不同尿素添加劑量對蒸汽爆破玉米秸稈體外瘤胃發酵和功能微生物數量的影響

孫美杰 徐詣軒 曹玉榮 杜風光 申軍士* 朱偉云

(1.南京農業大學,國家動物消化道營養國際聯合研究中心，江蘇省消化道營養與動物健康重點實驗室，消化道微生物研究室，南京 210095；2.易高卓新節能技術(上海)有限公司，上海 201109)

玉米秸稈是我國最豐富的農作物副產品[1-2]，低廉的價格使其成為反芻動物秸稈飼料、纖維素乙醇生產和生物沼氣生產的豐富原料[3-6]。玉米秸稈主要由纖維素、半纖維素和木質素組成，彼此通過化學鍵緊密連接，這種復雜的理化結構嚴重阻礙了玉米秸稈的利用。因此，對玉米秸稈進行預處理是克服木質纖維素難分解的有效策略之一，也是現今使用最為廣泛的措施之一。蒸汽爆破是一種有效提高秸稈營養價值的物理處理方法[7]，經高溫高壓飽和蒸汽作用，秸稈中的半纖維素水解成可溶性單糖，木質素部分破裂重新排列，暴露出纖維素。經過蒸汽爆破處理，不僅提高了秸稈的柔軟性，而且提高了秸稈的比表面積，可促進消化道微生物黏附和有關酶的識別結合，提高秸稈利用效率[8]。因此，蒸汽爆破被認為是21世紀解決秸稈飼料化的潛在技術之一，其相關技術的完善、在動物體外和體內試驗上的應用效果以及相關代謝機理成為今后研究的重點。

蒸汽爆破雖然能夠促進秸稈纖維素、半纖維素的降解，但是卻不能解決秸稈本身蛋白質含量低的問題，能氮的不平衡性還是不利于反芻動物對秸稈的高效利用。有研究發現，向飼喂蒸汽爆破玉米秸稈的綿羊飼糧中添加尿素可使瘤胃中可溶性糖含量明顯增加，并顯著增加了纖維素和半纖維素的可消化部分[9]，并且還能使蛋白質含量提高2倍多[10]。Hai等[10]對經過蒸汽爆破并且添加2%尿素(干物質基礎)的小麥秸稈進行體外發酵試驗后發現，綿羊對蒸汽爆破小麥秸稈的干物質消失率(DMD)以及中性洗滌纖維(NDF)、酸性洗滌木質素(ADL)和纖維素的消化利用率顯著提高。此外，尿素水解產生的氨也為瘤胃微生物提供了充足的氮源[11]。有研究表明，瘤胃微生物對氮源的需求有50%～80%是以氨的形式被滿足，剩下20%～50%是以肽和氨基酸的形式被滿足[12]，并且瘤胃中絕大部分纖維降解細菌將氨作為其生長的主要氮源。但是，反芻動物對尿素氨的利用情況與尿素添加量存在直接關系。Kertz[13]報道，當以干物質消失率和非氨態氮(NH3-N)流量為測定指標時，瘤胃氨的最佳濃度在17～25 mg/dL。過量的氨會打破瘤胃內氮的平衡，增加反芻動物氨中毒的風險[14]。但在尿素誘導的高氨濃度條件下，瘤胃微生物對秸稈的利用是否會受影響，以及秸稈經蒸汽爆破處理后是否可以進一步增強瘤胃微生物對NH3-N的吸收和利用等問題仍有待進一步的探究。因此，本試驗通過靜態模擬瘤胃體外發酵法，探究尿素添加誘導的不同氨濃度對蒸汽爆破玉米秸稈發酵的影響，以期為促進蒸汽爆破玉米秸稈的飼料化應用提供更多的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

玉米秸稈：將收集的玉米秸稈樣品平均分成兩部分，其中一部分不做任何處理，作為未處理玉米秸稈；另一部分在蒸汽爆炸反應器(河南天冠企業集團有限公司自行研制開發)中爆破，制成蒸汽爆破玉米秸稈。蒸汽爆破處理條件為50 L容量罐，兩段變壓汽爆，0.7 MPa、8 min與1.2 MPa、2 min，由河南天冠企業集團有限公司制作完成。將2種玉米秸稈樣品在65 ℃下烘干粉碎，過40目篩，于4 ℃冰箱中儲存備用。

添加劑：尿素，純度≥99.5%。

1.2 試驗設計

采用2×3雙因素試驗設計，即2種玉米秸稈底物[未處理玉米秸稈(C)與蒸汽爆破玉米秸稈(S)]和3個尿素添加劑量(0、20、100 mg/dL)，共6個處理(C-0、C-20、C-100分別為未處理玉米秸稈中添加0、20、100 mg/dL尿素，S-0、S-20、S-100分別為蒸汽爆破玉米秸稈中添加0、20、100 mg/dL尿素)，每個處理5個重復，采用湖羊作為瘤胃液供體，進行體外發酵。

1.3 玉米秸稈的常規養分含量測定

參照AOAC(1995)[15]方法對飼料樣品進行干物質(DM)、粗灰分(Ash)和粗蛋白質(CP)含量分析。參照Van Soest等[16]描述的方法，使用A220纖維分析儀(ANKOM Technology Corporation，美國)測定飼料樣品中NDF和酸性洗滌纖維(ADF)含量，根據NDF與ADF含量計算半纖維素和中性洗滌可溶物(NDS)含量。

1.4 瘤胃液接種與體外發酵

瘤胃液采自南京農業大學動物房3只健康并裝有瘤胃瘺管的公湖羊，體重(30±2) kg，采食的飼糧為全混合日糧[25%玉米青貯、20%花生藤、42%玉米、4%豆粕、4%麩皮、5%預混料(每千克預混料含有：氯化鈉150 g，碳酸氫鈉200 g，鈣75 g，磷20 g，錳600 mg，鐵680 mg，鋅960 mg，銅300 mg，維生素A 140 000 IU，維生素D355 000 IU，維生素E 700 IU，煙酸600 mg)]。每日08:00和17:00各飼喂1次，自由飲水。試驗當天晨飼前通過瘤胃瘺管收集瘤胃液，保存在39 ℃預熱并充滿二氧化碳(CO2)的自封袋內，迅速帶回實驗室。經4層紗布過濾后用于接種。在獲取瘤胃液的整個過程中都要嚴格厭氧。人工緩沖液按照Theodorou等[17]的方法配制。將瘤胃液與人工緩沖液在厭氧條件下按照1∶9的體積比混合均勻，制成混合培養液。事先在180 mL發酵瓶中稱取1 g未處理玉米秸稈或蒸汽爆破玉米秸稈作為體外發酵底物，并按照試驗設計添加不同劑量的尿素，隨后厭氧分裝100 mL混合培養液于發酵瓶中，密封，置于39 ℃恒溫培養箱中培養72 h。

1.5 發酵參數測定

體外模擬瘤胃發酵過程中，參照Theodorou等[17]描述的方法測定總產氣量。體外發酵72 h后，迅速從各發酵瓶中取5 mL發酵液用pH計(Ecoscan pH 5,Singapore)測定pH，隨后置于冰水混合物中終止發酵。收集發酵液，分裝后于-20 ℃冰箱保存。參照Weatherburn[18]的方法測定NH3-N濃度，參考申軍士等[19]的氣相色譜法測定揮發性脂肪酸(VFA)濃度；參照Liu等[20]的尼龍袋法，將發酵后的底物全部轉移至已稱好的尼龍濾袋中，烘干稱重，計算DMD。采用Gompertz模型分析產氣動態參數變化[21-22]。應用非線性軟件(R)對體外發酵產氣參數進行擬合，統計方程如下：

式中：G為t時刻累積產氣量(mL)；A為理論最大產氣量(mL)；exp表示帶截距的簡單指數增長；k為產氣速率常數(mL/h)；L為體外發酵產氣延滯時間(h)；t為發酵時間點。

1.6 功能微生物數量分析

瘤胃液樣品解凍后，9 000 r/min離心10 min，利用珠磨法提取瘤胃微生物總DNA[23-24]，并使用Nanodrop 2000分光光度計(Thermo Fisher Scientific Inc., Madison, Wisconsin,美國)對提取的發酵液微生物總DNA在260和280 nm下測定吸光度(OD)，OD260/280 nm在1.8～2.0表示純度較好，可用于下一步分析。參考申軍士等[19]的方法構建20 μL反應體系，使用PCR儀(ABI 7500，英國)對瘤胃液中的總菌、甲烷菌、真菌和原蟲進行定量分析。分別以總菌的16S rRNA基因、真菌和原蟲的18S rRNA基因、甲烷菌的甲基輔酶M還原酶(mcrA)基因作為模板制作各目標微生物定量的標準曲線。實時定量PCR(real-time qPCR)引物序列見表1。

表1 瘤胃目標微生物實時定量PCR引物序列

1.7 數據處理與分析

試驗數據經Excel 2007初步整理后，利用SAS 9.4混合模型(mixed model)對所有數據進行雙因素方差分析，模型包括玉米秸稈類型效應、尿素添加劑量效應及玉米秸稈類型與尿素添加劑量的交互作用。如果交互作用顯著，則不考慮自變量效應，僅對不同玉米秸稈類型條件下不同尿素添加劑量進行差異分析。因為尿素添加劑量不等間距，首先使用SAS IML(交互式矩陣語言)程序對多項式對比系數進行校正，然后采用正交多項式矩陣(orthogonal polynomial contracts)對尿素不同添加劑量進行一次(linear)和二次(quadratic)效應分析。顯著性水平為P<0.05。

2 結果與分析

2.1 常規養分含量

表2顯示了未處理玉米秸稈與蒸汽爆破玉米秸稈樣品的常規養分含量。由表可知，蒸汽爆破處理使玉米秸稈的NDF和半纖維素含量分別從72.13%和31.54%下降到52.88%和7.98%，NDS和ADF含量分別從27.87%和40.59%上升到47.12%和44.90%，而DM、CP和Ash含量基本沒有發生變化。

表2 玉米秸稈常規養分含量

2.2 總產氣量、DMD和產氣動力學參數

玉米秸稈體外瘤胃發酵總產氣量和DMD數據見圖1，產氣動力學參數見表3。玉米秸稈類型和尿素添加劑量對總產氣量和產氣動力學參數[產氣速率常數(k)、理論最大產氣量(V)、產氣延滯時間(L)]不存在顯著的交互作用(P>0.05)；蒸汽爆破處理使總產氣量和理論最大產氣量顯著升高(P<0.01)，產氣速率常數和體外發酵產氣延滯時間顯著降低(P<0.01)，同時在不同尿素添加劑量中也表現出差異。總產氣量隨尿素添加劑量的增加線性降低(P<0.01)。尿素添加劑量與產氣動力學參數(產氣速率常數、理論最大產氣量、產氣延滯時間)存在二次劑量效應(P<0.01)。玉米秸稈類型和尿素添加劑量對DMD存在顯著的交互作用(P<0.01)，蒸汽爆破玉米秸稈各組的DMD均顯著高于未處理玉米秸稈各組(P<0.05)，其中以蒸汽爆破玉米秸稈S-20組最高，未處理玉米秸稈C-20組最低。

試驗結果均表示為平均值±標準誤，每組重復數為5。數據柱形標注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。S表示玉米秸稈效應，D表示尿素添加劑量效應，S×D表示玉米秸稈類型與尿素添加劑量的交互作用，Lin表示線性劑量效應，Qua表示二次劑量效應。

表3 不同尿素添加劑量對蒸汽爆破玉米秸稈瘤胃體外發酵產氣動力學參數的影響

2.3 體外瘤胃發酵參數

2.3.1 發酵液pH和NH3-N濃度

由表4可知，玉米秸稈類型和尿素添加劑量對pH(P<0.01)和NH3-N濃度(P=0.02)存在顯著的交互作用。蒸汽爆破玉米秸稈S-100組和未處理玉米秸稈C-100組的pH要顯著高于C-0、C-20、S-0和S-20組(P<0.05)，而C-0、C-20和S-20組彼此之間的pH差異不顯著(P>0.05)。隨著尿素添加劑量的升高，蒸汽爆破玉米秸稈和未處理玉米秸稈的NH3-N濃度均顯著升高(P<0.05)，且3個蒸汽爆破玉米秸稈組的NH3-N濃度分別顯著低于對應尿素添加劑量的3個未處理玉米秸稈組(P<0.05)。

2.3.2 發酵液VFA濃度

由表4可知，對于總VFA、乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸和戊酸濃度和乙丙比來說，玉米秸稈類型和尿素添加劑量之間不存在顯著的交互作用(P>0.05)。蒸汽爆破玉米秸稈的總VFA和乙酸濃度顯著高于未處理玉米秸稈(P<0.05)，丁酸和異丁酸濃度顯著低于未處理秸稈(P<0.05)；隨著尿素添加劑量的增加，戊酸濃度存在線性(P=0.02)和二次(P=0.03)劑量效應，總VFA(P<0.05)和乙酸濃度(P=0.04)存在二次劑量效應，以尿素添加劑量為20 mg/dL時總VFA和乙酸濃度最高。玉米秸稈類型和尿素添加劑量對丙酸濃度和乙丙比均無顯著影響(P>0.05)。玉米秸稈類型和尿素添加劑量對異戊酸濃度存在顯著的交互作用(P=0.03)。當底物秸稈為蒸汽爆破玉米秸稈時，尿素添加劑量對異戊酸濃度的影響不顯著(P>0.05)；而當底物秸稈為未處理玉米秸稈時，C-20組的異戊酸濃度顯著高于C-0和C-100組(P<0.05)。

表4 不同尿素添加劑量對蒸汽爆破玉米秸稈體外瘤胃發酵液中pH、NH3-N和VFA濃度的影響

續表4項目 Items未處理玉米秸稈 Untreated corn stoverC-0C-20C-100蒸汽爆破玉米秸稈Steam-exploded corn stoverS-0S-20S-100SEMP值 P-valueS尿素 UreaDLinQuaS×D丙酸 Propionate/(mmol/L)14.615.113.714.514.915.70.5180.220.660.980.370.06乙丙比 Acetate/propionate4.184.154.534.644.744.230.2420.220.950.830.830.16丁酸 Butyrate/(mmol/L)6.616.796.536.166.046.030.158<0.010.670.420.710.60異丁酸 Isobutyrate/(mmol/L)0.620.610.590.610.540.550.015<0.010.030.060.060.26戊酸 Valerate/(mmol/L)0.390.450.470.400.430.420.0150.13<0.010.020.030.12異戊酸 Isovalerate/(mmol/L)0.56b0.65a0.56b0.50bc0.49bc0.45c0.019<0.01<0.010.040.010.03

2.4 發酵液功能微生物數量

由表5可知，玉米秸稈類型與尿素添加劑量對于總菌(P<0.01)、甲烷菌(P=0.04)和原蟲數量(P<0.01)存在顯著交互作用，其中均以蒸汽爆破玉米秸稈S-0組最高，未處理玉米秸稈C-100組最低。而對于真菌數量來說，玉米秸稈類型與尿素添加劑量之間不存在顯著的交互作用(P>0.05)，蒸汽爆破玉米秸稈組的真菌數量顯著高于未處理玉米秸稈組(P<0.01)，尿素添加劑量也顯著影響真菌數量(P<0.01)。隨著尿素添加劑量的增加，真菌數量存在線性(P<0.01)和二次(P=0.04)劑量效應，以尿素添加劑量為20 mg/dL時的真菌數量最高。

表5 不同尿素添加劑量對蒸汽爆破玉米秸稈體外瘤胃發酵液中功能微生物數量的影響

3 討 論

3.1 蒸汽爆破處理對玉米秸稈常規養分含量的影響

玉米秸稈的纖維素和半纖維素含量高，通過對常規養分含量進行測定，可以評估半纖維素和纖維素在蒸汽爆破過程中的降解情況。本研究發現，蒸汽爆破使玉米秸稈中的NDF和半纖維素含量降低，而ADF和NDS含量升高。半纖維素在高溫高壓處理下易降解為可溶性單糖或低聚糖，此外，乙酰纖維素產生的乙酸會進一步加速纖維素和半纖維素的降解[28-31]。本研究中，蒸汽爆破玉米秸稈中半纖維素含量較未處理玉米秸稈明顯降低，降低了23.56%，表明蒸汽爆破使玉米秸稈中半纖維素的降解或去除程度增強，此結果與Shi等[32]、Chang等[33]和Zhao等[34]的研究結果相同。本試驗中蒸汽爆破玉米秸稈中NDS含量的增加可能是由于蒸汽爆破使半纖維素分解所致，這進一步證明了玉米秸稈在蒸汽爆破處理后的易降解性。Shi等[32]和Zhao等[34]研究發現，玉米秸稈經蒸汽爆破處理后木質素含量顯著增加。因此推測本研究中蒸汽爆破玉米秸稈中ADF含量的增加可能是木質素含量增加所致，但木質素含量增加的具體原因仍不清楚，相關研究者也未給出合理解釋，后續還需更深入的試驗加以探究。

3.2 蒸汽爆破玉米秸稈中添加不同劑量尿素對體外瘤胃發酵總產氣量和DMD的影響

瘤胃體外發酵產氣量是評定反芻動物瘤胃發酵程度的一個重要指標，與DMD存在一定的正相關關系，并且體外發酵產氣量的高低也能反映瘤胃內微生物活性的強弱[35]。本研究發現，蒸汽爆破玉米秸稈組的總產氣量和DMD較未處理玉米秸稈組顯著提高，與李德勇等[36]、Zhao等[34]和He等[4]所報道的結果相一致，說明蒸汽爆破可以提高瘤胃微生物的活性和消化速率，對玉米秸稈的降解有一定的促進作用。有研究指出，瘤胃液中適宜的NH3-N濃度在17～25 mg/dL，過低和過高都會對瘤胃發酵產生不利影響[13]。本研究發現，不同尿素添加劑量對DMD沒有產生顯著影響，但是添加尿素使總產氣量顯著降低，并呈現出顯著的線性劑量效應。20 mg/dL劑量組的總產氣量下降不明顯，說明適宜氨濃度不會影響產氣量，但100 mg/dL劑量組的產氣量下降明顯，其原因可能與發酵液pH的升高有關。人工緩沖液中含有大量碳酸氫根離子，在低pH條件下會還原產生CO2，而在本試驗條件下添加高劑量尿素使得發酵液pH顯著升高，進而導致產氣量減少。

3.3 不同尿素添加劑量對蒸汽爆破玉米秸稈體外瘤胃發酵參數的影響

瘤胃液內NH3-N濃度的高低直接反映了瘤胃內微生物對氮的利用情況[14]。本試驗發現，蒸汽爆破玉米秸稈相較于未處理玉米秸稈，其發酵液NH3-N濃度顯著降低，這與Zhao等[34]和李德勇等[36]的研究結果一致，表明蒸汽爆破處理玉米秸稈提高了瘤胃微生物對氨的利用效率。在本試驗中，隨著尿素添加劑量的增加，發酵液pH和NH3-N濃度顯著升高，這是因為尿素在進入瘤胃后會被完全降解為氨，氨水解呈堿性，所以隨著尿素添加劑量的增加pH顯著升高。Prasad等[37]在水稻秸稈中添加尿素后發現奶牛的瘤胃液pH升高，與本試驗結果相同。這些結果表明，當尿素添加劑量過高時會顯著提高瘤胃液氨濃度和pH，但對玉米秸稈進行蒸汽爆破處理可以提高瘤胃微生物對氨的利用效率，緩解高氨對瘤胃發酵產生的不利影響。

瘤胃VFA是反芻動物重要的能量來源，可為機體提供70%～80%的可消化能[38]。本研究發現，玉米秸稈經蒸汽爆破處理后，發酵液中總VFA和乙酸濃度顯著升高，總VFA濃度的升高表明微生物的生長和發酵能力提高，對能量的利用效率提高。乙酸是纖維分解菌的主要產物，乙酸濃度與纖維分解菌數量之間存在一定的正相關關系，蒸汽爆破處理后的纖維素可接觸面積增大，使得纖維分解菌數量增多，因此發酵液中乙酸濃度也相應增加。發酵液中丙酸濃度和乙丙比沒有因蒸汽爆破處理發生顯著變化，說明蒸汽爆破處理并未改變瘤胃發酵模式，此結果與李德勇等[36]和He等[4]的研究結果不一致，可能是由于所選的秸稈類型不同導致蒸汽爆破后的物理化學性質變化存在差異。在本試驗中，尿素添加劑量與發酵液中總VFA、乙酸和戊酸濃度存在顯著的二次劑量效應，均以尿素添加劑量為20 mg/dL時最高，說明在本底氨濃度基礎上添加此劑量尿素所分解產生氨的最終濃度(16.92～18.87 mg/dL)有利于瘤胃微生物的發酵和對能量的利用。

3.4 不同尿素添加劑量對蒸汽爆破玉米秸稈體外瘤胃發酵液中功能微生物數量的影響

反芻動物自身不能分泌纖維素降解酶，所以飼糧中的纖維素主要依靠瘤胃內存在的微生物來分解，這些微生物主要包括細菌、古菌、真菌和原生動物[39]，因此它們的存在與反芻動物能量利用密切相關。有研究報道，經過蒸汽爆炸處理的玉米秸稈，其孔隙率和微生物可定植面積都有所增加[40]。本研究發現，蒸汽爆破玉米秸稈發酵液中總菌、甲烷菌、真菌和原蟲數量要顯著高于未處理玉米秸稈，表明蒸汽爆破通過破壞底物的結構，促進了微生物的生長定植，此結果與總產氣量的增加和DMD的提高相一致。Zhao等[34]用掃描電鏡觀察玉米秸稈的物理結構變化發現，蒸汽爆破處理顯著增加了玉米秸稈在瘤胃中的微生物定植，在培養4、12和24 h時，蒸汽爆破玉米秸稈表面的微生物數量明顯多于未處理玉米秸稈，與本試驗結果一致。因此，蒸汽爆破可通過破壞底物結構來增加瘤胃微生物數量，從而達到提高底物利用率的目的。

瘤胃微生物可以介導瘤胃內氨的生成，同時瘤胃內產生的氨也會反饋影響微生物的數量與結構[41]。在適宜的氨濃度范圍內，瘤胃微生物可以有效利用NH3-N[42]，但如果氨濃度過高，就會對微生物產生抑制作用，進而影響微生物的正常功能。本研究發現，在未處理秸稈組中，當尿素添加劑量達到100 mg/dL時，發酵液中氨濃度達44.05～47.69 mg/dL，總菌、甲烷菌和原蟲的數量顯著降低，這說明高濃度的氨會抑制瘤胃微生物的生長和繁殖，進而影響其對底物的發酵利用。但是我們發現，在以蒸汽爆破玉米秸稈為底物時，100 mg/dL的尿素添加劑量并沒有對發酵液中總菌、甲烷菌和原蟲的數量產生顯著抑制作用，這與未處理秸稈組得到的結果相反，這說明蒸汽爆破通過提高能量的釋放速率，在一定程度上使尿素氨的釋放與能量釋放更為同步，促進瘤胃微生物的生長繁殖以提高NH3-N的利用效率，進而緩解高氨濃度對瘤胃發酵產生的不利影響。

4 結 論

蒸汽爆破處理改變玉米秸稈的化學組成，可通過增加功能微生物數量改善瘤胃發酵；在本底氨濃度(10.82 mg/dL)的基礎上，適量(20 mg/dL)添加尿素可提高玉米秸稈瘤胃體外發酵總VFA產量，而過量添加尿素則會抑制玉米秸稈體外瘤胃發酵，但蒸汽爆破處理可緩解高氨濃度對其產生的不利影響。