發酵火麻仁蛋白粉對HepG2細胞氧化應激損傷的保護作用

李海枝,王曙賓,郭珊珊,于有強,劉義鳳,潘聰,吳逸民,周志橋,夏凱*,李雅麗*

1(中國食品發酵工業研究院有限公司,北京,100015)2(功能主食創制與慢病營養干預北京市重點實驗室,北京,100015)3(漢義生物科技(北京)有限公司,北京,100020)

氧化應激一般是指細胞暴露于高濃度氧分子或氧的化學衍生物而引起的細胞損傷[1]。此時氧自由基通過與蛋白質和脂質以及DNA等生物大分子相互作用,引發DNA片段斷裂、蛋白質功能缺陷以及各種毒性物聚集,同時使機體的氧化防御系統出現變化,最終導致如糖尿病、炎癥以及癌癥等疾病的發生[2-3]。因此,建立氧化應激模型對研究以及篩選抗氧化藥物以及功能性食品都至關重要[4-6]。現階段,利用H2O2建立氧化應激模型最為廣泛[7-9]。而偶氮二異丁基二鹽酸鹽(azodiisobutyl decarbonate,AAPH)是一種小分子偶氮引發劑,也可誘導過氧自由基的生成,進而應用于氧化應激模型的構建[10-11]。

火麻仁是一種優良的膳食性蛋白質來源[12-13],其主要是以麻仁球蛋白和麻仁白蛋白的形式存在。麻仁蛋白中不含有寡聚糖、胰蛋白酶抑制劑等抗營養因子,不會造成蛋白質吸收障礙、反胃等不適癥狀,因此火麻仁蛋白是良好的易消化蛋白的來源。同時,研究發現火麻仁具有鎮痛、抗炎、抗血栓、改善記憶以及抗疲勞等作用,其火麻仁油以及提取物均具有抗氧化和抗衰老的作用[14-17]。因此,利用火麻仁蛋白開發研究食品、藥品、保健產品將具有很廣闊的發展前景。

本研究為提高火麻仁蛋白的吸收特性以及風味,對火麻仁蛋白進行發酵,之后利用AAPH誘導HepG2細胞氧化應激模型探究發酵火麻仁蛋白粉的抗氧化能力,旨在從細胞活力、細胞形態、抗氧化酶活力以及胞內活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平等方面綜合評價該物質,從而為火麻仁功能性食品的開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

HepG2細胞,中國醫學科學院基礎醫學研究所；火麻仁蛋白粉,遼寧俏牌生物科技有限公司；DMEM(Dulbecco’s modified eagle medium)培養基、磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline,PBS),中科邁晨科技有限公司；新生牛血清,美國Gibco；AAPH,Sigma公司；Cell Counting Kit-8(CCK-8)試劑盒、2′,7′-二氯二氫熒光素二乙酸酯(2′,7′-dichlorodi-hydrofluorescein diacetate,DCFH-DA)、胰蛋白酶、RIPA裂解液,碧云天生物技術研究所；BCA蛋白濃度測定試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)試劑盒、丙二醛(malondialdehyde,MDA)試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)試劑盒,南京建成生物工程研究所；TransZol Up裂解液、RNA提取試劑盒,北京全式金生物。

1.2 儀器與設備

生物安全柜,濟南鑫貝西生物技術有限公司；CO2培養箱,松下公司；CKX41型倒置生物顯微鏡,奧林巴斯公司；分析天平,梅特勒-托利多儀器有限公司；Spectra Max酶標儀(i3),MD公司；手持細胞計數器,密理博中國有限公司；實時熒光定量PCR儀,伯樂生命醫學產品有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 發酵火麻仁蛋白粉制備工藝[18-19]

得到的發酵火麻仁蛋白粉用于后續實驗。

1.3.2 發酵火麻仁蛋白粉蛋白質含量測定

參照GB/T 23530—2009《酵母抽提物》進行測定。

1.3.3 HepG2細胞的體外培養

HepG2為貼壁細胞,可將其培養于含有10%新生牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的DMEM培養基中,于37 ℃、5%CO2的培養箱中溫育,取對數期細胞進行實驗。

1.3.4 HepG2細胞氧化應激模型構建[20]

1.3.4.1 AAPH的CCK-8細胞毒理學實驗

取96孔細胞培養板,每孔加100 μL細胞懸液,細胞濃度為1.5×105個/mL,37 ℃培養24 h后棄去培養液,用PBS清洗1次,每孔加入100、200、400、600、800 μmol/L等5個不同濃度的AAPH 100 μL,以無AAPH的相同培養基孵育細胞為對照,培養24 h后每孔加CCK-8溶液于37 ℃避光孵育2 h,用酶標儀測定吸光度值。

1.3.4.2 氧化應激細胞模型的構建

選取對細胞生長無顯著影響的AAPH濃度誘導氧化應激細胞模型,各組細胞加樣處理24 h后,小心棄去培養液,用PBS清洗,加入25 μmol/L的DCFH-DA,避光條件下作用30 min,吸出DCFH-DA用PBS清洗,后加入200 μL的PBS。用酶標儀測定細胞在490 nm波長的激發光下熒光物質2′,7′-二氯熒光素(2′,7′-Dichlorofluorescein，DCF)在535 nm波長下的發射光。

1.3.5 發酵火麻仁蛋白粉對HepG2細胞氧化應激損傷的預保護作用

分別選取10、30、50、100、200 μg/mL等5個不同濃度的發酵火麻仁蛋白粉樣品研究其對HepG2細胞增殖的影響,實驗方法同1.3.4.1。

在建立的氧化應激細胞模型的基礎上觀察發酵火麻仁蛋白粉對氧化應激損傷細胞產生的預保護作用。

將細胞以2×105個/mL濃度接種于6孔板,待細胞貼壁生長后,用PBS潤洗細胞,加入不同的處理液。對照組為無酚紅的純培養基；模型組為添加AAPH組；試驗組為將AAPH與發酵火麻仁蛋白粉溶液混合(發酵火麻仁蛋白粉終質量濃度10～30 mg/mL)。細胞上樣后37 ℃孵育24 h,測定各組的SOD、ROS、MDA、GSH-Px。SOD、MDA、GSH-Px測定方法按照試劑盒說明書[23-24]；ROS測定方法同1.3.4.2。

1.3.6 發酵火麻仁蛋白粉對HepG2細胞抗氧化相關基因的影響

細胞處理過程同1.3.4.2。清洗樣品處理后的細胞,每10 cm2生長的培養細胞中加入1 mL的TransZol Up,采用全式金總RNA提取試劑盒提取,得到細胞總RNA后,根據試劑盒配制體系。

基因定量分析采用全式金TransScript Probe One-Step qRT-PCR SuperMix試劑盒。PCR反應條件為：45 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s,94 ℃ 5 s；60 ℃ 1 min,循環40次；PCR擴增完畢后,對其進行半定量分析。引物序列見表1。

表1 引物序列

采用2-△△CT計算基因表達的相對量,具體如下：

△CT=△CT(目的基因)-△CT(內參基因)；

△△CT=△CT(待測樣本)-△CT(校準樣本)；

相對表達量=2-△△CT

1.3.7 統計學處理實驗數據

2 結果與分析

2.1 發酵火麻仁蛋白粉蛋白質含量

根據國標法檢測得到發酵火麻仁蛋白粉蛋白質含量為79%。

2.2 HepG2細胞氧化應激模型

2.2.1 AAPH對HepG2細胞增殖的影響

如圖1所示,由于AAPH對細胞具有一定的損傷作用,隨著AAPH濃度的增加,細胞存活率逐漸下降。當AAPH濃度達到800 μmol/L時顯著抑制細胞生長(P<0.05),因此選擇AAPH濃度100～600 μmol/L進行后續實驗。

圖1 不同AAPH濃度對HepG2細胞活力的影響

2.2.2 AAPH對HepG2細胞ROS的影響

細胞內過量的ROS會損害細胞,導致細胞內還原氧化穩態的改變,發生氧化應激現象,進而對細胞造成氧化損傷[21-22]。因此,細胞內ROS可以直接反映細胞氧化損傷的程度。各組細胞經過處理后所檢測到的細胞內ROS水平如圖2所示。處理24 h后,AAPH濃度越高ROS含量也越高,在800 μmol/L時同對照相比,差異顯著(P<0.05)。結合AAPH對HepG2細胞增殖的影響,AAPH造模濃度最終選擇600 μmol/L。

圖2 不同AAPH濃度對HepG2細胞內ROS的影響

2.3 發酵火麻仁蛋白粉對模型細胞抗氧化活性的影響

2.3.1 發酵火麻仁蛋白粉對HepG2細胞增殖的影響

圖3為發酵火麻仁蛋白粉對HepG2細胞毒性的影響,在質量濃度為10～30 mg/mL時,發酵火麻仁蛋白均不影響HepG2細胞的活力。因此,可選取10～30 μg/mL中的任意濃度用于后續細胞實驗。考慮到發酵火麻仁蛋白粉對氧化應激細胞模型的調節作用可能與劑量有關,因此,后續實驗各組均選擇低劑量(10 mg/mL)、中劑量(20 mg/mL)和高劑量(30 mg/mL)3種濃度。

圖3 不同濃度發酵火麻仁蛋白粉對HepG2細胞活力的影響

2.3.2 發酵火麻仁蛋白粉對HepG2細胞ROS的影響

各組細胞經過處理后所檢測到的細胞內ROS水平如圖4所示。與對照組相比,模型組胞內熒光值顯著升高(P<0.05),約為對照組的1.25倍。說明AAPH可有效提高胞內ROS水平。與模型組相比,發酵火麻仁蛋白粉組細胞內ROS含量顯著降低,且隨著濃度的增加,細胞內ROS含量也逐漸下降,表明發酵火麻仁蛋白粉能顯著降低胞內ROS水平(P<0.05)。

圖4 發酵火麻仁蛋白粉對HepG2細胞內ROS的影響

2.3.3 發酵火麻仁蛋白粉對HepG2細胞SOD的影響

SOD是機體抗氧化的主要酶類之一,SOD活力也是判定化合物抗氧化能力的指標之一[23]。由圖5可知,HepG2細胞在經AAPH作用后,細胞內SOD活力顯著低于對照組(P<0.05)。與模型組細胞相比,發酵火麻仁蛋白粉能夠顯著提高SOD活力,這說明AAPH的造模液能降低HepG2細胞SOD活力,使細胞清除自由基能力下降,最終導致細胞損傷；而發酵火麻仁蛋白粉能夠顯著提高模型細胞SOD的活力,對維持機體細胞內的氧化和抗氧化平衡非常重要,可清除氧自由基,減輕組織細胞的過氧化損傷,且數據表明,發酵火麻仁蛋白粉對提高SOD活力具有濃度依賴性。

圖5 發酵火麻仁蛋白粉對HepG2細胞內SOD的影響

2.3.4 發酵火麻仁蛋白粉對HepG2細胞MDA的影響

當機體受到有害刺激或抵御惡劣環境時所產生的ROS攻擊細胞膜上的不飽和脂肪酸,從而破壞細胞膜結構的完整性。因而,細胞內MDA含量可反映機體內脂質過氧化的程度,進而間接反映細胞氧化損傷程度[24],發酵火麻仁蛋白粉對模型細胞中MDA含量的影響如圖6所示。與對照組相比,模型組細胞內MDA的含量顯著升高(P<0.05),表明模型組細胞產生大量的MDA。與模型組相比,樣品組細胞內MDA的含量顯著下降,說明發酵火麻仁蛋白粉能夠保護細胞抵御氧化損傷。

圖6 發酵火麻仁蛋白粉對HepG2細胞內MDA的影響

2.3.5 發酵火麻仁蛋白粉對HepG2細胞GSH-Px的影響

GSH-Px活力能間接反映機體的氧化應激水平,同時也可以判斷化合物的抗氧化能力。發酵火麻仁蛋白粉對氧化應激HepG2細胞中GSH-Px活力的影響如圖7所示。與對照組相比,模型組細胞內GSH-Px的活力顯著下降(P<0.05),說明AAPH降低細胞內GSH-Px活力,致使細胞的抗氧化能力下降,甚至導致細胞氧化損傷。樣品組在質量濃度為20和30 mg/mL時細胞內GSH-Px活力顯著高于模型組,說明發酵火麻仁蛋白粉能夠通過提高GSH-Px活力保護HepG2細胞抵御氧化損傷。

圖7 不同濃度發酵火麻仁蛋白粉對HepG2細胞內GSH-Px的影響

2.4 氧化應激相關mRNA的表達情況

研究表明,機體內氧化還原水平失衡是眾多疾病的病理生理基礎,因此內源性抗氧化信號通路Keap1-Nrf2在研究機體應對各種外來損傷的防御中起著非常重要的作用[25-26]。Nrf2是一種重要的轉錄因子,通過與ARE結合調節多種抗氧化基因的表達,抵抗氧化應激從而對細胞起到保護作用。Nrf2-ARE通路的下游抗氧化酶包括HO-1、NQO1等,動物及體外細胞實驗均證實,提高Nrf2-ARE通路活性,增加HO-1的表達,可清除氧化物質,對抗氧化應激引起的細胞損傷[27]。圖8為發酵火麻仁蛋白粉對HepG2細胞中Nrf2、HO-1以及NQO1的mRNA表達量的影響。與正常組相比,模型組的Nrf2、HO-1以及NQO1的mRNA均顯著降低,樣品組劑量依賴性顯著增高Nrf2、HO-1以及NQO1的mRNA表達量,說明發酵火麻仁蛋白粉能夠激活Nrf2通路達到抗氧化效果。

圖8 發酵火麻仁蛋白粉對HepG2細胞中Nrf2,HO-1以及NQO1 mRNA表達量的影響

3 結論

本研究在利用AAPH誘導的HepG2細胞損傷模型中證實,發酵火麻仁蛋白粉能夠通過增加SOD、GSH-Px的活力,降低胞內ROS、MDA水平進而改善細胞氧化應激狀態,且與發酵火麻仁蛋白粉濃度呈現出很好的相關性,具有很強的抗氧化作用。實驗進一步研究了發酵火麻仁蛋白粉抗氧化酶基因的表達,證明了發酵火麻仁蛋白粉能夠激活Nrf2通路進而減輕AAPH誘導的HepG2氧化應激損傷作用。

本研究在細胞層次對發酵火麻仁蛋白粉進行探究,證實了其是一種優良的抗氧化物質,為研究預防與抗氧化相關疾病的功能性食品提供理論基礎,同時也為火麻仁蛋白的開發利用奠定了實驗基礎。