微波提取對百合多糖流變性及生物活性的影響

黃群惠,黃志蕓,田文靜,李正逗,丁玲,史金涵,馬旺軍,麻玉婷,張繼,3*

1(西北師范大學 生命科學學院,甘肅 蘭州,730070)2(甘肅省特色植物有效成分制品工程技術研究中心,甘肅 蘭州,730070)3(西北師范大學 新農村發展研究院,甘肅 蘭州,730070)

蘭州百合(LiliumdavidiivarunicolorSalisb)為川百合的變種,在藥用的同時,也是蘭州地區常見的蔬菜之一。經研究發現由百合鱗莖提取出的百合多糖(lily polysaccharicle,LPS)是其具有抗氧化、抗腫瘤、降血糖、調節免疫等藥用價值的重要原因,百合多糖清除自由基的能力使其成為一種較有前景的抗氧化劑[1],尤其是多糖作為一種天然產物副作用小、無毒性而被認為是合成抗氧化劑的替代品[2-4]。在食品領域中,多糖被廣泛應用于食品、飼料、醫藥和制藥工業,其中,百合多糖也是受到廣泛研究的多糖之一。由于許多食品在生產和加工過程中多以液態形式存在,多糖在不同條件下獨特的流變性使其在食品領域中得到了廣泛的應用,許多天然多糖被用作膠凝劑、增稠劑和乳化劑[5-7]。

韓曉霞等[8]研究發現甘肅不同地區百合中的百合多糖的含量不同,為提高實驗精準性,本實驗選用蘭州市七里河區產的本地百合進行多糖提取。不同條件微波輔助提取百合多糖的流變特性以及體外抗氧化方面的研究尚未有明確報道,本實驗旨在探究不同功率、時間和溫度的微波輔助熱水浸提法提取百合多糖及其相關特性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘭州百合,蘭州市七里河區市場。百合鱗片清洗晾干表面水分備用。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH),美國Sigma公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

JRA-6數顯磁力攪拌水浴鍋,金壇市杰瑞爾電器有限公司；MCR301流變儀,奧地利安東帕有限公司；EU-2600D紫外分光光度計,上海昂拉儀器有限公司；KQ-250DE數控超聲波清洗器,昆山市超聲儀器有限公司；RE-52旋轉蒸發儀,上海亞榮生化儀器廠；SHB-Ⅲ循環水式多用真空泵,鄭州長城工貿有限公司；MG08S-2B微波實驗儀,南京匯研微波系統工程有限公司；Nicolet iS10紅外光譜儀,美國Thermo公司；SCIENTZ-10 N冷凍干燥機,寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 研究方法

1.3.1 微波輔助法提取百合多糖

準確稱取新鮮百合100 g打漿,按照料液比1∶4(g∶mL)加入蒸餾水,60 ℃熱水浸提2 h,將提取液10 000 r/min離心5 min,收集上清液,在一定時間、功率、溫度下進行微波提取,于65 ℃旋轉蒸發濃縮,無水乙醇沉淀多糖,離心收集沉淀,Sevag法除蛋白,再醇沉后離心收集沉淀,冷凍干燥后即得到百合多糖[9-11]。

1.3.2 單因素試驗

選取時間、溫度、微波功率為考察因素。設定溫度為50 ℃,微波功率為400 W,提取時間為5、15、25 min；設定溫度為50 ℃,時間為25 min,微波功率為400、600、800 W；設定提取時間為25 min,微波功率為600 W,提取溫度為50、60、70 ℃進行微波處理。未經微波處理的百合多糖提取液作為空白對照,每組單因素實驗做3組平行。濃縮后冷凍干燥,共得到8種百合多糖樣品。

1.3.3 傅里葉紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy，FT-IR)表征

采用紅外光譜儀對不同微波條件處理的百合多糖的分子結構進行分析。準確稱取干燥的百合多糖2 mg,加入200 mg烘干至恒重的KBr,置瑪瑙研缽中研磨均勻,壓片,在4 000～400 cm-1范圍內進行紅外掃描。

1.3.4 流變學表征

在(25.0±0.1)℃下,使用流變儀的平板PP50系統,板間距1 mm,研究流變學特性(包括流動性能與觸變性能測定)。每次測定時,將2 mL 20 mg/mL的百合多糖溶液轉移到板上,室溫孵育10 min。

1.3.4.1 流動性能測定

采用流變儀的平板PP50系統,測量百合多糖的黏度隨剪切速率的變化趨勢,剪切速率范圍設置為0.01～100 s-1。

1.3.4.2 觸變性能測定

采用流變儀的平板PP50系統,旋轉模式下設定3段參數,第1段：剪切速率以3.12 s-1為增速從0 s-1升高到100 s-1；第2段：以100 s-1作為剪切速率維持50 s；第3段：以3.12 s-1為減速從100 s-1降低到0 s-1[12]。

1.3.5 百合多糖的體外抗氧化能力的測定

百合多糖用蒸餾水分別配制成7個濃度梯度0.02、0.06、0.1、0.2、0.6、1和2 mg/mL,其中未經微波處理的百合多糖提取液作為陰性對照。再以維生素C作為陽性對照,用蒸餾水分別配制成與百合多糖相同的濃度梯度。

1.3.5.1 DPPH自由基清除能力測定

以無水乙醇作為溶劑,將DPPH自由基配制成濃度為 0.1 mmol/L DPPH儲備液,且DPPH溶液現配現用。

測定方法：準確吸取1 mL不同濃度的百合多糖溶液分別加入到3 mL 0.1 mmol/L的DPPH儲備液中,室溫避光反應30 min,每組設置3個平行,測定混合溶液在517 nm處的吸光度A1,超純水做空白組,在相同條件下測定吸光值A0[13]。DPPH 自由基清除率計算如公式(1)所示：

(1)

1.3.5.2 羥基自由基(·OH)清除能力測定

測定方法：準確吸取不同濃度的百合多糖溶液各1 mL,依次加入1 mL 9 mmol/L FeSO4溶液、1 mL 9 mmol/L水楊酸溶液和1 mL 8.8 mmol/L H2O2溶液,搖勻后于37 ℃水浴30 min,測定混合溶液在510 nm處的吸光度Ai,用蒸餾水代替水楊酸測定吸光值Aj,以超純水做空白對照A0[14]。·OH清除率按公式(2)計算：

(2)

1.3.5.3 鐵離子還原能力(ferric reducing antioxidant potential,FRAP)測定

準確吸取不同濃度的百合多糖溶液各0.4 mL,依次加入0.2 mol/L,pH 6.6磷酸鹽緩沖液1 mL和體積分數1%鐵氰化鉀溶液1 mL充分混合,在 50 ℃下水浴30 min,冰浴快速冷卻后加入1 mL 體積分數10%三氯乙酸溶液充分混勻,10 000 r/min離心5 min,吸取上清液1 mL,再加入1 mL蒸餾水和1 g/L FeCl3溶液0.2 mL,充分搖勻反應10 min,每組設置3個平行,在700 nm處測定混合溶液的吸光度,以超純水做空白組,在相同條件下測定吸光值[15]。

1.4 數據與分析

流變學實驗數據通過流變儀自帶的軟件所得。所有測試重復3次取平均值，用 Origin 9.0 軟件對所有數據進行處理并作圖。

2 結果與分析

2.1 百合多糖紅外光譜分析

圖1中不同微波條件提取的百合多糖紅外光譜峰形和峰位置基本一致,但峰強度有差異。由圖1-a可知,微波提取時間為5 min時多糖結構與空白對照組相似,隨著時間延長,多糖的特征吸收峰越弱,說明多糖逐漸水解,大分子鏈斷裂；由圖1-b可知,微波提取功率達到600和800 W時，對百合多糖結構產生較小影響,可能是由于功率達到600 W時百合多糖大分子鏈已經解開,而功率達到800 W時對多糖的結構影響不大；圖1-c可以觀察到微波提取溫度越高,百合多糖結構與空白對照組越相似,可能是百合多糖大分子隨著溫度升高,其大分子鏈發生解開與纏結不平衡引起其結構改變。

a-不同時間處理；b-不同功率處理；c-不同溫度處理

2.2 百合多糖的流變學特性分析

2.2.1 流動性分析

多糖具有優良的流變性能,在增稠劑、膠凝劑和乳化劑等方面有廣泛的應用[20],而多糖的流變學行為受外界因素的影響[4]。圖2考察了剪切速率對百合多糖黏度的影響。在低剪切速率下可以觀察到典型的剪切變稀行為,隨著剪切速率的增加,黏度隨之降低,為假塑性流體；百合多糖在高剪切速率下易受到更大的剪切力,黏度幾乎保持不變,表明百合多糖長鏈的纏結結構在高剪切速率的影響下發生重新排列。

a-不同時間處理；b-不同功率處理；c-不同溫度處理

如圖2-a所示,在溫度和微波功率相同的條件下,微波處理時間越長,百合多糖的零剪切黏度越大,可能是由于隨著微波處理時間的延長促進了多糖分子鏈的解開,多糖分子之間的交聯網狀結構逐漸被破壞,因此黏度下降速率更快。在圖2-b中,溫度和時間固定的條件下,功率越大,多糖的零剪切黏度越小;圖2-c中,在功率和時間相同的條件下,溫度升高,多糖的零剪切黏度減小,即黏度下降速率逐漸減慢,多糖溶液表現出近似于牛頓流體的特性,以上2種情況可能是由于多糖分解成小分子的糖,聚合度降低,因此其零剪切黏度較低。不同微波輔助提取百合多糖的零剪切黏度見表1。

表1 不同微波輔助提取百合多糖的零剪切黏度

利用 Herschel-Bulkley模型對百合多糖的流動曲線進行擬合,其方程式如公式(3)所示：

τ=τy+kn

(3)

式中：τ,剪切應力,Pa；τy,剪切屈服應力,Pa；,剪切速率,s-1；k,稠度系數,Pa/s；n,非牛頓指數,其中n=1 牛頓流體；n<1 剪切稀化；n>1 剪切增稠[21]。

由表2可知，百合多糖的流動行為與Herschel-Bulkley模型擬合度較高，R2>0.9953。此特性的多糖可以作為性增稠劑或穩定劑。

表2 不同微波輔助提取百合多糖的Herschel-Bulkley模型擬合參數

2.2.2 觸變性分析

多糖的觸變性是指在非破壞或剪切的條件下,多糖的形變對剪切應力的響應[22]。剪切速率隨時間延長達到最大值,剪切速率降低再次回到初始值,形成的曲線呈現上下閉合狀態(圖3)。根據公式(4)計算不同微波條件提取百合多糖的觸變環面積,結果見表3。

a-不同時間處理；b-不同功率處理；c-不同溫度處理

表3 不同微波輔助提取百合多糖的觸變環面積

(4)

式中：γ1和γ2為剪切速率,s-1；k1、k2為正向流動指數,Pa/s；n1和n2分別為流動冪指數。

由表3中可知,不同微波輔助條件下提取的百合多糖都具有一定的觸變性。溫度和功率一定時,提取時間越長,百合多糖的大分子長鏈逐漸解開,觸變環面積越大,因此觸變性也隨之增大；溫度和時間一定時,多糖的觸變環面積隨著功率的增大而減小;功率和時間一定時,提取溫度越高,多糖的觸變環面積越小,這2種現象可能是由于微波功率過大,溫度越高,百合多糖大分子的纏結結構發生變化所致。

2.3 百合多糖的體外抗氧化活性

2.3.1 DPPH自由基清除能力測定

DPPH是一種很穩定的自由基[23],其最大吸收波長在517 nm 處。DPPH易與抗氧化劑發生電子轉移反應,從而使自身被清除,吸光值減弱[24]。如圖4所示,當百合多糖質量濃度<0.6 mg/mL時,多糖清除DPPH自由基的能力隨著濃度升高而上升,在質量濃度>1.0 mg/mL時,變化趨于平緩,此現象是由于氫鍵的增加所引起的。圖4-a中隨著提取時間的延長,多糖清除DPPH自由基的能力逐漸減弱,可能是由于多糖分子隨著提取時間延長,結構鏈解開,空氣中被氧化的部分也增多,影響其整體的抗氧化活性；如圖4-b所示,隨著提取功率增大,清除DPPH自由基能力逐漸增強,可能是由于多糖鏈隨著功率增大更快速地釋放出來,為自由基提供電子,因此清除自由基能力增強；如圖4-c所示,隨著溫度升高促進了多糖分子運動,分子間的相互作用增強,可能是多糖大分子結構鏈先解纏結再重新纏結,因此其清除DPPH自由基能力越來越接近陰性對照組。通過圖1紅外分析百合多糖的結構得知,在1 636和1 415 cm-1附近的較強吸收峰證實了糖醛酸的存在,有文獻報道,多糖的結構中糖醛酸含量越高,其自由基清除能力越強[17,25]。

a-不同時間處理；b-不同功率處理；c-不同溫度處理

2.3.2 羥基自由基(·OH)清除能力測定分析

在體內自由基中活性最強的是·OH。抗氧化劑是通過把電子或質子傳遞給自由基來清除自由基。由圖5可知,微波輔助提取對百合多糖清除·OH的影響隨濃度的增大而略微增強,正相關趨勢沒有維生素C清除DPPH自由基的能力明顯。如圖5-a所示,隨著時間的延長,多糖清除·OH的能力逐漸減弱,可能是由于微波提取會改變多糖構象,進而影響了對·OH的清除能力。圖5-b和5-c可知,隨著功率的增大與溫度的升高,百合多糖清除·OH能力逐漸增強,可能是由于多糖鏈的卷曲結構得到伸展,通過觀察圖1-b和圖1-c中羥基峰,推測多糖鏈水解后暴露出的羥基提供更多質子,終止了自由基的鏈式反應。

a-不同時間處理；b-不同功率處理；c-不同溫度處理

2.3.3 鐵離子還原能力

體外抗氧化實驗通常采用還原鐵氰化鉀的能力來判斷還原力的大小,由于百合多糖的抗氧化活性與其還原力有直接聯系,抗氧化劑可將Fe3+還原成Fe2+,百合多糖還原力越強就證明抗氧化性越強。圖6是不同微波輔助提取條件下百合多糖的還原力的變化,可以發現隨著維生素C或百合多糖濃度的增大,吸光度也會逐漸增大。通過圖6-a觀察,當微波處理時間從5 min延長到25 min,多糖的還原力先增強后減弱,植物多糖的抗氧化能力可能是多種因素的相互作用或反作用,不僅與糖醛酸質量分數相關,還與單糖組成、取代基、糖殘基和鏈構象等因素相關[19],因此百合多糖抗氧化活性還需要進一步研究；圖6-b是不同功率的微波處理后百合多糖的還原力,隨著功率的增大多糖還原力逐漸增強；圖6-c顯示隨著溫度的升高百合多糖的還原力逐漸增強,但是陰性對照始終還原能力最弱,這種現象可能是微波輻射改變了多糖分子的交聯網狀結構,其結構鏈的解纏結和重新纏結之間不平衡,進而影響了多糖的還原能力。

a-不同時間處理；b-不同功率處理；c-不同溫度處理

3 結論

通過改變時間,功率和溫度等微波條件提取百合多糖,紅外光譜初步表征確定了7種不同的條件提取出的百合多糖均有多糖特征吸收峰；流變特性分析出百合多糖具有剪切變稀行為,隨著剪切速率的增加,黏度隨之降低,為假塑性流體,其流動曲線符合流變學Herschel-Bulkley模型,具有這種顯著剪切稀化效應的多糖可以作為性能優良的增稠劑或穩定劑,可應用于飲料工業中。同時微波提取的百合多糖還具有一定的觸變性,隨著時間延長或溫度的升高,百合多糖的觸變環面積增大,即觸變性增大,隨著微波功率的增大,百合多糖的觸變性環面積減小,觸變性降低,因此百合多糖具有良好的流變特性,在食品加工中可替代食用膠。

通過體外抗氧化實驗可知,百合多糖與陽性對照維生素C相比抗氧化活性普遍偏低,多糖是一種大分子化合物,在相同濃度下抗氧化活性低于抗氧化劑維生素C屬于正常情況。不同微波條件提取的百合多糖在一定濃度下清除DPPH自由基、·OH以及還原三價鐵離子的能力均與處理時間呈負相關,與功率和溫度呈正相關,經過紅外光譜分析百合多糖的結構可以猜測多糖的體外抗氧化能力與其糖醛酸含量、單糖組成、糖殘基及大分子鏈構象等有關,因此在提取百合多糖時應注意適當縮短處理時間以保護多糖的結構,使其具有較好的抗氧化特性,可作為一種抗氧化、抗衰老的功能食品。