固相萃取-高效液相色譜法測定食品中二氫槲皮素

劉桂亮,廉貞霞,公丕學,薛霞,劉艷明*,祝建華*

1(山東省食品藥品檢驗研究院,山東 濟南,250101)2(山東省食品藥品安全檢測工程技術研究中心,山東 濟南,250101)3(山東省藥學科學院,山東 濟南,250101)

二氫槲皮素又稱花旗松素、紫杉葉素、黃杉素、雙氫櫟精,是一種重要的二氫黃酮醇類化合物[1-2]。二氫槲皮素最早由日本學者FUKUI從針葉植物Chamaecyparisobtusa葉中分離[3],化學結構如圖1所示。由于二氫槲皮素特殊的結構式且含有多個酚羥基,使其具有抗氧化[4-6]、抗炎、抗過敏[7-8]、調節酶活性[9]、緩解心血管系統疾病[10]、抗腫瘤[11-12]等一系列生物活性。

圖1 二氫槲皮素的結構

根據國家食品安全風險評估中心2020年11月12日行政許可征求意見[13],二氫槲皮素作為新的食品原料已通過專家評審委員會技術審查,擬作為新食品原料在食品中使用。歐盟和俄羅斯已批準落葉松來源的二氫槲皮素作為新食品原料。二氫槲皮素推薦食用量為≤100 mg/d,使用范圍和最大使用量為：飲料(20 mg/L),發酵乳和風味發酵乳(20 mg/kg),可可制品、巧克力和巧克力制品(70 mg/kg)。目前國內無上述3類食品基質中二氫槲皮素相關的檢測方法和檢驗標準。

二氫槲皮素檢測方法主要有分光光度法[14-15]、熒光法[16]、高效液相色譜法[17-21]、高效液相色譜-質譜法[22-24]等。分光光度法存在檢測靈敏度低、對食品提取溶液透光性要求高等局限性。熒光法檢測靈敏度雖高,但檢測準確性和靈敏度受復雜食品基質影響比較大。高效液相色譜-質譜法定性準確、靈敏度高,但在檢測過程中易受基質干擾,影響定量結果的準確性,且儀器價格昂貴,普及率低。高效液相色譜法抗干擾能力強、檢測靈敏度高、對于目標物分離效果好、定性定量準確,且高效液相色譜儀是分析實驗室普遍具備的儀器。因此高效液相色譜法更適合食品中二氫槲皮素的檢測。由于食品基質復雜多樣,富含糖類、脂肪、蛋白以及各種維生素等物質,因此選擇合適的前處理方式十分重要。檢測食品中二氫槲皮素時,簡單的樣品前處理方式無法有效去除雜質,影響后續的定性定量結果。因此本實驗以國家允許添加二氫槲皮素的飲料、發酵乳和可可制品3種食品基質為研究對象,對樣品前處理、色譜條件進行優化,建立了固相萃取-高效液相色譜法測定食品中二氫槲皮素含量的方法。該方法為企業和監管部門測定二氫槲皮素在食品中的規范使用提供了技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

二氫槲皮素標準品(CAS：480-18-2),上海安譜公司；甲醇、乙腈,均為色譜純,德國Merck公司；乙酸銨、乙酸,均為分析純,國藥集團化學試劑有限公司；乙酸,色譜純,美國Thermo Fisher公司；親水親脂平衡(hydrophile-lipophile,HLB)固相萃取柱(6 mL 200 mg),美國Waters公司。

2695型高效液相色譜儀配有二極管陣列檢測器,美國Waters公司；N-EVAP型控溫型氮吹儀,美國Organomation公司；3-18KS型高速冷凍離心機,德國Sigma公司；24針型固相萃取裝置,美國Supelco公司；MS-3型旋渦混合器,德國IKA公司；SB-800DTD型超聲波清洗器,寧波新芝生物科技股份有限公司；Milli-Q7000型超純水機,美國Millipore公司。

1.2 標準溶液制備

稱取適量二氫槲皮素標準品,以甲醇配制成1.00 mg/mL的標準儲備液,于-18 ℃冰箱保存。用甲醇稀釋,得到0.8、1.0、5.0、10.0、50.0、100.0 μg/mL系列標準工作液。

1.3 樣品預處理

1.3.1 提取

分別稱取2 g(精確到0.01 g)飲料、發酵乳和可可制品于25 mL比色管中,加入20 mLV(甲醇)∶V(2%乙酸水)=1∶1提取液,充分渦旋分散混勻,超聲波清洗器中超聲提取30 min,冷卻至室溫后,用V(甲醇)∶V(2%乙酸水)=1∶1提取液定容至25 mL,混合均勻后,轉移至50 mL離心管中,8 000 r/min離心5 min,準確移取上清液5 mL至另一個50 mL離心管中,加20 mL超純水稀釋混勻后待凈化。

1.3.2 凈化

取HLB固相萃取柱,依次用5 mL甲醇、5 mL超純水活化,再將1.3.1所得待凈化液過固相萃取柱,控制流速不超過1 mL/min,待液體流盡后用5 mL超純水淋洗,將固相萃取柱抽干,再用6 mL甲醇洗脫,收集洗脫液,經45 ℃水浴加熱氮吹至近干。用1 mL甲醇復溶,超聲10 min后渦旋混合,過0.22 μm微孔有機濾膜,供高效液相色譜分析。

1.4 儀器條件

色譜柱：XBridge C18色譜柱(4.6 mm×150 mm,3.5 μm)；柱溫35 ℃；流速0.8 mL/min；檢測波長290 nm；進樣量10 μL。流動相A：0.1%乙酸水溶液,流動相B：甲醇,采用梯度洗脫程序,梯度條件如表1所示。

表1 流動相梯度程序

2 結果與分析

2.1 色譜條件的優化

2.1.1 色譜柱的選擇

在最優的梯度洗脫下,本實驗考察了Atlantis dC18、XBridge C18、ACE C18、Atlantis T3C184款色譜柱。4款色譜柱分析得到的二氫槲皮素色譜峰除了保留時間不同,在峰形,靈敏度方面并沒有顯著差異。XBridge C18色譜柱對實際樣品分離效果較好,抗干擾能力更強,因此選擇XBridge C18色譜柱。

2.1.2 流動相的選擇

乙腈的截止波長在190 nm左右,甲醇的截止波長在210 nm左右,由于二氫槲皮素的最大吸收波長在290 nm左右,在二極管陣列檢測器下,甲醇和乙腈在基線噪音,減少干擾方面基本沒有太大差別。因此,基于經濟最優化和環境友好性方面的考慮,選用甲醇作為流動相。

實驗考察了超純水、酸化乙酸銨溶液(20 mmol/L)、乙酸水溶液體系作為流動相時對目標物分析的影響。結果表明：用超純水進行洗脫時,流動相的洗脫能力明顯降低,需要更長的分析時間或者更強的洗脫梯度才能洗脫出目標物,不利于復雜樣品分析中目標物與雜質間的分離;酸化乙酸銨溶液(20 mmol/L)和乙酸水溶液區別不大;乙酸水溶液作為流動相,基線較穩定,290 nm波長下產生的波動較小,且相較于酸化乙酸銨溶液更加經濟環保。因此,采用乙酸水溶液作為流動相。

對體積分數0.1%、0.5%、2%乙酸水溶液作為流動相產生的實驗效果進行比較,3個濃度水平區別并不明顯,都能得到很好的峰形和分離效果,因此選擇0.1%乙酸水溶液。

2.2 前處理條件的優化

2.2.1 提取

葡萄皮渣、落葉松等基質中檢測二氫槲皮素的前處理方法一般有乙醇和熱水回流直接提取法[25]、超聲-微波交替法[26]等,將該前處理方法應用到食品基質中,發現無法有效去除雜質,并影響后續的定性定量結果,且實驗結果回收率偏低。根據二氫槲皮素易溶于乙酸、乙醇、沸水等溶劑的性質特點,實驗選用2%乙酸水、甲醇-2%乙酸水(1∶1,體積比)、甲醇分別對樣品進行提取。結果發現,食品樣品用2%乙酸水提取時回收率僅為39.3%,明顯低于甲醇-2%乙酸水、純甲醇的提取回收率。純甲醇的提取回收率為59.6%,比甲醇-2%乙酸水提取的回收率100.9%明顯低很多。因此,選用甲醇-2%乙酸水作為樣品提取劑。

實驗進一步考察了不同體積比例甲醇-2%乙酸水的提取效果,體積比分別是0∶1、1∶3、2∶3、1∶1、3∶2、3∶1、1∶0,樣品提取回收率見圖2,隨著提取液中甲醇比例的增加,提取效率不斷提高,而甲醇-2%乙酸水(1∶1)提取回收率最高。甲醇占比超過50%,繼續加大甲醇比例,提取效率逐漸下降。因此選擇體積比1∶1的甲醇-2%乙酸水為提取溶劑。

圖2 不同提取液對二氫槲皮素提取率的影響

2.2.2 凈化方式的選擇

固相萃取法具有快速、簡便、高效除雜的優點,是目前使用最廣泛的凈化手段之一。為提高方法的靈敏度和準確性,對Oasis HLB、C18、Oasis PRiME HLB 3種固相萃取柱的凈化效果進行了比較,3種固相萃取(solid phase extraction,SPE)的具體操作條件見表2。

表2 三種SPE的凈化方法

經SPE凈化后,結果如圖3所示。使用Oasis HLB凈化時二氫槲皮素回收率較高,而使用PRiME HLB和C18柱時回收率略低,為80%左右。PRiME HLB柱是一種通用型固相萃取柱,能去除磷脂、蛋白等雜質,經分析發現該SPE對目標物有吸附,造成回收率偏低。用C18柱凈化后雜質干擾較多,不同基質樣品凈化效果存在較大差異,回收率精密度較低。Oasis HLB柱的雜質去除效果較好,干擾較少,回收率高,對不同基質樣品凈化效果均較好,因此,選用Oasis HLB柱凈化該類樣品,提高了檢測的靈敏度和準確性。

2.2.3 凈化條件的選擇

上樣前將提取液用超純水稀釋5倍后上Oasis HLB柱。上樣后用5 mL超純水進行淋洗,洗去更多雜質以提高其凈化效率。由于不同化合物之間極性差異,跟Oasis HLB柱填料的結合程度也不同。實驗考察了洗脫液甲醇的體積對二氫槲皮素回收率的影響,分別用1、2、4、6、8和10 mL甲醇洗脫目標物,二氫槲皮素回收率如圖4所示,當洗脫液體積為6 mL時,目標物能被完全洗脫下來,繼續增大洗脫液體積時,回收率變化不明顯,且氮吹濃縮時間延長,因此,綜合考慮確定洗脫液的體積為6 mL。

圖4 不同體積洗脫液對二氫槲皮素回收率的影響

2.3 方法學考察

2.3.1 線性范圍和檢出限

將二氫槲皮素系列標準工作液按質量濃度0.8、1.0、5.0、10.0、50.0和100.0 μg/mL依次經高效液相色譜儀進行分析測定,以二氫槲皮素標準工作液質量濃度(μg/mL)為橫坐標,以響應峰面積為縱坐標,繪制二氫槲皮素標準工作曲線,在曲線范圍內,回歸方程為：Y=4.15×104X-9.29×103,線性相關系數為0.999 9,線性良好。以信噪比S/N≥3計算檢出限,結果為0.6 mg/kg。以信噪比S/N≥10計算定量限,結果為2.0 mg/kg。

在本研究的條件下,對二氫槲皮素標準品和實際樣品進行分析,色譜圖如圖5所示,二氫槲皮素標準品色譜峰保留時間為11.814 min,具有良好的峰形和響應值。飲料、發酵乳、可可制品3種食品基質樣品中干擾物達到了有效分離,能夠較好地分析測定其中的二氫槲皮素。

圖5 二氫槲皮素標準品(100.0 μg/mL)和實際樣品加標(200 mg/kg)色譜圖

2.3.2 回收率和精密度

以飲料、發酵乳、可可制品3種食品基質為研究對象,添加二氫槲皮素質量分數為2、20、200 mg/kg 3個水平,經上述方法處理后,測定樣品中的目標物濃度,平行測定6次,進行相對標準偏差(relative standard deviation,RSD)的計算,結果見表3。結果表明,二氫槲皮素的平均回收率在90.3%～102.5%,不同水平的加標樣品重復測定6次,RSD為0.45%～1.42%,該方法能夠滿足實際樣品的檢測需要。

表3 添加回收率與精密度(n=6)

2.3.3 實際樣品分析

采用本文建立的方法對30批次市售飲料、發酵乳、可可制品進行二氫槲皮素的檢測,30批次產品均未檢出二氫槲皮素,可能是由于此前我國未批準二氫槲皮素作為食品原料在食品中使用,因此企業在食品生產過程中,沒有添加二氫槲皮素。

3 結論

本文建立了固相萃取-高效液相色譜測定食品中二氫槲皮素含量的方法,該方法前處理凈化效果好,液相色譜分析時干擾物明顯減少。本方法的靈敏度高,對于二氫槲皮素的定性、定量結果準確可靠,適用于飲料、發酵乳、可可制品等食品中二氫槲皮素含量的測定。