奶牛乳腺退化及其營養調控研究進展

黃國灝 陳俊材,2,3* 董國忠,3

(1.西南大學動物科學技術學院，重慶 400715；2.西南大學生物飼料與分子營養實驗室，重慶 400715；3.重慶市草食動物資源保護與利用工程技術研究中心，重慶 400715)

奶牛通常在分娩前大約60 d進行干奶，這2個月左右的非泌乳期被稱作干奶期。干奶期可使奶牛乳腺在長期泌乳后進行修復和更新，為下一個泌乳周期做好準備。奶牛干奶期的第1階段，也是最重要的階段之一是乳腺的退化。奶牛乳腺退化是指乳腺腺體由泌乳狀態恢復到非泌乳狀態的過程。乳腺退化可以分為3種類型：漸進性退化、衰老性退化和主動性退化。漸進性退化是指正常泌乳過程中泌乳功能的倒退，衰老性退化發生在泌乳動物生命的末期，而主動性退化是指在停止擠奶后乳腺中發生退化的過程[1]。奶牛乳腺在干奶后發生的退化屬于典型的主動性退化[2]。長久以來，奶牛乳腺的相關研究主要集中于泌乳期，而對干奶期奶牛乳腺的研究相對較少。近幾年，越來越多的學者開始關注于奶牛干奶期乳腺退化的調控，這主要是因為促進奶牛干奶期乳腺的退化一方面可以提高干奶初期乳腺對細菌感染的抵抗力，另一方面可能提高短干奶期(30 d左右)奶牛在下一個泌乳周期的泌乳量。本文旨在對奶牛乳腺退化的相關機制和乳腺退化營養調控最新研究進展進行綜述，以期為現代高產奶牛健康養殖提供新的思路，為未來進一步研究奶牛乳腺退化提供參考。

1 奶牛乳腺退化概述

奶牛乳腺退化是一個涉及到細胞和組織形態學變化的復雜過程。在奶牛停止擠奶后的24 h內，乳腺上皮細胞內囊泡和脂滴開始累積，細胞器發生退化，如內質網開始縮小，高爾基體變的不可辨認，乳汁的合成和分泌能力顯著降低，不過部分細胞依然保持著分泌乳鐵蛋白的能力[3]。隨著乳汁的累積，乳腺內相關促凋亡因子[如轉化生長因子-β(TGF-β)]的濃度和乳腺上皮細胞所承受的物理張力開始上升，啟動乳腺上皮細胞的凋亡過程[4]。細胞凋亡率在干奶后72 h左右達到最大值，凋亡的細胞和乳腺內殘留的乳汁主要由巨噬細胞和部分乳腺上皮細胞通過吞噬作用，在溶酶體中進行分解[5]。隨后細胞增殖率逐漸上升，并且在干奶后期達到最大值，完成乳腺組織的更新。在整個乳腺退化期間，奶牛乳腺上皮細胞的總數變化不大，因此又被稱為“再生退化”[2]。奶牛乳腺退化的另一個特征是乳腺細胞間通透性增加，所以乳腺分泌物中血液來源成分[如牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)]的濃度升高[6]。綜上所述，乳腺退化初期主要以乳腺上皮細胞乳成分合成能力下降、細胞凋亡增加、細胞間通透性增加為主要特征。

奶牛在干奶后的1周內，乳腺的上皮組織和基質組織的比例出現顯著變化。盡管其小葉腺泡結構在退化期間基本保持完整，但是管腔部分開始萎縮、間質部分所占比例升高。在干奶開始后21 d左右，大部分乳腺上皮細胞進入非分泌狀態[7]。奶牛的乳腺組織退化后不會恢復到妊娠之前的狀態，因為奶牛的干奶期通常處于妊娠末期，促進乳腺發育及泌乳的激素和信號抑制了乳腺的完全退化。Murney等[8]選擇泌乳中期的放牧奶牛模擬奶牛泌乳末期的干奶過程，發現在干奶7 d后重新恢復擠奶，奶牛的產奶量幾乎不受影響；但是在干奶14或21 d后重新恢復擠奶，奶牛的產奶量不能恢復到干奶之前。因此，奶牛的乳腺退化具有條件性可逆的特點。

奶牛的乳腺退化和更新十分重要，若乳腺退化和更新受到影響，下一個泌乳周期的產奶性能就會受到影響。Van Knegsel等[9]研究發現，與傳統60 d干奶期奶牛相比，縮短干奶期至30 d會抑制奶牛乳腺退化和更新，導致下一泌乳周期泌乳量顯著降低。這可能有2個方面的原因：一是干奶時的產奶量更低，乳腺內積累的乳汁對乳腺細胞造成的物理張力更低；二是干奶時間更接近分娩，乳腺受到妊娠末期激素的影響更大[10]。Annen等[11]發現未進行干奶的奶牛不能夠有效的對乳腺衰老細胞進行更新和修復，在下一個泌乳周期中，乳腺組織中會含有大量休眠的乳腺腺泡，產奶量顯著下降。

2 奶牛乳腺退化標志物

在奶牛乳腺退化的研究中，如何衡量奶牛乳腺退化程度是研究的關鍵點之一。常用的乳腺退化標志物也和乳腺退化的主要特征密切相關。在干奶前，乳汁中含有大量的乳脂、酪蛋白、α-乳清蛋白、β-乳球蛋白和很少量的乳鐵蛋白，隨著乳腺終末導管網絡的解體，乳腺上皮細胞合成乳糖、乳脂、酪蛋白、α-乳清蛋白和β-乳球蛋白的能力下降，乳腺分泌物中的乳鐵蛋白濃度顯著升高[1,12]。此外，檸檬酸鹽濃度在泌乳期間相對較高，在干奶后的2周內大幅降低[6,13]，檸檬酸鹽濃度的變化能夠反映乳腺上皮細胞的活動水平。因此，乳腺分泌物中乳鐵蛋白和檸檬酸鹽的濃度可以用來較好地衡量奶牛乳腺退化程度[13]。

研究發現，在干奶后3 d內，乳腺分泌物中的白細胞數量快速升高，隨后巨噬細胞浸潤增加，二者主要功能是清除乳腺中酪蛋白膠粒、乳脂滴和細胞碎片等[3,13]。同時，乳腺上皮細胞凋亡率上升，更多的乳腺上皮細胞凋亡脫落。所以乳腺退化最常用的標記物之一就是乳腺分泌物中的體細胞數(somatic cell count，SCC)，SCC的升高至少持續到干奶后10～14 d[13-14]。但是與泌乳期不同，干奶期SCC的升高主要是由于乳腺退化造成的，并不一定意味著乳腺炎的發生。

在泌乳期間，乳腺緊密連接在乳汁和間質液之間，形成高度不滲透的屏障，乳腺上皮可以維持其離子梯度。在干奶后，乳腺緊密連接通透性增加，導致乳鐵蛋白、血清蛋白和免疫球蛋白等血源性蛋白進入管腔，其在乳腺分泌物中的濃度迅速增加[15]。間質液中高濃度的鈉離子(Na+)和氯離子(Cl-)也隨著緊密連接通透性的增加而進入乳腺分泌物中，同時乳腺分泌物中的鉀離子(K+)濃度降低[16]。通過分析乳腺分泌物中的乳鐵蛋白、血清蛋白濃度和Na+/K+比值都可以很好地反映奶牛乳腺的退化程度。

除此之外，基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMP)主要負責降解胞外基質和基膜[17]，其活性在乳腺退化過程中顯著升高，多篇研究也通過檢測乳腺分泌物中的MMP活性來反映乳腺的退化程度[6,18]。

3 奶牛乳腺退化機理

奶牛的乳腺退化是一個多階段多因素的復雜生理過程，涉及到多條不同的信號通路及其之間的相互作用，目前有研究表明轉化生長因子-β1(TGF-β1)/Smad和酪氨酸激酶(JAK)/信號傳導與轉錄激活因子3(STAT3)2條信號通路在乳腺退化中扮演著重要角色(圖1)。

Milk stasis：乳汁淤積；IL-6：白細胞介素-6 interleukin-6；LIF：白血病抑制因子 leukemia inhibitory factor；gp130：IL-6家族細胞因子受體共同的信號傳導亞單位 common signal transduction subunit of IL-6 family cytokine receptor；LIFR：白血病抑制因子受體 leukemia inhibitory factor receptor；TGF-β1：轉化生長因子-β1 transforming growth factor-β1；TβRⅠ dimer：TGF-β受體Ⅰ transforming growth factor-β receptor Ⅰ；TβRⅡ dimer：TGF-β受體Ⅱ transforming growth factor-β receptor Ⅱ；JAK1：酪氨酸激酶1 Janus kinase 1；P：磷酸基團 phosphate group；STAT3：信號傳導與轉錄激活因子3 signal transducer and activator of transcription 3；Smad2/3：Smad蛋白2/3復合物 Smad protein 2/3 compound；Smad4：Smad蛋白4 Smad protein 4；Smad2/3/4：Smad蛋白2/3/4復合物 Smad protein 2/3/4 compound；Nucleus：細胞核；Caspase-3：半胱氨酸蛋白酶-3 cysteine aspirate protease-3；Zonula occluden-1：緊密連接蛋白-1；E-cadherin：上皮鈣黏蛋白 epithelial cadherin；β-catenin：β-連環蛋白；IGFBP-5：胰島素樣生長因子結合蛋白-5 insulin like growth factor binding protein-5；Bcl-2：B淋巴細胞瘤-2基因 B-cell lymphoma-2；PI-3K-Akt：磷酸肌醇-3激酶-蛋白激酶B phosphatidylin-ositol-3-kinase-protein kinase B；p55α、p50α：磷酸肌醇-3激酶調節亞單位 phosphatidylin-ositol-3-kinase regulatory subunit。↑：表達量增高 expression level increased；↓：表達量降低 expression level decreased。

3.1 TGF-β1/Smad信號通路

TGF-β1誘導的奶牛乳腺上皮細胞凋亡和自噬在牛乳腺退化中發揮關鍵作用[20]。Mitz等[19]發現TGF-β1通過絲氨酸/蘇氨酸激酶受體異四聚體傳遞信號，該異四聚體由轉化生長因子-β受體Ⅰ(transforming growth factor-β receptor Ⅰ，TβRⅠ)和轉化生長因子-β受體Ⅱ(transforming growth factor-β receptor Ⅱ，TβRⅡ)組成。TGF-β1配體對TβRⅡ具有較高的親和力，它們結合后活化TβRⅡ，活化的TβRⅡ募集并結合TβRⅠ，組成四聚體受體復合物。該復合物進而活化下游的R-Smads，包括Smad2和Smad3。這些R-Smads與Co-Smads中的Smad4結合形成復合物，進入細胞核與其他轉錄元件結合調節基因轉錄[19]。只有在Ⅰ型和Ⅱ型受體在細胞膜共同表達的情況下，才能使細胞外信號轉導至細胞內，進而與相關轉錄因子發生作用。

Kolek等[21]發現，在牛乳腺上皮細胞中TGF-β1通過激活Smad途徑誘導細胞生長停滯和凋亡。Zarzyńska等[22]通過體外培養試驗發現，TGF-β1的表達與奶牛乳腺上皮細胞凋亡呈正相關。Heshuang等[23]在TGF-β1處理奶牛乳腺上皮細胞后0.5～2.0 h內，Smad2/3磷酸化水平升高，細胞內游離鈣離子(Ca2+)濃度顯著升高，半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)被激活，DNA被裂解，進而引起細胞凋亡。同樣，Zarzyńska等[24]通過比較干奶期和泌乳期乳腺組織，發現干奶期奶牛乳腺組織中的細胞凋亡指標Caspase-3表達量顯著升高，TGF-β1和TβRⅡ表達量也顯著升高。

目前在嚙齒類動物上的研究表明，TGF-β1還可以使乳腺上皮細胞間緊密連接通透性增加，降低上皮細胞的緊密連接蛋白-1(zonula occluden-1，ZO-1)和上皮鈣黏蛋白(epithelial cadherin，E-cadherin)的表達量[25-26]，引起乳腺上皮細胞凋亡[27-28]。不過，在奶牛乳腺退化過程中，TGF-β1的功能以及其是否通過使緊密連接通透性上升而促進乳腺退化仍有待進一步研究。

3.2 JAK/STAT3信號通路

介導乳腺退化的另一個重要信號通路是JAK/STAT3信號通路。JAK是一類非受體酪氨酸激酶，JAK的底物為信號傳導與轉錄激活因子(signal transducer and activator of transcription，STATs)。STAT3是STATs家族的成員之一，該蛋白通過響應相應的細胞因子和生長因子的磷酸化而被激活。

乳腺內乳汁積累會誘導乳腺內白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)[29]和白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF)[30]濃度上升。IL-6可直接與細胞表面的gp130受體結合形成二聚體，而LIF與白血病抑制因子受體(LIFR)蛋白先結合形成二聚體，然后再與gp130受體結合形成三聚體[14,31]。形成的二聚體和三聚體激活并磷酸化JAK，這些磷酸化的位點成為帶有SH2功能域(src homology 2，SH2)結構的STAT蛋白和接頭蛋白的結合位置。STAT3在C末端附近有由JAK磷酸化的保守酪氨酸殘基。該磷酸酪氨酸通過與保守的SH2結構相互作用導致STAT3的二聚化。磷酸化的STAT3二聚物通過依賴核蛋白相互作用蛋白進入細胞核[32]。

在細胞核中，二聚化的STAT3結合特定的序列調節靶基因的轉錄[33]，調控分化的乳腺上皮細胞凋亡和乳腺組織更新[14,34]。Abell等[35]研究發現，該通路可通過誘導磷酸肌醇-3激酶(phosphatidylin-ositol-3-kinase，PI-3K)調節亞基p55α和p50α的表達量升高，進而降低PI-3K-蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)介導的生存信號，從而調節細胞凋亡。JAK/STAT3信號通路的激活還會引起乳腺組織中胰島素樣生長因子結合蛋白-5(insulin like growth factor binding protein-5，IGFBP-5)的表達量升高。IGFBP-5表達量的升高引起抗凋亡蛋白B淋巴細胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)表達量下降，促進細胞凋亡。

4 奶牛乳腺退化的營養調控

近年來，越來越多的研究嘗試促進干奶期奶牛乳腺的退化。現代高產奶牛在干奶時通常有超過20 kg/d的產奶量，在停止擠奶后乳汁容易滲出，病原菌更容易侵入乳腺，發生乳腺內感染(intramammary infections，IMI)[36]。Gott等[37]報道，初產奶牛在干奶時發生IMI的概率為19.3%，經產奶牛在干奶時發生IMI的概率為7.7%。但乳腺退化完成后，乳腺抵抗IMI的能力會快速上升[3]。此外，一些發達國家嘗試將傳統的60 d干奶期縮短至30 d以改善高產奶牛的健康狀況，延長生產壽命，節約飼養成本，提高生產效益[38-40]。但是縮短干奶期會抑制干奶初期乳腺退化，降低奶牛在下一個泌乳周期產奶量，阻礙其推廣和應用。所以降低干奶時的泌乳量和促進干奶初期乳腺退化對于降低干奶期IMI及短干奶期的應用推廣都有積極的意義。

4.1 營養限制

在干奶前期降低奶牛營養水平可促進乳腺退化，降低產奶量。Ollier等[41]對干奶前5 d的奶牛只飼喂干草，發現其產奶量和BSA濃度降低，乳腺分泌物中Na+/K+比值升高，檸檬酸鹽和乳鐵蛋白的濃度降低，說明營養限制加速了乳腺退化。Wang等[42]通過飼喂泌乳中期奶牛稻草或者苜蓿，發現飼喂稻草降低了閉合蛋白的表達量，同時增加了細胞凋亡相關基因的表達量，增加了牛奶中的Na+/K+比值、BSA濃度和血纖維蛋白溶酶活性，以上結果表明營養限制增加了奶牛乳腺緊密連接的通透性，增加了乳腺上皮細胞凋亡率。不過，干奶期降低營養供給雖然能夠降低產奶量、促進乳腺退化，但會導致能量負平衡的發生。Ollier等[41]和Odensten等[43]發現，與對照組相比，干奶前5 d飼喂稻草顯著提高了奶牛血液中的游離脂肪酸(free fatty acids，FFA)和β-羥丁酸濃度，降低了血液中胰島素和葡萄糖濃度。FFA濃度過高會抑制外周血單核細胞的增殖和抗炎因子白細胞介素-4(interleukin-4，IL-4)的分泌[44-45]，引起免疫抑制。Olller等[46]通過細菌試驗測試奶牛干奶前5 d飼喂干草是否影響乳腺內感染的敏感性，并沒有發現干草組和對照組在細菌計數和感染率有所差異。所以在干奶期通過營養限制促進乳腺退化所產生的正面效應可能會因為能量負平衡的發生而消失。

4.2 乳腺局部營養調控

多項研究表明，在奶牛干奶時，可直接向奶牛乳腺中灌注促乳腺退化物質，調控乳腺局部營養供給，加速奶牛乳腺的退化[3, 47]。酪蛋白水解物(casein hydrolysate，CNH)是酪蛋白在特異性內切酶及其他類似的條件下被水解后具有生物活性的酪蛋白生物活性肽以及小分子肽和游離氨基酸[48]。Ponchon等[18]將CNH注入奶牛乳腺發現，奶牛產奶量下降，乳中Na+和BSA的濃度增加，K+和乳糖的濃度降低，表明乳腺灌注CNH可以增加乳腺緊密連接通透性，加速乳腺退化。CNH促進奶牛乳腺退化的機理可能是因為CNH中含有右磷絲氨酸殘基，可阻斷位于奶牛乳腺上皮細胞中K+通道或者降低細胞外的Ca2+濃度[16]，改變上皮細胞緊密連接的通透性，影響乳腺上皮細胞的分泌活性[49]。

乳糖是牛奶中主要的滲透分子，可維持牛奶的滲透壓及內環境的穩定。Chedly等[50]發現，將乳糖溶液通過乳腺導管注入乳腺，發現乳中Na+/K+比值和BSA濃度增加。用120 mmo/L乳糖溶液處理乳腺上皮細胞，跨上皮電阻降低，說明乳糖使乳腺上皮細胞間緊密連接通透性增大，推測可能與乳糖的Ca2+螯合作用有關，造成緊密連接蛋白表達降低，影響緊密連接通透性。

5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)是色氨酸羥化后脫羧形成的一種抑制性神經遞質，廣泛存在于哺乳動物組織中。乳腺內的5-HT被認為具有調節乳腺動態平衡和加速乳腺退化過程的作用[51-54]。Hernandez等[55]利用選擇性5-HT再攝取抑制劑(selective serotonin reuptake inhibitor，SSRI)提高乳腺內5-HT濃度，增加了乳腺緊密連接通透性，抑制了乳蛋白基因的表達，提高了細胞凋亡相關基因的表達，降低了產奶量，表明5-HT能夠加速乳腺退化[56]。

殼聚糖是一種從甲殼素中提取的天然多糖，在自然界儲量僅次于纖維素，為第二大天然高分子多糖[57]。Lanctot等[58]通過奶牛乳腺導管灌注殼聚糖水凝膠，發現與對照組相比乳腺分泌物中SCC、BSA和乳鐵蛋白濃度以及乳酸脫氫酶活性顯著升高，表明乳腺灌注殼聚糖水凝膠可以加速乳腺退化，破壞了乳腺內緊密連接的完整性，改變了細胞的分泌狀態，從而加速乳腺退化過程。除此之外，Yeh等[59]也報道表明殼聚糖具有改變動物體內組織緊密連接的作用。

4.3 其他營養調控

還有一些其他的營養因素也可調控乳腺上皮細胞的凋亡，具有促進奶牛乳腺退化的潛力。Puvogel等[60]研究發現，奶牛補充大量維生素A降低了圍產期血漿中視黃醇濃度，增加初乳中視黃醇濃度，提高了乳腺上皮細胞凋亡率。另外，環甘氨酸脯氨酸二肽(cyclic-glycine-proline，cGP)是胰島素樣生長因子-1(insulin like growth factor-1，IGF-1)的代謝物，通過調節IGF-1的生物利用度，維持IGF-1的正常功能。Singh-Mallah等[61]采用大鼠模型，研究灌服3 mg/kg的cGP對其哺乳期后乳腺生理變化的影響，發現乳腺退化早期灌服cGP可促進乳腺退化，使完整的分泌腺泡能夠更早被清除。因此，是否可以通過提高飼糧中維生素A含量或飼糧中添加cGP來促進奶牛干奶初期乳腺的退化值得進一步研究。

5 小 結

乳腺退化是奶牛干奶期的第1階段，也是其最重要階段之一。促進奶牛乳腺退化可提高干奶初期乳腺對細菌感染的抵抗力，還可能促進短干奶期奶牛的乳腺更新。在乳腺退化中TGF-β1/Smad和JAK/STAT3 2條信號通路在調控乳腺退化過程中起著關鍵作用，但其他相關信號通路是否也參與其中仍值得進一步研究。研究表明，營養限制可促進奶牛乳腺退化，降低干奶前產奶量。除此之外，其他的營養調控手段也具有促進奶牛乳腺退化的潛在的可行性，但還需要未來在大規模的動物試驗中進行驗證。在未來的研究中還可以進一步發掘其他有效的乳腺退化調控方式，并進一步探究乳腺退化調控的相關機制，從而為現代高產奶牛干奶期管理策略的制定提供參考和依據。