表皮生長因子信號調控隱窩-絨毛軸更新和再生的研究進展

謝文文 劉振華 張得香 王修啟

(華南農業大學動物科學學院，廣東省動物營養調控重點實驗室，國家生豬種業工程技術研究中心，廣州 510642)

腸上皮由大量重復的隱窩-絨毛軸單元組成，其更新和再生依賴于腸道干細胞(intestinal stem cell，ISC)持續的增殖和分化[1-2]。ISC位于隱窩基底部，受隱窩及其周邊細胞組成的生態位提供的包括表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)在內的多種信號的調控[3-4]。此外，腸內營養素，包括谷氨酸(glutamate，Glu)和谷氨酰胺(glutamine，Gln)等功能性營養素，也可通表皮生長因子受體(epithelial growth factor receptor，EGFR)加速ISC分裂，從而促進腸上皮發育，改善腸道健康[5-7]。隨著類腸團培養技術的建立，ISC生態位成分和功能被深入剖析。借助重組菌表達EGF等生長因子，可能為新型飼料添加劑的開發和畜禽生產效率的提升提供新思路。

1 EGF信號與ISC生態位

ISC生態位由隱窩中的潘氏細胞、鄰近隱窩的腸間質細胞和上皮下成纖維細胞等組成[8]。這些細胞不僅在隱窩基底部產生細胞外基質蛋白以固定ISC，而且通過提供EGF、Wnt、Notch和骨形成蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)等信號協同調節ISC的增殖和分化過程[9-11]。將ISC或含有干細胞的隱窩放在含有EGF、R-spondin 1(Wnt信號增強劑)和Noggin(BMP抑制劑)等生長因子的基礎培養基中培養(模擬體內ISC生態位)，或與成纖維細胞共培養的條件下，均能形成具有類似腸上皮結構的類腸團[10]。ISC和潘氏細胞定植在類腸團隱窩狀出芽頂部，而ISC的子細胞——短暫擴增細胞(transient amplifying cell，TA細胞)則延伸匯入由腸吸收細胞、杯狀細胞和腸內分泌細胞等組成的類似腸絨毛的中央空腔中[12-13]。

ISC生態位中EGF主要由潘氏細胞產生，此外，上皮下成纖維細胞衍生的胞外囊泡(extracellular vesicles，EV)也能傳遞EGF[14-15]。EGF通過與ISC膜上受體EGFR結合，激活其下游的信號網絡，從而刺激ISC增殖，抑制其凋亡[16-19]。

2 ISC生態位中EGF信號的轉導

EGF對ISC的調控作用主要是通過與EGFR相互作用實現的[20]。當EGF與跨膜EGFR的胞外區結合后，導致后者構象改變，形成催化活性不對稱的受體二聚體[16,21-23]。此時，EGFR胞內區C末端的3個酪氨酸殘基發生磷酸化，誘導受體酪氨酸激酶活化，從而使得耦聯酪氨酸磷酸化的接頭蛋白質SHC(含有SH2結構域的蛋白質)和生長因子受體結合蛋白質2(growth factor receptor-bound protein 2，GRB2)在受體周圍聚集。隨后，一種雙特異性鳥苷酸交換因子(son of sevenless，SOS)與GRB2結合，激活錨定在膜上的小GTP結合蛋白(RAS)，進而誘導絲/蘇氨酸蛋白激酶(serine/threonine protein kinase，RAF)活化；最終通過絲裂原活化蛋白激酶的激酶(mitogen-activated protein kinase kinase，MEK)磷酸化細胞外信號調節激酶1/2(extracellular regulated protein kinases 1/2，ERK1/2)，促使其轉位到核內，介導轉錄激活因子ETS樣蛋白質1(ETS-like 1 transcription factor，Elk-1)和原癌基因c-fos等轉錄因子的活化[24-28]，提高基因表達水平。同時，具有磷酸化酪氨酸殘基的EGFR可募集磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidy-linositol 3-kinases，PI3K)的調節亞基p85，直接激活PI3K的催化亞單位p110，或通過RAS與p110結合而使后者激活。被活化的p110磷酸化磷酸肌醇(inositol phosphate，PI)肌糖環上的D3位點，從而將底物磷脂酰肌醇4,5-二磷酸(phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate，PIP2)轉化為磷脂酰肌醇(3,4,5)-三磷酸(phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate，PIP3)[26,29]。PIP3作為第二信使，與3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1(3-phosphoinositide dependent kinase 1，PDK1)和蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)結合，促使PDK1磷酸化Akt蛋白308位的絲氨酸殘基位點，引起Akt的活化。被活化的Akt通過磷酸化作用抑制其下游靶蛋白——結節性硬化1/2(tuberous sclerosis 1/2，TSC1/2)和糖原合酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β，GSK3β)等，從而激活哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合體1(mammalian target of rapamycin complex 1，mTORC1)和Wnt/β-連環蛋白(β-catenin)信號通路(圖1)，促進ISC增殖分化[26-27,30]。

3 EGF信號調控ISC增殖和分化

EGF信號主要在隱窩區和TA細胞區中表達，其信號強度沿小腸隱窩絨毛軸向上衰減[31]。EGF信號促進ISC有絲分裂，并通過調節Wnt信號誘導ISC向潘氏細胞分化，而潘氏細胞又會分泌EGF促進ISC自更新、增殖和分化，由此形成一種正反饋機制。研究表明，EGFR基因缺失或用其抑制劑Tyrphostin處理小鼠會顯著抑制ISC增殖和隱窩分裂[32]；相反，在應激條件下，EGFR的激活有助于損傷后的ISC再生和隱窩分裂，從而加速傷口愈合和屏障功能重建[33-36]。體外試驗同樣發現，阻斷類腸團中的EGF信號會導致具有增殖分化活性的ISC進入靜息狀態，類腸團停止生長；一旦恢復EGF信號，ISC重新進入增殖狀態，驅動類腸團形成隱窩樣芽狀結構[27]。此外，EGF信號還能激活mTORC1，誘導吸收型細胞和分泌型細胞的終末成熟[37-38]。Chen等[39]研究發現，斷奶應激會激活促腎上腺皮質激素釋放因子(coforticotrophin-releasing factor，CRF)，促使ISC向未成熟杯狀細胞和腸吸收細胞分化，而斷奶后EGF的缺乏則抑制了杯狀細胞成熟因子的表達，導致杯狀細胞處于未成熟狀態。成熟的杯狀細胞可分泌三葉因子3(trefoil factor 3，TFF3)，其與膜上Nogo結合蛋白2(Nogo-interaction protein 2，LINGO2)結合，釋放EGFR，增強了EGF信號傳導，抑制細胞凋亡，促進ISC再生[40]。同樣，具有保護分化細胞穩定作用的腸上皮細胞硫酸乙酰肝素(heparan sulfate，HS)耗竭會引起細胞死亡，這一過程會反饋調節EGF的表達，進而促進ISC的增殖和分化，以維持完整的腸上皮結構[41]。Ye等[42]將間充質干細胞誘導轉變為ISC樣細胞，這些細胞再經EGF誘導后可分化為腸上皮細胞，進而緩解葡聚糖硫酸鈉誘導的結腸炎。

然而，不同情況下，EGFR介導下游信號不盡相同。Xiang等[43]在果蠅上的研究證實，PI3K/雷帕霉素靶蛋白(TOR)信號對于腸道穩態是必需的，但是當腸道上皮損傷后，EGFR/RAS/MEK信號會以一種獨立于PI3K/TOR信號的機制觸發果蠅ISC產生中間過渡型細胞(enteroblasts，EBs；哺乳動物中又稱TA細胞)以及腸上皮細胞(enterocytes，ECs)，從而修復腸道損傷。Zhang等[44]進一步揭示細胞分裂周期蛋白42(cell division control 42，Cdc42)與EGFR結合是EGF刺激受體介導的內吞作用所必需的，并且能促進MEK下游的絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號轉導，在小鼠ISC中高表達Cdc42變異體2能促進損傷后的腸道再生，提示上調Cdc42/EGFR/MAPK信號能夠啟動對腸上皮的保護性應答。而在小鼠急性炎癥過程中，ISC中PI3K/Akt信號下調導致β-catenin水平降低，隱窩細胞增殖受限[45]。這些結果說明，應激狀態下會存在不同的EGF信號應答機制以驅動ISC有絲分裂。

EGF：表皮生長因子 epidermal growth factor；EGFR：表皮生長因子受體 epidermal growth factor receptor；GRB2：生長因子受體結合蛋白質2 growth factor receptor-bound protein 2；SOS：鳥苷酸交換因子 son of sevenless；RAS：小GTP結合蛋白 small GTP binding protein；RAF：絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶 serine/threonine protein kinase；MEK：絲裂原活化蛋白激酶的激酶 mitogen-activated protein kinase kinase；ERK1/2：細胞外信號調節激酶1/2 extracellular regulated protein kinases 1/2；Elk1：轉錄激活因子ETS樣蛋白質1 ETS-like 1 transcription factor；c-fos：原癌基因c-fos；p85：PI3K的調節亞基 regulatory subunit of PI3K；p110：PI3K的催化亞基 catalytic subunit of PI3K；PI3K：磷脂酰肌醇3-激酶 phosphatidy-linositol 3-kinases；PIP2：磷脂酰肌醇4,5-二磷酸 phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate；PIP3：磷脂酰肌醇(3,4,5)-三磷酸 phosphatidylinositol(3,4,5)-trisphosphate；PDK1：3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1 3-phosphoinositide dependent kinase 1；Akt：蛋白激酶B protein kinase B；TSC1/2：結節性硬化1/2 tuberous sclerosis 1/2；GSK3β：糖原合酶激酶 3β glycogen synthase kinase 3β；mTORC1：哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合體1 mammalian target of rapamycin complex 1；β-catenin：β-連環蛋白；+4 cell：+4位干細胞；Paneth cell：潘氏細胞；crypt base columnar cell：隱窩基部柱狀細胞；transit amplifying cell：短暫擴增細胞；goblet cell：杯狀細胞；myofibroblast：肌成纖維細胞；Noggin：BMP抑制劑 BMP inhibitor。箭頭表示激活，圓點表示抑制 the arrow indicates activation and the dot indicates inhibition。

4 EGF信號調節腸上皮結構和功能完整性

4.1 EGF促進腸上皮發育

EGF能促進腸細胞增殖分化，改善腸道結構。研究表明，飼糧中添加200 μg/kg EGF，14 d時能顯著提高斷奶仔豬小腸中段絨毛高度和隱窩深度[46-47]。Cheung等[48]給19～21日齡斷奶小鼠連續灌胃50 μg/kg BW的EGF 9 d，發現不僅十二指腸、空腸和回腸絨毛高度顯著增加，而且增殖細胞標志物——增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)陽性細胞比例明顯上升。Wang等[49-50]同樣發現，21日齡斷奶仔豬連續采食含60 μg/kg BW EGF的飼糧21 d或在大鼠飲食中添加50 g/kg BW的EGF 15 d，均顯著增加了小腸總蛋白、DNA和RNA含量，促進腸道上皮細胞的增殖。EGF還可通過“母子一體化”促進胎兒腸道發育。Cellini等[51]在母兔妊娠期的第24天，利用微滲透泵連續7 d往羊膜注入300 μg/kg EGF，發現宮內發育遲緩胎兒的小腸絨毛高度和5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-bromodeoxyuridine，BrdU)陽性小腸隱窩細胞均接近正常胎兒的水平。此外，飼糧中添加200 μg/kg BW的EGF還能增加斷奶仔豬小腸杯狀細胞數和內分泌細胞數量，提高溶菌酶mRNA和蛋白質表達水平，提示EGF促進ISC向分泌型腸細胞分化[52]。

EGF主要通過提高消化酶的活性及營養物質轉運蛋白的表達，促進腸上皮對營養物質的吸收。大量研究表明，EGF能增強仔豬小腸(尤其是空腸)乳糖酶、蔗糖酶、麥芽糖酶、堿性磷酸酶的mRNA表達[53-55]。同時，EGF還能促進腸上皮細胞對葡萄糖和氨基酸的吸收。Xu等[56]和王定越[57]研究表明，灌服1.8 μg/mL的EGF 100 mL顯著提高了仔豬小腸鈉/葡萄糖協同轉運蛋白1(sodium/glucose cotransporter 1，SGLT1)、葡萄糖轉運蛋白2(glucose transporter 2，GLUT2)和寡肽轉運蛋白1(peptide transporter 1，PEPT1)的表達。黃騫等[58]用100 μg/L EGF處理Caco-2細胞發現，主要負責轉運腸腔內Gln、丙氨酸(alanine，Ala)、絲氨酸(serine，Ser)和半胱氨酸(cysteine，Cys)等中性氨基酸的Na+-依賴性中性氨基酸載體丙氨酸-絲氨酸-半胱氨酸轉運載體2(alanine-serine-cysteine transporter 2，ASCT2)的mRNA表達水平、轉運蛋白表達水平和轉運活性均顯著提高(表1)。

續表1項目Items劑量和處理時間Dosage and treatment time主要作用和功能Main role and functionCaco-2細胞Caco-2 cells100 μg/L EGF(8 h)轉運腸腔內谷氨酰胺、丙氨酸、絲氨酸和半胱氨酸等中性氨基酸的Na+-依賴性中性氨基酸載體丙氨酸-絲氨酸-半胱氨酸轉運載體2(ASCT2)的mRNA表達水平、轉運蛋白表達水平和轉運活性均顯著提高[57]

EGF具有增強腸道屏障的功能。EGF不僅能通過促進杯狀細胞成熟、分泌黏蛋白形成化學屏障、誘導潘氏細胞生成、分泌防御素和抗菌肽等形成免疫屏障，還能提高腸上皮緊密連接蛋白的表達，建立完善的物理屏障[59-61]。研究表明，EGF能上調結腸炎大鼠回腸中封閉蛋白-3(claudin-3)和咬合蛋白(occludin)的蛋白表達[62]。同時，EGF體外預處理Caco-2細胞可通過提高occludin、閉合小環蛋白-1(zonula occludens protein-1，ZO-1)、上皮型鈣黏蛋白(E-cadherin)和β-catenin的表達和分布，逆轉乙醛引起的單層細胞跨膜電阻值降低和菊糖通透性增加，且該過程依賴ERK1/2的活性，而不依賴于MAPK的活性[63]。

4.2 EGFR整合氨基酸信號促進隱窩-絨毛軸更新

腸腔中的營養素與腸細胞密切接觸，并通過EGF信號調節ISC功能，維持腸上皮的完整性[64]。Glu及與Glu代謝有關的Gln被認為是小腸黏膜的主要能量來源，研究表明，飼糧來源98%的Glu和66%的Gln在腸道被分解代謝。它們不僅為黏膜提供能量，也是細胞蛋白質和核酸物質等合成的前體和促進劑，對維持黏膜的正常形態、結構和功能具有重要作用[65]。Glu缺乏顯著抑制腸上皮細胞增殖和腸上皮發育。Deng等[66]發現，在果蠅飼糧中添加Glu可提高ISC活性。本課題組研究發現，胞外Glu通過EGFR/MEK/ERK和胰島素受體(IR)/PI3K/Akt通路激活mTORC1信號，增加仔豬ISC活性，促進隱窩-絨毛軸更新[5,67]。雖然，分子對接預測EGFR可能是胞外Glu的潛在感應體，然而Glu如何激活EGFR還需要進一步的驗證。與Glu作用類似，在培養基中加入Gln能激活mTORC1信號通路，促進類腸團出芽，而Gln缺乏會導致類腸團萎縮，增殖細胞數量減少[68]。Momcilovic等[69]研究發現，Gln通過EGFR依賴的方式防止乙醛誘導的小鼠腸道損傷，該過程需要EGFR的胞外配體結合域，然而Gln與EGFR的結合同樣需要進一步證實。

5 小結與展望

EGF信號是ISC生態位網絡的重要組成部分，其通過調控ISC增殖和分化驅動腸上皮細胞更新和再生。外源供給EGF或靶向EGF信號的營養素可能是調節動物腸道健康的一個新策略。然而，目前對EGF信號的研究多集中在細胞水平及果蠅和小鼠等少數幾種模式生物上。在家畜，尤其是家禽上的研究較少，而且各生長因子和營養素缺少精準的劑量學和互作效應的研究，EGF信號如何整合所有信息，并將信息有序傳遞至各細胞器尚不清楚。因此，如何將現有的研究成果應用于動物生產以及醫療和保健仍需進一步探討。借助類腸團，并結合成簇的規律間隔的短回文重復序列(CRISPR)/成簇的規律間隔的短回文重復序列相關蛋白9(Cas9)基因編輯、微流控和顯微注射等技術，充分解析EGF信號及其與其他信號協同調控ISC增殖和分化的機制，將有助于構建基于EGF信號的傳導體系，或是逐步實現其應用的前景。