植物乳桿菌抑制產腸毒素型大腸桿菌誘發豬腸上皮細胞炎癥反應的分子機制

李海花 梁東梅 喬家運*

(1.天津農學院動物科學與動物醫學學院，天津市農業動物繁育與健康養殖重點實驗室，天津 300384；2.天津師范大學生命科學學院，天津市動物多樣性保護與利用重點實驗室，天津 300387)

仔豬早期斷奶是提高養豬生產效率常用的手段，但早期斷奶容易造成仔豬胃腸功能紊亂，使得細菌性腹瀉如大腸桿菌病經常發生，因此在實際生產中常在飼糧中添加抗生素來預防仔豬腹瀉[1]。根據我國農業農村部2016年發布的數據顯示，我國新生仔豬8.79億頭，其中大約有1.52億頭死于斷奶后腹瀉，導致損失高達240億元，這給養豬業造成了巨大的經濟損失[2]。當前，“禁抗令”已正式生效，原本利用抗生素預防腹瀉的措施已禁止使用，因此，尋找抗生素替代品保護仔豬腸道健康顯得尤為急迫和重要。乳酸菌具有調節腸道菌群平衡、預防仔豬腹瀉、提高腸道健康的作用，已經作為一種安全的飼料添加劑被廣泛應用。Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)和NOD樣受體(NOD-like receptor，NLR)是識別各種入侵病原體的模式識別受體，在先天免疫反應中起著關鍵作用[3]。TLR或NLR識別病原微生物后，通過上游信號級聯反應，激活絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)和核轉錄因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)等關鍵蛋白，從而調控下游促炎性細胞因子如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素-8(interleukin-8，IL-8)和白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)的生成，進而引起機體的炎癥反應和細胞損傷[4]。乳酸菌具有抑制產腸毒素型大腸桿菌(enterotoxigenicEscherichiacoli，ETEC)引起的腸上皮細胞炎癥反應的作用[5]，然而其分子機制尚不是十分清楚。因此，本研究利用ETEC誘導的豬腸上皮細胞炎癥反應模型，研究植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)對MAPK和NF-κB信號通路關鍵蛋白的調控作用，揭示植物乳桿菌調節豬腸上皮炎癥反應的分子機制，為其在仔豬飼糧中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗細胞和菌株

豬腸上皮細胞IPEC-J2購自上海冠導生物工程有限公司；ETEC K88和植物乳桿菌均為天津農學院動物醫學與動物科學學院實驗室保存。

1.2 試驗試劑

RPMI 1640基礎培養液、胎牛血清和二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)等常用細胞培養相關試劑均購自美國Gibco公司，豬IL-1β、IL-8和TNF-α檢測試劑盒均購自美國BD公司，豬乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase，LDH)檢測試劑盒購自上海酶聯生物科技有限公司，DNA和RNA核酸萃取試劑盒、反轉錄試劑盒和實時熒光定量PCR試劑盒均購買于美國GeneCpoeia公司，p38 MAPK抑制劑(SB-203580)、NF-κB p65抑制劑(BAY11-7082)和細胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)MAPK抑制劑(SCH772984)購自美國MCE公司，抗閉合小環蛋白(zonula occludens，ZO)-1抗體和抗閉鎖蛋白(occludin)抗體均購自Abcam公司，抗ERK MAPK抗體、抗磷酸化ERK-MAPK抗體、抗NF-κB p65抗體、抗磷酸化NF-κB p65抗體、抗p38 MAPK抗體、抗磷酸化p38 MAPK抗體和抗3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體均自美國CST公司。

1.3 促炎性細胞因子的檢測

在本試驗開始前，首先對植物乳桿菌使用的最佳劑量進行篩選，利用感染復數(multiplicity of infection,MOI)分別為0、1、10、30和100的植物乳桿菌作用IPEC-J2細胞3 h，檢測培養上清液中IL-1β、IL-8和TNF-α的含量、細胞的形態變化以及植物乳桿菌黏附細胞的數量，依據細胞形態正常、無炎癥反應和植物乳桿菌黏附細胞數量等因素確定植物乳桿菌的最佳使用劑量為MOI=30。

試驗設以下處理：空白對照組(不進行處理)、ETEC組(ETEC刺激細胞)、植物乳桿菌+ETEC組(按順序使用植物乳桿菌、ETEC刺激細胞)。 將IPEC-J2細胞接種于24孔培養板，用含10%胎牛血清和1%青鏈霉素的RPMI 1640培養液，在37 ℃和5% CO2條件下培養，待細胞融合度達到80%時，加入植物乳桿菌(MOI=30)預作用細胞3 h，在ETEC(1×103CFU/mL)分別作用IPEC-J2細胞3、6、12和24 h后，收集培養上清液，經3 000 r/min離心20 min后，按照IL-1β、IL-8和TNF-α檢測試劑盒說明書進行上清液中促炎性細胞因子含量的檢測。

1.4 TLR和NLR表達的測定

將IPEC-J2細胞接種于24孔培養板，待細胞融合度達到80%時，加入植物乳桿菌預作用細胞3 h，再用ETEC分別刺激細胞3、6、12和24 h，同時設立未處理的空白對照組和ETEC組，收集細胞。采用實時熒光定量PCR檢測TLR2、TLR4、NLRP3、NLRP6和GAPDHmRNA相對表達量。相關引物設計、RNA提取及反轉錄、實時熒光定量PCR反應條件和相對定量法2-△△Ct法的計算參照Qiao等[6]的方法。

1.5 Western blot檢測細胞中靶蛋白的表達

將IPEC-J2細胞接種于培養皿，待細胞融合度達到80%時，加入植物乳桿菌預作用細胞3 h，再用ETEC分別刺激細胞1、3、6和24 h，同時設立未處理的空白對照組和ETEC組，收集細胞。根據Qiao等[6]的Western blot檢測方法，測定靶蛋白ZO-1和occludin的表達量以及NF-κB p65、ERK MAPK和p38 MAPK的磷酸化水平，同時檢測內參GAPDH的表達量。用Gel-Pro analyzer軟件分析各組上述蛋白條帶濃度，并進行相對定量分析。

1.6 抑制劑處理細胞及其樣品檢測

將IPEC-J2細胞接種于24孔培養板，待細胞融合度達到80%時，分別用10 μmol/L的抑制劑SB-203580、SCH772984和BAY11-7082處理細胞1 h，置換培養液，加入植物乳桿菌處理細胞3 h，再用ETEC分別處理細胞24 h，分別收集培養上清液、細胞和凋亡小體。試驗設以下處理：空白對照組(不進行處理)、ETEC組(ETEC刺激細胞)、抑制劑+ETEC組(按順序用抑制劑、ETEC刺激細胞)、植物乳桿菌+ETEC組(按順序使用植物乳桿菌、ETEC刺激細胞)和抑制劑+植物乳桿菌+ETEC組(按順序使用抑制劑、植物乳桿菌、ETEC刺激細胞)。按照LDH試劑盒說明書進行上清液、凋亡小體和貼壁細胞中LDH活性的檢測。細胞的損傷程度根據公式來評估，細胞毒性(%)=培養上清液中LDH活性/總LDH活性。IL-1β、IL-8和TNF-α含量的檢測方法同上。

1.7 數據統計分析

利用Excel 2007對試驗數據進行初步處理，采用SPSS 20.0軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，采用LSD法進行多重比較，采用GraphPad Prism 5軟件進行圖像處理及分析，試驗結果用“平均值±標準差”表示，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 植物乳桿菌對ETEC感染的豬腸上皮細胞產生促炎性細胞因子的影響

由表1可知，與空白對照組相比，ETEC組IL-1β、IL-8和TNF-α含量在6、12和24 h顯著或極顯著升高(P<0.05或P<0.01)，TNF-α含量在3 h極顯著升高(P<0.01)，而IL-1β和IL-8含量在3 h均無顯著變化(P>0.05)。與ETEC組相比，植物乳桿菌+ETEC組IL-1β含量在12和24 h極顯著降低(P<0.01)，在3和6 h均無顯著差異(P>0.05)，IL-8和TNF-α含量在24 h均極顯著降低(P<0.01)。結果表明，ETEC感染促進豬腸上皮細胞產生促炎性細胞因子，植物乳桿菌能夠降低ETEC誘導的促炎性細胞因子的含量。

表1 植物乳桿菌對ETEC感染的豬腸上皮細胞產生促炎性細胞因子的影響

續表1項目 Items空白對照組 Blank control groupETEC組 ETEC group植物乳桿菌+ETEC組 Lactobacillus plantarum+ETEC group12 h44.58±1.97Aa89.27±4.51Bb83.15±3.04Bb24 h43.71±1.11A145.66±11.78B101.24±4.46C

2.2 植物乳桿菌對ETEC感染的豬腸上皮細胞TLR和NLR表達的影響

由表2可知，與空白對照組相比，ETEC組TLR2、TLR4、NLRP3和NLRP6 mRNA相對表達量在6、12和24 h顯著或極顯著升高(P<0.05或P<0.01)，TLR4和NLRP3 mRNA相對表達量在3 h均極顯著升高(P<0.01)。與ETEC組相比，植物乳桿菌+ETEC組TLR2 mRNA相對表達量在3和6 h均極顯著升高(P<0.01)，且在24 h極顯著降低(P<0.01)；TLR4 mRNA相對表達量在6和12 h均極顯著升高(P<0.01)，NLRP3和NLRP6 mRNA相對表達量在3和6 h顯著或極顯著升高(P<0.05或P<0.01)，且NLRP3 mRNA相對表達量在12和24 h均極顯著降低(P<0.01)。結果表明，ETEC感染促進豬腸上皮細胞表達TLR2、TLR4、NLRP3和NLRP6；植物乳桿菌能夠在ETEC感染前期促進ETEC感染細胞表達微生物識別受體，在感染后期能夠降低ETEC誘導的受體表達。

表2 植物乳桿菌對ETEC感染的豬腸上皮細胞TLR和NLR表達的影響

2.3 植物乳桿菌對ETEC感染的豬腸上皮細胞中MAPK和NF-κB磷酸化的影響

由圖1可知，與空白對照組相比，ETEC組ERK-MAPK磷酸化水平在3 h顯著升高(P<0.05)，在6 h極顯著降低(P<0.01)；p38 MAPK磷酸化水平在3 h極顯著升高(P<0.01)，在1和6 h均無顯著變化(P>0.05)；NF-κB p65磷酸化水平在1、3和6 h顯著或極顯著升高(P<0.05或P<0.01)。與ETEC組相比，植物乳桿菌+ETEC組ERK-MAPK磷酸化水平在1和3 h顯著或極顯著升高(P<0.05或P<0.01)，在6 h無顯著變化(P>0.05)；p38 MAPK和NF-κB p65磷酸化水平在3和6 h均極顯著降低(P<0.01)，在1 h無顯著變化(P>0.05)。結果表明，ETEC感染引起細胞中ERK-MAPK、p38 MAPK和NF-κB p65磷酸化水平升高，植物乳桿菌不僅能降低ETEC誘導的p38 MAPK和NF-κB p65的磷酸化水平，還可提高ETEC誘導的ERK-MAPK的磷酸化水平。

ERK-MAPK：細胞外信號調節激酶-絲裂原活化蛋白激酶 extracellular signal-regulated kinase-mitogen activated protein kinase；p-ERK MAPK：磷酸化細胞外信號調節激酶-絲裂原活化蛋白激酶 phospho-extracellular signal-regulated kinase-mitogen activated protein kinase；p38 MAPK：p38絲裂原活化蛋白激酶 p38 mitogen activated protein kinase；p-p38 MAPK：磷酸化p38絲裂原活化蛋白激酶 phospho-p38 mitogen activated protein kinase；NF-κB p65：核轉錄因子-κB p65 nuclear factor-κB p65；p-NF-κB p65：磷酸化核轉錄因子-κB p65 phospho-nuclear factor-κB p65；GAPDH：3-磷酸甘油醛脫氫酶 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase；p-GAPDH：磷酸化3-磷酸甘油醛脫氫酶 phospho-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase；ETEC：產腸毒素型大腸桿菌 enterotoxigenic Escherichia coli；LP：植物乳桿菌 Lactobacillus plantarum。

2.4 植物乳桿菌對ETEC感染的豬腸上皮細胞中緊密連接蛋白表達的影響

由圖2可知，與空白對照組相比，ETEC組ZO-1和occludin的表達量在6和24 h均極顯著降低(P<0.01)；與ETEC組相比，植物乳桿菌+ETEC組ZO-1和occludin的表達量在6和24 h顯著或極顯著升高(P<0.05或P<0.01)。結果表明，ETEC感染能夠引起豬腸上皮細胞中緊密連接蛋白ZO-1和occludin表達量下降，但是植物乳桿菌能夠逆轉ETEC造成的緊密連接蛋白表達下降。

ZO-1：閉合小環蛋白-1 zonula occludens-1；Occludin：閉鎖蛋白；GAPDH：3-磷酸甘油醛脫氫酶 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase；ETEC：產腸毒素型大腸桿菌 enterotoxigenic Escherichia coli；LP：植物乳桿菌 Lactobacillus plantarum。

2.5 靶蛋白在植物乳桿菌調控豬腸上皮細胞產生促炎性細胞因子中的作用

由表3可知，與空白對照組相比，ETEC組IL-1β、IL-8和TNF-α含量均極顯著升高(P<0.01)。與ETEC組相比，抑制劑+ETEC組、植物乳桿菌+ETEC組和抑制劑+植物乳桿菌+ETEC組IL-1β、IL-8和TNF-α含量均極顯著降低(P<0.01)。與植物乳桿菌+ETEC組相比，抑制劑+植物乳桿菌+ETEC組在p38 MAPK活性被抑制后IL-1β含量極顯著降低(P<0.01)，IL-8含量呈下降趨勢但差異不顯著(P>0.05)；在NF-κB p65活性被抑制后IL-8含量顯著降低(P<0.05)，TNF-α含量極顯著降低(P<0.01)，IL-1β含量呈下降趨勢但差異不顯著(P>0.05)；在ERK-MAPK活性被抑制后IL-1β含量極顯著降低(P<0.01)，TNF-α含量顯著降低(P<0.05)，IL-8含量呈下降趨勢但差異不顯著(P>0.05)。結果表明，植物乳桿菌和靶蛋白抑制劑共同作用或植物乳桿菌單獨作用均能夠降低ETEC誘導的促炎性細胞因子的生成，并且靶蛋白抑制劑對植物乳桿菌調控部分促炎性細胞因子的產生有協同作用。

表3 靶蛋白在植物乳桿菌調控豬腸上皮細胞產生促炎性細胞因子中的作用

2.6 植物乳桿菌對ETEC誘導的豬腸上皮細胞細胞毒性的影響

由表4可知，與空白對照組相比，ETEC組細胞毒性極顯著升高(P<0.01)；與ETEC組相比，抑制劑+ETEC組、植物乳桿菌+ETEC組和抑制劑+植物乳桿菌+ETEC組細胞毒性均極顯著降低(P<0.01)；與植物乳桿菌+ETEC組相比，抑制劑+植物乳桿菌+ETEC組在ERK-MAPK活性被抑制時細胞毒性顯著下降(P<0.05)，在p38 MAPK和NF-κB p65活性被抑制時細胞毒性無顯著變化(P>0.05)。結果表明，ETEC感染增加了豬腸上皮細胞細胞毒性，植物乳桿菌和ERK-MAPK抑制劑共同作用或植物乳桿菌單獨作用均能夠降低ETEC誘導的細胞毒性，并且部分抑制劑對植物乳桿菌降低ETEC誘導的細胞毒性具有協同作用。

表4 植物乳桿菌對ETEC誘導的豬腸上皮細胞細胞毒性的影響

3 討 論

3.1 植物乳桿菌對ETEC感染的豬腸上皮細胞產生促炎性細胞因子的影響

細胞因子由激活的免疫細胞(如巨噬細胞等)和基質細胞(如上皮細胞等)產生，具有廣泛而復雜的生物學作用，其中一個十分重要的作用就是參與免疫應答與免疫調節。TNF-α和白細胞介素-1(interleukin-1，IL-1)能夠使巨噬細胞活化，增強其吞噬、殺傷等活性，同時TNF-α具有細胞毒作用，可促進中性粒細胞活化，這些免疫細胞的活化均有助于機體清除入侵的病原菌。IL-8又稱為趨化因子，能夠募集免疫細胞到病原菌感染部位，從而使免疫細胞能夠在特定部位發揮殺傷作用，有利于機體抵抗病原菌感染和維持自身免疫平衡。適量的TNF-α、IL-1和IL-8能夠發揮上述積極作用，過量的這些細胞因子則會給機體正常組織帶來較大的損傷，例如活化的中性粒細胞可以溶解細胞和結締組織。因此，如果細胞因子過量的話，冗余的中性粒細胞就會被激活，導致較多的細胞和組織損傷，破壞機體的免疫平衡。本研究發現，ETEC感染的豬腸上皮細胞能夠產生大量的TNF-α、IL-1β和IL-8，同時釋放出大量的LDH(表現為細胞毒性增強)于培養液中，對自身造成了損傷，然而，被植物乳桿菌預處理的豬腸上皮細胞在被ETEC感染后，其產生的TNF-α、IL-1β和IL-8含量以及釋放的LDH活性均顯著下降。植物乳桿菌10hk2株能夠減弱脂多糖(LPS)處理的小鼠巨噬細胞產生炎性細胞因子，同時增加抗炎性細胞因子的產生，從而減輕了LPS誘導的炎癥反應[7]。這表明，植物乳桿菌能夠降低ETEC感染的細胞產生促炎性細胞因子，減輕該病原菌引起的腸上皮細胞損傷。

3.2 植物乳桿菌對ETEC感染的豬腸上皮細胞TLR和NLR表達的影響

先天性免疫反應通過細胞的模式識別受體識別入侵的微生物，TLR和NLR是2類重要的模式識別受體，它們一旦識別微生物后就會活化免疫細胞，通過下游信號級聯反應，最終產生多種細胞因子，發揮相應的生物學功能[8]。TLR2和TLR4均是細胞膜表面受體，它們識別的微生物具有其分子結構特征性，TLR4主要識別LPS，而TLR2的配體較TLR4的廣泛，可以識別脂蛋白、脂磷壁酸和脂多肽等。在本研究中，ETEC的刺激增加豬腸上皮細胞中TLR2和TLR4的mRNA相對表達量，在ETEC感染3～12 h植物乳桿菌預處理的細胞中TLR2和TLR4的mRNA相對表達量增加，但是在ETEC感染24 h植物乳桿菌預處理的細胞中TLR2的mRNA相對表達量開始下降。NLR是TLR的胞質對應物，在病原體出現時會啟動先天性免疫反應[9]。此外，本試驗中，ETEC的刺激增加豬腸上皮細胞中NLRP3和NLRP6的mRNA相對表達量，在ETEC感染3～6 h植物乳桿菌預處理的細胞中NLRP3和NLRP6的mRNA相對表達量顯著提高，但是在ETEC感染12 h植物乳桿菌預處理的細胞中NLRP3的mRNA相對表達量開始下降。這說明，植物乳桿菌對TLR2、TLR4、NLRP3和NLRP6表達的調控是一個動態的過程，在ETEC感染早期TLR2、TLR4和NLRP3的高表達能夠使IPEC-J2細胞通過識別更多的ETEC分子結構而活性增強，從而產生較多的促炎性細胞因子，有助于清除ETEC；而在感染后期TLR2和NLRP3的低表達可以降低促炎性細胞因子的生成，有助于減輕對IPEC-J2細胞的損傷。NLRP6是一個抑制天然免疫反應的模式識別受體，在ETEC感染植物乳桿菌預處理的細胞早期NLRP6的mRNA相對表達量較高，這有助于減輕或避免過強的免疫反應帶來的細胞損傷。這表明，植物乳桿菌通過調節TLR2、TLR4、NLRP3和NLRP6表達來調節促炎性細胞因子的生成，有助于減輕ETEC感染引起的腸上皮細胞損傷。因此，我們猜測植物乳桿菌介導的TLR2、TLR4和NLRP3依賴性信號通路的激活可能會誘導一些炎癥細胞的募集和激活，成為宿主細胞抵抗ETEC誘導的炎癥反應的一種防御性策略。與本研究結果一致的是，鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)GR-1[10]或植物乳桿菌NDC 75017[11]處理的細胞中TLR2的表達水平也表現為提高；嗜酸乳桿菌預飼仔豬后，也能夠降低ETEC感染仔豬脾臟和腸系膜淋巴結中TLR2和TLR4的表達[12]。

3.3 植物乳桿菌對ETEC感染的豬腸上皮細胞中MAPK和NF-κB磷酸化的影響

TLR和NLR識別入侵病原體后，就會激活信號通路關鍵蛋白如MAPK和NF-κB，最終調控相關基因的表達。NF-κB是一種重要的核轉錄因子，能夠調控多種炎癥相關細胞因子如TNF-α、IL-1和IL-8等的產生。TNF-α的產生和NF-κB的活化能夠形成一個正向反饋回路，即NF-κB的活化促進TNF-α的產生，TNF-α的產生又可產生信號級聯反應，引起NF-κB的活化[13]。蛋白質磷酸化是信號轉導系統調控的核心，因為它起著開關的作用來開啟或關閉蛋白質的活性。因此，本研究對NF-κB亞基p65的磷酸化進行了測定。結果表明，植物乳桿菌對NF-κB p65的磷酸化有顯著的抑制作用。因此，我們推測，植物乳桿菌可能至少部分通過NF-κB依賴的信號轉導途徑對ETEC感染的IPEC-J2細胞產生抗炎作用。本研究發現，植物乳桿菌預處理后能夠減弱ETEC誘導的豬腸上皮細胞產生促炎性細胞因子IL-1β、IL-8和TNF-α。與本研究發現一致，植物乳桿菌10hk2株能夠通過抑制NF-κB的活化減弱LPS處理的小鼠巨噬細胞產生炎性細胞因子[7]。羅伊氏乳桿菌(Lactobacillusreuteri)也可以下調ETEC感染的豬小腸上皮細胞產生促炎性細胞因子IL-8和白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)[14]。此外，本研究還發現，特異性信號通路抑制劑對植物乳桿菌下調ETEC誘導的細胞炎癥反應具有協同作用。

TLR和NLR表達下降能夠減弱MAPK和NF-κB的磷酸化，導致多種細胞因子分泌下降[15]。本研究表明，在ETEC感染后期植物乳桿菌使ETEC感染的豬腸上皮細胞表達TLR2、TLR4和NLRP3的能力下降，同時植物乳桿菌還能夠降低ETEC誘導的p38 MAPK和NF-κB p65磷酸化水平。前人研究表明，詹氏乳桿菌(Lactobacillusjensenii)和食淀粉乳桿菌(Lactobacillusamylovorus)在下調TLR4依賴性NF-κB和MAPK激活以及觸發TLR負調節因子，包括Toll相互作用蛋白(Toll interacting protein，Tollip)、B細胞淋巴瘤3編碼的蛋白質(B-cell lymphoma 3-encoded protein，Bcl3)、腫瘤壞死因子-α誘導蛋白3(A20)、絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶1(mitogen-activated protein kinase phosphatase 1，MKP-1)和抑制性白細胞介素-1受體(interleukin-1 receptor，IL-1R)相關激酶等中發揮保護作用[16-17]。副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)能夠通過誘導TLR2依賴性NF-κB信號通路激活的負調節因子來抑制單核巨噬細胞產生促炎性細胞因子[18]。因此，我們推測植物乳桿菌引起的NF-κB磷酸化水平下降可能與TLR2活化相關。他們的研究結果與我們的研究結果相結合，提供了一種益生菌通過減輕炎癥反應來保護腸細胞免受ETEC造成損傷的可能性。ERK和p38是MAPK中2個不同的家族，參與炎性反應。在本研究中，植物乳桿菌可在ETEC感染后3～6 h使細胞中p38 MAPK磷酸化受到抑制，但是在同一組中觀察到了ERK-MAPK磷酸化的增強，這說明植物乳桿菌調節ETEC誘導炎癥反應存在著復雜性，還需要我們進行更深入的研究。NLRP6可以抑制MAPK和NF-κB信號通路[6,19-20]。在本研究中，植物乳桿菌還能夠提高ETEC感染細胞中NLRP6的mRNA相對表達量，同時還降低了該細胞中p38 MAPK和NF-κB p65的磷酸化水平，這表明NLRP6在植物乳桿菌調節腸上皮細胞炎癥反應中發揮著一定的作用。

3.4 植物乳桿菌對ETEC感染的豬腸上皮細胞中緊密連接蛋白表達的影響

腸道屏障與功能性緊密連接蛋白密切相關，緊密連接蛋白是位于上皮細胞之間的動態復合體，是一種基于分子電荷和大小的細胞旁通透性的關鍵結構[21]。從這個意義上說，這種多功能和連續裝配的任何變化都可能導致細胞旁通透性的限制，使離子和溶質的進入或凈流動成為可能。緊密連接包括跨膜蛋白(封閉蛋白和閉合蛋白)以及各種被招募到頂外側膜的胞漿蛋白，包括ZO-1、ZO-2、ZO-3、扣帶蛋白(cingulin)和7H6[22]。在ETEC感染的豬腸上皮細胞中，緊密連接的完整性和規律滲透率被負面影響[22]；在早期斷奶仔豬中，ETEC的感染能夠增加緊密連接的通透性[23]；羅伊氏乳桿菌能夠通過維持ZO-1的正常位置，可以降低ETEC誘導的膜屏障損傷[24]。這些結果與本研究的結果是一致的，ETEC感染能夠降低緊密連接蛋白ZO-1和occludin的表達，但是這種不利的影響在植物乳桿菌預處理的細胞中能夠被部分逆轉。這說明，植物乳桿菌調控腸上皮細胞緊密連接蛋白表達有助于維護腸上皮細胞的完整性。

3.5 植物乳桿菌對ETEC誘導的豬腸上皮細胞細胞毒性的影響

LDH是一種存在于細胞質中的氧化還原酶，廣泛存在于組織中。細胞內或細胞外應激都會導致黏屏障功能受損，刺激細胞隨后釋放LDH，常用培養液中LDH的活性來表示細胞損傷程度[25]。因此，培養液中LDH的活性通常作為細胞損傷或死亡的一種標志。本研究結果發現ETEC能夠誘導豬腸上皮細胞炎癥反應，釋放大量LDH，而植物乳桿菌的加入能夠顯著降低ETEC感染細胞釋放LDH。這說明，植物乳桿菌能夠保護豬腸上皮細胞膜的完整性，并且在特異性信號通路抑制劑存在的情況下這種保護作用能夠被提高，植物乳桿菌對炎癥反應的調節作用可能有助于提高上皮細胞的屏障功能。

4 結 論

植物乳桿菌通過促進ETEC感染的豬腸上皮細胞過表達NLRP6，抑制ETEC感染細胞過表達TLR2和NLRP3，下調感染細胞中p38 MAPK和NF-κB p65的磷酸化水平，以及抑制促炎性細胞因子的產生，從而減輕腸上皮細胞的炎癥反應。此外，植物乳桿菌還可促進緊密連接蛋白ZO-1和occludin的表達，減輕感染細胞的損傷程度，有助于維護腸上皮細胞的完整性。