驢小肽轉運載體1基因的克隆、序列分析及組織表達研究

周苗苗 劉桂芹 劉文強 朱明霞 王長法

(聊城大學農(nóng)學院毛驢高效繁育與生態(tài)飼養(yǎng)研究院，聊城 252000)

蛋白質是動物必不可少的營養(yǎng)元素，飼糧蛋白質在動物體內水解為氨基酸(amino acids,AA)或小肽后被腸道吸收。其中，小肽(二肽和三肽)是動物攝取蛋白質的主要形式[1]。小肽的吸收利用在動物營養(yǎng)物質代謝和動物健康方面有重要意義。腸道小肽的吸收主要依賴小肽轉運載體1(oligopeptide transporter 1,PepT1)。PepT1是一種低親和力、高容量的膜轉運蛋白，屬于質子偶聯(lián)寡肽轉運體(proton-coupled oligopeptide transporter,POT)家族，在質子電化學梯度的驅動下，能跨膜轉運寡肽和肽類藥物[2-4]。PepT1主要在小腸中表達，此外，在大腸[5-6]、瓣胃和瘤胃[7]、腎臟和肝臟[5,8]、胰腺[9]、性腺[5,10]中亦有表達。PepT1可以轉運數(shù)千種寡肽和多種肽結構類似藥物，如氨基頭孢菌素、血管緊張素轉化酶抑制劑以及抗病毒和抗腫瘤藥物[11-12]。PepT1的表達和功能已在人類[13-14]、兔[8,15]、大鼠[16]、小鼠[17]、豬[18]、雞[19]、牛[20-21]、綿羊[22]、牦牛[23]、斑馬魚[10]、大西洋鱈魚[24]、大西洋鮭魚[25]和雙髻鯊[9]等多種動物中進行了研究。眾多研究表明，PepT1在物種間高度保守，PepT1蛋白由大約708個AA殘基組成，有12個跨膜區(qū)(transmembrane domains,TMD)，且在TMD 9和TMD 10之間有1個大的細胞外環(huán)[13,16-18,21-22]。目前關于PepT1功能的研究主要集中在擬肽類藥物轉運以及胃腸道生理病理學等方面[2,11-12,26]。此外，PepT1的生物活性受底物、激素、年齡和生理條件等多種因素的調節(jié)[6,27-28]。PepT1在動物的生長和代謝中起著重要的生理作用。然而，PepT1在驢中的表達和功能研究還未見報道。因此，本試驗擬研究驢(Equusasinus)PepT1(ePepT1)基因的克隆、序列分析及組織表達，以期為進一步研究驢的營養(yǎng)物質轉運提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 總RNA的提取和全長cDNA克隆

表1 試驗中所用引物

表2 PCR反應體系

1.2 ePepT1的AA序列和系統(tǒng)發(fā)育分析

用ORF Finder推導AA序列(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi)；利用計算機pI/Mw工具(ExPASy Proteomics Server; https://web.expasy.org/compute_pi/)預測ePepT1蛋白的分子質量和理論等電點(theoretical isoelectric point, pI)；利用在線軟件(http://scratch. proteomics. ics. uci. edu/)預測ePepT1蛋白質的二級結構；利用生物序列分析(Lyngby TMHMM Server; http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)預測ePepT1的跨膜區(qū)；利用NetNglyc和NetPhos服務器(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/; http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)預測潛在的N糖基化、蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)和蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)位點的AA序列；利用MEGA7構建系統(tǒng)進化樹[29]。

1.3 實時熒光定量PCR

1.4 統(tǒng)計分析

本研究所有數(shù)據(jù)用SAS 9.2進行分析，多組數(shù)據(jù)間采用單因素方差分析，數(shù)據(jù)用柱狀圖表示，誤差線為標準差。當P<0.05時認為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 ePepT1的AA序列和系統(tǒng)發(fā)育分析

PCR特異性擴增ePepT1基因，然后將PCR擴增產(chǎn)物進行電泳檢測并切膠回收。目的基因的PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳后可見一條約2 000 bp大小的條帶(圖1)。經(jīng)測序驗證，成功擴增ePepT1基因。序列分析表明，ePepT1的開放閱讀框為2 124 bp，可編碼707個AA殘基組成的多肽鏈，該蛋白分子質量為78.6 ku，等電點為7.52。ePepT1的AA序列與馬(99.15%)、羊駝(86.58%)、山羊(86.28%)、牛(86.14%)、綿羊(85.43%)、豬(84.60%)、人類(83.47%)、狗(83.36%)、小鼠(83.36%)和大鼠(82.82%)的PepT1的AA序列高度保守。對ePepT1蛋白進行預測得出，二級結構中α-螺旋(Hh)占32.39%，β-折疊(Ee)占27.58%，β-轉角(Tt)占9.76%，無規(guī)則卷曲(Cc)占30.27%。親水性和疏水性分析預測ePepT1有11個潛在的TMD，且在TMD 9和TMD 10之間有1個大的細胞外環(huán)(圖2)。如圖3所示，ePepT1的AA序列中有5個胞外N-糖基化位點(Asn50、Asn438、Asn508、Asn530、Asn541)，5個胞外PKC作用位點(Ser8、Ser249、Ser252、Thr356、Ser357)和3個PKA作用位點(Ser8、Ser29、Ser275)(圖3)。根據(jù)不同動物PepT1的AA序列構建的系統(tǒng)進化樹如圖4所示。

1：DL15 000標記物; 2和3：ePepT1擴增產(chǎn)物。

橫軸：氨基酸序數(shù)；縱軸：疏水系數(shù)。

N-glyc:N糖基化位點 glycosylation site；PKA:蛋白激酶A protein kinase A;PKC：蛋白激酶C protein kinase C。

圖4 基于不同動物PepT1的氨基酸序列的系統(tǒng)進化樹

2.2 ePepT1基因的組織表達

以GAPDH做內參基因，分別檢測了ePepT1基因在驢腎臟、脾臟、心臟、肝臟、肺臟、胃、十二指腸、空腸、回腸組織中的表達。結果顯示，ePepT1在組織中廣泛表達，其在腸道(十二指腸、空腸和回腸)和肺臟中的相對表達量較高，顯著高于腎臟、脾臟、胃、心臟、肝臟(P<0.05，圖5)。

數(shù)據(jù)柱標注不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

3 討 論

PepT1在從細菌到人類的不同物種中高度保守[31]。本研究發(fā)現(xiàn)，ePepT1 cDNA開放閱讀框為2 124 bp，可以編碼由707個AA殘基組成、分子質量為78.6 ku的多肽鏈。ePepT1蛋白大小與馬、綿羊和牛(707個AA殘基)[21-22]相同，但比人類和豬(708個AA殘基)[13,18]、小鼠(709個AA殘基)[17]以及大鼠(710個AA殘基)[16]小。疏水性分析預測ePepT1有11個潛在的TMD，這與奧奈達希瓦氏菌(Shewanellaoneidensis)(TMD 14)[32]和其他哺乳動物如人和牛(TMD 12)不同[13,21]。同其他物種一樣，ePepT1蛋白在TMD 9和TMD 10之間有1個大的細胞外環(huán)。此外，ePepT1蛋白TMD 9和TMD 10之間的胞外環(huán)上有5個推測的N-糖基化位點(Asn50、Asn438、Asn508、Asn530、Asn541)。N-糖基化對寡肽轉運蛋白的表達、穩(wěn)定性和底物轉運至關重要[33-35]。Chan等[34]研究結果顯示，人PepT1的TMD 9和TMD 10之間的胞外環(huán)中所有的天冬酰胺殘基(asparagine, Asn)都可以被N-糖基化修飾，且N-糖基化位點的突變可以降低PepT1對甘氨酰肌氨酸(Gly-Sar)轉運的Vmax值。Wang等[35]研究亦發(fā)現(xiàn)牛PepT2的轉運功能受N-糖基化的影響。此外，ePepT1蛋白還具有5個胞外PKC作用位點(Ser8、Ser249、Ser252、Thr356、Ser357)和3個PKA作用位點(Ser8、Ser29、Ser275)。據(jù)報道，PKA和PKC可以通過調節(jié)葡萄糖轉運蛋白2(GLUT2)和小肽轉運蛋白PepT1來改變營養(yǎng)素的攝取[36]。其他研究亦證明小肽轉運蛋白的轉運功能受PKC磷酸化的調控[22,37-38]。這些磷酸化位點可能在PKC和PKA調節(jié)ePepT1的轉運功能中發(fā)揮重要作用。

研究發(fā)現(xiàn)PepT1主要在腸道中表達，其組織分布規(guī)律不同于PepT2(主要在腎臟中表達)[39]。眾多研究表明，PepT1在動物消化道中廣泛表達，且在十二指腸、空腸和回腸中表達量最高[5-6,9,24]。此外，PepT1的表達受生理狀態(tài)，如發(fā)育時期、營養(yǎng)狀況和疾病狀態(tài)等多種因素的調控[6,28,40-41]。很多研究發(fā)現(xiàn)，5/6腎臟切除、小肽、甲狀腺激素等均可增加PepT1的基因豐度[5,27]。本試驗中，ePepT1基因在驢腎臟、脾臟、心臟、肝臟、肺臟、胃、十二指腸、空腸、回腸組織中均有表達，且在腸道(十二指腸、空腸和回腸)中的相對表達量顯著高于其他組織，其組織表達規(guī)律與以往研究結果一致。PepT1在動物體內的組織分布與其生理功能相適應，PepT1主要在消化道小肽結合氨基酸的攝取中發(fā)揮重要作用[7,18,21]。畜禽可通過調節(jié)PepT1的表達來改變機體對小肽的攝取，以滿足不同生長階段對營養(yǎng)物質的需求。本研究結果提示，ePepT1在驢腸道小肽類營養(yǎng)物質的吸收中發(fā)揮重要生理作用。ePepT1的表達調控及其在驢營養(yǎng)物質代謝中的具體作用仍需進一步研究。

4 結 論

① 本試驗成功擴增出ePepT1基因，序列分析表明ePepT1的開放閱讀框為2 124 bp，可編碼707個AA殘基組成的多肽鏈。

② 研究證實ePepT1基因在驢各組織中普遍表達，且在十二指腸、空腸和回腸中高表達。