤(mean±SE)表示，P<0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 不同濃度AAPH對IPEC-J2細胞活力的影響

由圖1-A可以看出，與對照組(0 mmol/L AAPH處理)相比，當處理時間為4和8 h時，較低濃度(30、50、100 mmol/L)的AAPH處理對IPEC-J2細胞活力沒有顯著影響(P>0.05)；200 mmol/L AAPH處理8 h顯著降低IPEC-J2細胞活力(P<0.05)；400 mmol/L AAPH處理4和8 h均顯著降低IPEC-J2細胞活力(P<0.05)；當處理時間為24 h時，不同濃度(30、50、100、200、400 mmol/L)的AAPH處理均顯著降低IPEC-J2細胞活力(P<0.05)。

由圖1-B可以看出，與對照組相比，26 mmol/L AAPH處理24 h時，IPEC-J2細胞活力顯著升高(P<0.05)；28 mmol/L AAPH處理24 h時對IPEC-J2細胞活力沒有顯著影響(P>0.05；30 mmol/L AAPH處理24 h時，IPEC-J2細胞活力在40%～70%，顯著降低(P<0.05)；32、34、36和38 mmol/L AAPH處理24 h時，細胞活力均低于50%，顯著降低(P<0.05)。因此，后續研究中AAPH的處理時間為24 h，處理濃度為0、30、32和34 mmol/L。由以上結果可知，低濃度AAPH和(或)短時間處理，IPEC-J2細胞活力不受影響或一定程度上增加；而當AAPH濃度超過一定濃度閾值后，IPEC-J2細胞活力呈現劑量依賴性下降趨勢，且與對照組相比均顯著降低。

***表示與對照組相比差異顯著(P<0.05)。數據柱形標注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下圖同。

2.2 不同濃度AAPH對IPEC-J2細胞增殖的影響

由圖2-A可以看出，與對照組相比，不同濃度AAPH處理IPEC-J2細胞后，視野內增殖細胞[5-乙炔基-2’-脫氧尿嘧啶核苷(EdU)染色]數量明顯減少。由圖2-B可以看出，在6個隨機選擇的區域中計算細胞增殖的數量，不同濃度的AAPH處理均顯著抑制IPEC-J2細胞增殖(P<0.05)。

圖2 不同濃度AAPH對IPEC-J2細胞增殖的影響

2.3 不同濃度AAPH對IPEC-J2細胞線粒體功能的影響

不同濃度AAPH處理IPEC-J2細胞后，JC-1染色檢測線粒體膜電位的變化，紅色熒光的喪失和胞質中綠色熒光的增加表示線粒體膜電位的破壞。由圖3-A可以看出，未經處理的IPEC-J2細胞顯示線粒體極化良好，顯示為紅色熒光點狀染色，而用不同濃度AAPH處理的IPEC-J2細胞染色逐漸被擴散綠色熒光取代，表明線粒體膜電位降低[21]。

A：線粒體膜電位；B：活性氧生成。

此外，由圖3-B可以看出，與對照組相比，不同濃度AAPH處理IPEC-J2細胞后，總ROS含量顯著增加(P<0.05)，且與AAPH濃度成正比。

2.4 不同濃度AAPH對IPEC-J2細胞mtDNA拷貝數的影響

試驗選取了4個線粒體基因(COX1、ATPase6、ND2和ND3)，檢測不同濃度AAPH處理對IPEC-J2細胞mtDNA拷貝數的影響。由圖4可以看出，與對照組相比，不同濃度AAPH處理后IPEC-J2細胞mtDNA拷貝數均顯著降低(P<0.05)，且呈現出劑量依賴效應。

圖4 不同濃度AAPH對IPEC-J2細胞mtDNA拷貝數的影響

2.5 不同濃度AAPH對IPEC-J2細胞線粒體生物合成相關基因mRNA表達的影響

由圖5可以看出，不同濃度AAPH處理IPEC-J2細胞后，顯著抑制了線粒體轉錄因子TFAM、TFB1M和TFB2M的mRNA表達水平(P<0.05)，其中TFB1M的mRNA表達水平下降趨勢較小。此外，不同濃度AAPH處理IPEC-J2細胞后，顯著抑制了UCP1和UCP3的mRNA表達水平(P<0.05)，而對UCP2的mRNA表達水平沒有顯著影響(P>0.05)。

圖5 不同濃度AAPH對IPEC-J2細胞線粒體生物合成相關基因mRNA表達的影響

3 討 論

腸上皮是一個多細胞界面，是腸道微環境和黏膜免疫系統之間的屏障，同時支持營養素、水和廢物的矢量運輸[22]。已有的研究表明，腸上皮功能受損與腸道和全身性許多疾病狀態相關，受損的上皮可能在特定的胃腸道疾病中具有致病作用[22]。在生理或病理過程中，腸上皮細胞最早感受和響應外界刺激，在應激狀態下最易受到氧化損傷[1-3]。腸上皮細胞具有獨特的代謝特性，這由線粒體活性的變化反映出來。線粒體功能已成為決定細胞命運以及協調細胞代謝、免疫力、應激反應和細胞凋亡的關鍵因素，線粒體功能的改變與炎性腸病、結直腸癌等疾病的生理和病理過程密切相關[23]。因此，本研究采用自由基引發劑AAPH刺激IPEC-J2細胞，檢測線粒體功能相關指標變化，建立腸上皮細胞氧化損傷模型。

本研究結果顯示，不同濃度(30、32、34 mmol/L)AAPH長時間刺激導致IPEC-J2細胞活力顯著下降。值得注意的是，低濃度AAPH和(或)短時間刺激在一定程度上提高了細胞活力，這一現象可能與ROS在細胞命運中的雙重作用有關。已有的證據表明，短暫、低濃度的ROS爆發在生理上是有益的，而持續的高ROS含量則與病理進程有關[24]。為了進一步驗證AAPH誘導的氧化應激對細胞增殖的影響，試驗通過熒光標記物EdU檢測了細胞增殖的情況，結果表明不同濃度AAPH處理均顯著抑制IPEC-J2細胞增殖。

線粒體作為ROS產生的主要場所，極易受到壓力和應激引起的氧化損傷，線粒體應激導致線粒體ROS(mROS)產生改變或線粒體膜電位喪失，從而引起不同的應激信號[24]。研究表明，細胞暴露在應激或風險因子(低氧、高糖、高膽固醇、感染、化學致癌物、電離輻射等)中會引起線粒體膜電位崩潰，導致線粒體產生過量的ROS[25-26]。本試驗結果顯示，不同濃度AAPH處理的IPEC-J2細胞線粒體膜電位降低，細胞中總ROS含量顯著增加。類似的，在人角質形成細胞(HaCaT)中，AAPH處理顯著增加細胞內ROS含量，降低線粒體膜電位[15,27]。

在許多損害呼吸鏈的病理條件下，mROS的產生顯著增強，mtDNA位于呼吸鏈附近，對氧化損傷的敏感性高于核DNA(nDNA)，因而它比nDNA受到的氧化損傷更大[28]。在持續的氧化應激條件下，可能最終導致mtDNA耗竭，因此mtDNA是線粒體功能障礙的生物標記之一[29-30]。本研究的結果也表明，不同濃度AAPH處理均導致IPEC-J2細胞中mtDNA拷貝數顯著降低。有趣的是，癌細胞中mtDNA拷貝數的變化是異常調節的，與氧化應激增加有關，但可能顯示增加或減少，具體取決于癌癥類型、組織和疾病階段[29]。

線粒體的含量對細胞功能至關重要，取決于線粒體生物發生與線粒體之間的平衡，在細胞中受到嚴格調節[26]。新的線粒體形成受多種轉錄因子調控，包括TFAM和線粒體轉錄因子B(TFBMs)[26]。TFAM轉錄的上調通常與mtDNA拷貝數的增加同時出現，這表明TFAM將核轉錄反應與mtDNA拷貝數聯系起來，從而協調了2個基因組之間的線粒體生物發生[31]。類似地，本試驗結果也顯示，不同濃度AAPH處理均顯著抑制TFAM和TFBMs的表達，與此同時mtDNA拷貝數顯著降低。

此外，線粒體定位蛋白家族中的解偶聯蛋白(UCPs)參與ROS產生的控制，UCPs通常會限制mROS的產生進而保護細胞免受氧化應激[26]。在內皮細胞(EC)中，UCP1過表達抑制mROS的產生，并且人主動脈EC中UCP2的過表達阻斷了脂肪酸誘導的mROS的產生[32-33]。UCP2上調也可改善高血糖引起的內皮功能障礙[26,34]。Cadenas等[35]發現，心臟中表達的UCP1同源物UCP2和UCP3通過減少ROS的產生來保護線粒體的氧化損傷。肌細胞中適度的UCP3過表達抑制了ROS的產生并增加了脂肪酸的氧化[36]。本試驗結果顯示，AAPH處理顯著抑制IPEC-J2細胞中UCP1和UCP3的表達，對UCP2的表達沒有顯著影響。值得注意的是，與UCP1和UCP3不同，UCP2在AAPH誘導下的表達水平略有上升。此前也有報道顯示患有慢性高血糖癥的病人中UCP2的表達增加以及UCP3的表達減少可能會導致葡萄糖刺激的胰島素分泌受損，表明UCP2和UCP3在調節β細胞功能中可能具有不同的作用[37]。這些結果提示我們UCP2在腸上皮細胞氧化應激響應中可能具有不同的調控機制和作用。

本研究揭示了ROS介導的線粒體應激可能是IPEC-J2細胞響應氧化損傷的潛在機制之一(圖6)。通過一系列試驗評估IPEC-J2細胞氧化損傷，建立了AAPH誘導的腸上皮細胞氧化應激模型，為進一步深入研究氧化應激對動物腸道健康影響提供了方便且穩定的體外模型，為開發安全、高效的飼用抗氧化劑提供了潛在的作用靶點。

AAPH：2，2’-偶氮二(2-脒基丙烷)二鹽酸鹽 2,2-azobis (2-amidinopropane) dihydrochloride；ROS：活性氧 reactive oxygen species；mROS：線粒體活性氧 mitochondrion reactive oxygen species；mtDNA：線粒體DNA mitochondrion DNA；ΔΨm：線粒體膜電位 mitochondrial membrane potential；TFAM：線粒體轉錄因子A mitochondrial transcription factor A：TFBMs：線粒體轉錄因子B mitochondrial transcription factor B；UCP1/3：解偶聯蛋白 uncoupling protein 1/3。↑：上升 increase；↓：下降 decrease。

4 結 論

① 在AAPH誘導的氧化應激中，IPEC-J2細胞活力下降，細胞增殖受到抑制，細胞內ROS含量升高，細胞線粒體膜電位降低，mtDNA拷貝數降低，線粒體生物合成相關基因表達受到抑制。

② 綜合考慮各項指標，可采用30 mmol/L AAPH刺激IPEC-J2細胞24 h建立豬腸上皮細胞氧化損傷模型。