鳥氨酸-α-酮戊二酸對由D-半乳糖導致的慢性氧化應激仔豬生長性能、臟器指數、腸道形態和血清生化指標的影響

王 鵬 黎育穎 田軍權 蘇文璇 尹 杰 印遇龍 姚 康*

(1.中國科學院亞熱帶農業生態研究所，亞熱帶農業生態過程重點實驗室，湖南省畜禽健康養殖工程技術中心，長沙 410025；2.中國科學院大學，北京 100049；3.湖南農業大學動物科學技術學院，長沙 410128)

氧化應激在畜牧生產中極其常見。仔豬出生過程和斷奶、病毒細菌、飼料抗營養物質和霉變以及飼養密度過高等，都會在一定程度上引起機體氧化應激。氧化應激一般分為急性氧化應激和慢性氧化應激，其中慢性氧化應激刺激強度弱、刺激時間長、頻率高，更加常見和多發[1-2]。D-半乳糖主要來源于動物乳汁中的乳糖，可引起慢性氧化應激和輕度炎癥。例如，D-半乳糖易與體內、體外蛋白質和肽中的游離氨基酸反應，形成高級糖基化終產物[3]，從而提高活性氧的產生量，降低線粒體呼吸復合的產生，最終導致慢性氧化應激損傷[4-5]。研究表明，D-半乳糖在小鼠中引起認知障礙、神經毒性、肝臟疾病以及慢性腎臟損傷[6-7]。鳥氨酸-α-酮戊二酸(ornithine-α-ketoglutarate，OKG)是一種營養鹽，由2分子的鳥氨酸(ornithine，Orn)和1分子的α-酮戊二酸(alpha-ketoglutarate，AKG)組成，由于其具有治療和合成代謝特性[8-9]，已經使用了多個世紀，主要作用包括增加骨礦物質密度[10]、治愈燒傷和創傷[11]和抗骨骼應激[12]。OKG還是體內脯氨酸、精氨酸和谷氨酰胺前體[13]。研究表明，相較于鳥氨酸和α-酮戊二酸的單獨添加，添加OKG能更有效地誘導胰島素和生長激素分泌[14]，并且還能提高能量代謝中丙酮酸的利用[15]。本課題組前期研究結果表明，飼糧中添加D-半乳糖顯著抑制仔豬生長，增加血清丙二醛含量，降低血清超氧化物歧化酶活性，造成仔豬慢性氧化應激，添加的0.5%OKG可顯著提高仔豬末重、平均日采食量與血清谷氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、蘇氨酸和支鏈氨基酸含量，改變腸道微生物區系，緩解D-半乳糖所造成的慢性氧化應激[16]。因此，本試驗通過在斷奶仔豬飼糧中添加D-半乳糖建立慢性氧化應激模型，在本課題組前期研究的基礎上，進一步研究OKG對由D-半乳糖導致的慢性氧化應激仔豬生長性能、臟器指數、腸道形態以及血清生化指標的影響，旨在完善OKG緩解D-半乳糖刺激斷奶仔豬產生慢性氧化應激的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

試驗選取28日齡的健康“長×大”二元雜交斷奶閹公豬40頭，平均體重為(7.68±0.56) kg，按體重相近原則隨機分為5組，分別為對照組(基礎飼糧)、模型組(基礎飼糧+5 g/kg BWD-半乳糖)、SOKG組(基礎飼糧+5 g/kg BWD-半乳糖+0.5%OKG)、MOKG組(基礎飼糧+5 g/kg BWD-半乳糖+1.0%OKG)和LOKG組(基礎飼糧+5 g/kg BWD-半乳糖+2.0%OKG)，每組8個重復，每個重復1頭豬。試驗期為28 d，試驗結束后測定仔豬生長性能、臟器指數、腸道形態以及血清生化指標。基礎飼糧組成及營養水平見表1。

表1 基礎飼糧組成及營養水平(風干基礎)

1.2 飼養管理

飼養試驗于湖南省永州市某豬場進行。試驗期間豬舍為全封閉式，屋頂以排氣扇通風，漏縫塑料材質底面，不銹鋼可調式料槽，乳頭式飲水器，不定期對豬舍進行衛生清潔以及消毒。試驗豬按照試驗設計分組飼養，自由飲水和采食，采用粉料飼喂。

1.3 指標測定及方法

1.3.1 生長性能

在試驗期間，記錄每頭仔豬每天的采食量。在試驗期的第1天和第28天對仔豬進行空腹稱重。根據記錄的采食量和體重數據，計算每只仔豬的平均日采食量(ADFI)、平均日增重(ADG)和料重比(F/G)。

ADG=(末重-初重)/試驗天數；
ADFI=耗料量/試驗天數；
F/G=ADFI/ADG。

1.3.2 臟器指數

仔豬飼養試驗結束后，于豬舍內禁食12 h，運至屠宰地點，稱取體重，人工解剖取出內臟，分別稱取肝臟、脾臟和腎臟的重量，最后按照公式[臟器指數(%)=(器官重量/體重)×100]計算臟器指數。

1.3.3 腸道形態

仔豬飼養試驗結束后，取空腸、回腸腸段各約2 cm，于10%中性福爾馬林溶液中固定，再經常規水洗、浸蠟、包埋、切片、蘇木精-伊紅(HE)染色后，在光學顯微鏡下觀察，選取6個走向延伸良好的視野，用Magic Images Advanced 3.2軟件測量絨毛高度(villi height，VH)、絨毛寬度(villi width，VW)和隱窩深度(crypt depth，CD)，并計算出絨毛高度與隱窩深度的比值(V/C)。

1.3.4 血清生化指標

仔豬飼養試驗結束后，空腹采集前腔靜脈血液10 mL，3 000 r/min、4 ℃下離心10 min，分離血清后于-20 ℃凍存。采用全自動血液生化分析儀測定血清總蛋白(total protein，TP)、白蛋白(albumin，ALB)、尿素氮(urea nitrogen，UN)、葡萄糖(glucose，GLU)、血氨(blood ammonia，NH3L)、免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)和免疫球蛋白M(immunoglobulin M，IgM)含量以及谷丙轉氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、谷草轉氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性。

1.4 數據統計與分析

試驗數據先于Excel 2016軟件記錄，同時進行歸納整理，接著采用統計軟件SPSS 22.0進行單因素方差分析和Turkey多重比較檢驗組間的差異顯著性，以P<0.05為差異顯著性標準，數值結果用平均值±標準誤表示。

2 結果與分析

2.1 OKG對由D-半乳糖導致的慢性氧化應激仔豬生長性能的影響

由表2可知，模型組末重、ADG和ADFI與對照組相比顯著降低(P<0.05)，F/G則顯著增加(P<0.05)。SOKG組末重、ADG與模型組相比顯著增加，F/G則顯著降低(P<0.05)；MOKG組F/G與模型組相比顯著降低(P<0.05)；LOKG組各生長性能指標與模型組相比均沒有顯著變化(P>0.05)。

表2 OKG對由D-半乳糖導致的慢性氧化應激仔豬生長性能的影響

2.2 OKG對由D-半乳糖導致的慢性氧化應激仔豬臟器指數的影響

由圖1可知，各組肝臟指數無顯著差異(P>0.05)；對照組、模型組、SOKG組以及LOKG組間脾臟指數和腎臟指數無顯著差異(P>0.05)，但MOKG組脾臟指數和腎臟指數相較于對照組和模型組顯著升高(P<0.05)。

數據柱標注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同或無字母表示差異不顯著(P>0.05)。

2.3 OKG對由D-半乳糖導致的慢性氧化應激仔豬腸道形態的影響

由圖2和表3可知，對照組空腸絨毛高度與模型組以及3個OKG組均沒有顯著差異(P>0.05)，但SOKG組空腸絨毛高度顯著高于模型組(P<0.05)；模型組和SOKG組空腸隱窩深度較對照組顯著降低(P<0.05)，MOKG組和LOKG組空腸隱窩深度則較對照組沒有顯著差異(P>0.05)；對照組空腸絨毛高度與隱窩深度的比值與模型組以及3個OKG組均沒有顯著差異(P>0.05)，但LOKG組空腸絨毛高度與隱窩深度的比值相較于MOKG組顯著升高(P<0.05)；模型組空腸絨毛寬度較對照組顯著降低(P<0.05)，3個OKG組的空腸絨毛寬度與對照組沒有顯著差異(P>0.05)。3個OKG組回腸絨毛高度顯著低于對照組(P<0.05)；3個OKG組回腸隱窩深度與對照組和模型組均沒有顯著差異(P>0.05)，但MOKG組和LOKG組回腸隱窩深度顯著低于SOKG組(P<0.05)；SOKG組回腸空腸絨毛高度和隱窩深度的比值顯著低于對照組(P<0.05)。

表3 OKG對由D-半乳糖導致的慢性氧化應激仔豬腸道形態的影響

2.4 OKG對由D-半乳糖導致的慢性氧化應激仔豬血清生化指標的影響

由表4可知，MOKG組血清TP含量與對照組相比顯著增加(P<0.05)；模型組血清ALP活性與對照組相比顯著降低(P<0.05)，而SOKG組血清ALP活性與模型組相比顯著增加(P<0.05)；MOKG組血清IgG含量與對照組相比顯著增加(P<0.05)；MOKG組和LOKG組血清IgM含量與對照組和模型組相比顯著增加(P<0.05)。

圖2 仔豬腸道形態

表4 OKG對由D-半乳糖導致的慢性氧化應激仔豬血清生化指標的影響

3 討 論

3.1 OKG對由D-半乳糖導致的慢性氧化應激仔豬生長性能的影響

D-半乳糖是一種營養物質和還原單糖，它與蛋白質中的游離氨基酸反應生成活性氧簇(ROS)，從而引起慢性氧化應激[5]。而越來越多的證據表明，OKG在氧化應激、燒傷、損傷和新陳代謝中具有正向的調節作用[9,17-19]。從體重結果上來看，模型組添加D-半乳糖后末重顯著降低，而在應激狀態下添加0.5% OKG可以顯著逆轉末重的降低，這與我們之前的試驗結果[16]一致，同時也與OKG對腫瘤大鼠[20]和D-半乳糖誘導的衰老小鼠的作用相似[21]，說明OKG可以緩解仔豬因D-半乳糖造成的生長抑制。

3.2 OKG對由D-半乳糖導致的慢性氧化應激仔豬臟器指數的影響

臟器指數是內臟器官的相對重量，是反映臟器是否中毒以及臟器功能強弱的重要指標[22]。有研究表明，D-半乳糖誘導的衰老型大鼠肝臟結構遭到破壞，肝功能減退[23]；另外，D-半乳糖可導致小鼠慢性腎臟損傷[8]。本試驗結果表明，正常仔豬和D-半乳糖應激仔豬肝臟指數、脾臟指數和腎臟指數無顯著差異，說明D-半乳糖在仔豬上造成的應激還不至于顯著損傷內臟。在D-半乳糖應激狀態下，飼糧中添加0.5%、1.0%和2.0%OKG對仔豬肝臟指數均無顯著影響，添加0.5%、2.0%OKG對仔豬脾臟指數和腎臟指數也無顯著影響，但添加1.0%OKG使得仔豬脾臟指數以及腎臟指數顯著升高，這與我們前期的研究得出的1.0%OKG可提高仔豬末重來緩解D-半乳糖所造成的慢性氧化應激的結果[16]相符，這在一定程度上說明1.0%OKG可以促進仔豬脾臟和腎臟的生長。

3.3 OKG對由D-半乳糖導致的慢性氧化應激仔豬腸道形態的影響

營養物質經胃初步消化后，主要通過小腸消化吸收[24]，所以小腸黏膜形態結構可以直接反映動物機體的健康狀況以及對營養物質消化吸收能力的強弱。小腸絨毛越高，隱窩越淺，絨毛高度與隱窩深度的比值越大，說明吸收面積越大，功能越好。本試驗結果表明，在D-半乳糖應激狀態下，飼糧中添加0.5%OKG的仔豬空腸絨毛高度顯著提升，飼糧中添加1.0%和2.0%OKG的仔豬回腸隱窩深度降低。這在一定程度上說明OKG能夠改善應激仔豬的腸道黏膜損傷，從而提高仔豬腸道在應激狀態下的吸收功能。但飼糧中添加0.5%OKG的仔豬回腸絨毛高度與隱窩深度的比值顯著低于正常仔豬，加上在D-半乳糖應激下的仔豬回腸絨毛高度與隱窩深度的比值低于正常仔豬，可能是因為劑量不足以達到影響D-半乳糖導致慢性氧化應激下仔豬的回腸的吸收功能，建議進一步細化飼糧中OKG的添加量，研究其對D-半乳糖導致慢性氧化應激仔豬回腸形態結構的影響。

3.4 OKG對由D-半乳糖導致的慢性氧化應激仔豬血清生化指標的影響

血清TP含量與豬的消化吸收以及免疫力有關；ALB是血漿中最主要的蛋白質，用于維持機體營養與滲透壓；血清ALT活性可反映肝臟是否受到損害；血清AST活性可反映心臟和肝臟是否正常運行，高AST活性與心肌梗死、干細胞損傷、肌營養不良以及皮肌炎有關；ALP參與脂肪代謝，其活性可反映機體生長性能；血清UN含量升高主要在于腎臟功能出現故障；血清GLU是機體能量的重要來源，為各種組織、臟器的正常運作提供動力；血清IgG、IgM是機體抗感染免疫過程中重要物質基礎；血清NH3L含量是反映機體肝臟功能的指標。

研究表明AKG可促進體內蛋白質的合成，誘導胰島素和生長激素的分泌[25]，而OKG相較于鳥氨酸和AKG的單獨添加，其能更有效地誘導胰島素和生長激素分泌[14]。另外，D-半乳糖誘導的衰老型小鼠血清IgG、IgM含量降低[26]。本試驗結果表明，飼糧中添加1.0%OKG可使應激仔豬血清TP含量顯著高于正常仔豬，原因可能在于OKG在體內分解為AKG，從而促進蛋白質的合成。飼糧中添加0.5%OKG可使應激仔豬血清ALP活性顯著增加，而D-半乳糖刺激仔豬血清ALP活性降低，ALP活性高低與機體生長性能相關，說明OKG可能通過促進肝臟功能的發揮，進而提高仔豬在應激狀態下的生長性能。飼糧中添加1.0%OKG可使應激仔豬血清IgG、IgM含量顯著增加，添加2.0%OKG可使應激仔豬血清IgM含量顯著增加，D-半乳糖刺激仔豬血清IgG、IgM含量相較于正常仔豬有一定程度上的提升，原因可能在于，仔豬受到D-半乳糖刺激，機體免疫系統迅速產生免疫應答，漿細胞分泌大量IgG和IgM進行防御抵抗，而OKG可能改善腸道應激損傷，促進腸道營養吸收，機體產生的能量也就更多，進而產生更多的IgG和IgM。建議開展后續試驗，進一步細化飼糧中OKG的添加量，以確定緩解仔豬慢性氧化應激的最優值。

4 結 論

① 飼糧中添加D-半乳糖顯著抑制仔豬生長，而添加0.5%OKG可以減輕D-半乳糖所造成的生長抑制。

② 飼糧中添加1.0%OKG可顯著增加慢性氧化應激仔豬脾臟和腎臟的重量。

③ 飼糧中添加0.5%OKG可顯著提升慢性氧化應激仔豬空腸絨毛高度，添加1.0%和2.0%OKG可降低回腸隱窩深度。

④ 飼糧中添加0.5%OKG可顯著增加慢性氧化應激仔豬血清ALP活性，添加1.0%OKG可顯著增加血清TP、IgG、IgM含量，添加2.0%OKG可顯著增加血清IgM含量。

⑤ 綜合上述結果可知，OKG可以減輕D-半乳糖導致的仔豬生長抑制，通過促進脾臟和腎臟生長，改善小腸黏膜形態結構，提高血清TP、IgG和IgM含量與ALP活性，從而緩解D-半乳糖造成的仔豬慢性氧化應激。同時，綜合各項指標可以確定0.5%OKG對于緩解D-半乳糖導致的仔豬慢性氧化應激具有較好的效果。