紅曲菌9901利用柚子囊固態發酵產Monacolin K

劉曉寧,錢高飛,傅曼瓊,付杰,戴海民,張薄博*

1(江南大學 生物工程學院,江蘇 無錫,214000)2(汕頭大學 理學院,廣東 汕頭,515063)3(廣東柚通柚美農產品技術研究有限公司,廣東 梅州,514000)

紅曲菌是一種具有悠久應用歷史的藥食兩用絲狀真菌,發酵后能產生天然色素和多種具有生理活性的次生代謝產物,包括Monacolin K、γ-氨基丁酸、多糖等[1]。Monacolin K 對膽固醇合成限速酶3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A,HMG-CoA)具有高效抑制作用,從而具有抑制膽固醇合成,控制高血脂的功效[2-3]。與從其他菌類提取或人工合成的洛伐他汀相比,紅曲產品中的Monacolin K結晶少、溶解度高,因而對心血管疾病的療效更顯著,毒副作用更小[4-5]。但是微生物產Monacolin K常用谷物類基質生產成本較高，不適合工業生產。

食品副產物作為發酵基質,用于菌體或微生物次級代謝產物的生產已有多年歷史。為了能夠降低生產成本,提高食品副產物的利用價值,目前已有以黃精渣[6]、甘蔗渣[7]、沙棘籽粕[8]、米糠[9]、豆粕[10]、麥麩[11]等作為培養基,進行紅曲固態發酵生產Monacolin K的研究。吳雙雙[9]通過采用紫外-化學誘變育種,與添加營養物質相結合的方式來發酵米糠,生產Monacolin K,產量最高達到11.68 g/kg,說明食品副產物發酵生產Monacolin K有較大的發展空間。本課題組在以大米[12]和小米[13]等谷物為原料,進行固態發酵產Monacolin K的研究方面已取得了較好的結果。在此基礎上，本研究選取幾種具有高值化潛力的食品副產物進行發酵實驗，對比了紅曲菌固態發酵生產Monacolin K的產量，確定以柚子囊作為固態發酵基質，探究不同發酵條件對紅曲菌9901產Monacolin K的影響，并對發酵工藝進行優化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

紅色紅曲菌9901,江南大學實驗室篩選并保藏。

1.1.2 培養基

菌種保藏培養基(g/L)：馬鈴薯200,葡萄糖20,瓊脂20,pH自然,121 ℃滅菌20 min。

種子液培養基(g/L)：葡萄糖60,魚粉蛋白胨25,NaNO32,MgSO4·7H2O 1,K2HPO4·3H2O 1,玉米漿粉6,500 mL錐形瓶裝液量100 mL,pH值調至6.0,121 ℃滅菌20 min。

固態發酵培養基：食品副產物類基質干質量為10 g,培養基初始含水量45%,pH自然,121 ℃滅菌30 min。

1.1.3 試劑

洛伐他汀(純度98%)。甲醇、乙腈(純度99.9%)。葡萄糖、魚粉蛋白胨、NaNO3、MgSO4·7H2O、K2HPO4、玉米粉、(NH4)2SO4、甘油、乳糖、瓊脂、無水乙醇、酵母膏、蔗糖、麥芽糖,以上為分析純。柚子囊,由大埔縣通美實業有限公司提供,土豆、陳皮、麥糟、麩皮、香菇腿、橘子核均為市售。

1.2 儀器與設備

A11型超高速粉碎儀,廣州艾卡儀器設備有限公司；HYG-A型全溫搖床柜,太倉市實驗設備廠；SW-CJ-IF型超凈工作臺,蘇州凈化設備有限公司；FA-1004FA型電子天平,上海舜宇恒平科學儀器有限公司；HH-B11-360型電熱恒溫培養箱,連云港醫療器械設備廠；LDZX-40B1型高壓蒸汽滅菌鍋,上海申安醫療器械廠；101-1型電熱鼓風干燥箱,上海博訊醫療設備廠；MB 45型水分活度儀,美國奧豪斯公司；SHZ-D型循環水式真空泵,鞏義市予華儀器有限公司；KQ-100型超聲波清洗儀,昆山市超聲儀器有限公司；PB-10型pH儀,季爾國際貿易上海有限公司；1525型高效液相色譜儀,美國Waters公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 紅曲菌9901利用食品副產物固態發酵產Monacolin K的工藝

將在4 ℃冰箱保藏的紅曲菌9901,放在28 ℃培養箱活化1 d后,用無菌水將菌種孢子從斜面洗脫下來,制成孢子濃度為1×106個/mL的孢子懸浮液,接種10 mL的孢子懸浮液,于100 mL液態種子培養基中。置于30 ℃恒溫恒濕的搖床內,以180 r/min,培養2 d,之后將種子培養液以不同接種量,接種至固態培養基,放置于恒溫恒濕培養箱以30 ℃,培養2 d后以25 ℃培養不同時間。發酵完成后烘干,用高效液相色譜法檢測Monacolin K的含量。

1.3.2 紅曲菌9901利用食品副產物固態發酵產Monacolin K的實驗設計

1.3.2.1 不同食品副產物對Monacolin K產量的影響

分別取干重為10 g的柚子囊、陳皮、麥糟、麩皮、香菇腿、橘子核作為食品副產物固態基質,液體種子以10%(mL∶g)的接種量,接入裝有上述基質的100 mL發酵瓶中,初始含水量為45%；30 ℃發酵培養2 d；然后25 ℃發酵培養至18 d。發酵完成后檢測Monacolin K的含量。

1.3.2.2 初始含水量對Monacolin K產量的影響

將紅色紅曲菌9901的液態種子,以10%(mL∶g)的接種量,接入裝有干重為10 g柚子囊的100 mL發酵瓶中,調節初始含水量分別為40%、45%、50%、55%、60%、65%,30 ℃發酵培養2 d；然后25 ℃條發酵培養至18 d。發酵完成后檢測Monacolin K的含量。

1.3.2.3 接種量對Monacolin K產量的影響

將紅色紅曲菌9901的液態種子,分別以5%、10%、15%、20%、25%、30%(mL∶g)的接種量,接入裝有干重為10 g柚子囊的100 mL發酵瓶中,調節初始含水量為45%。30 ℃發酵培養2 d；然后25 ℃發酵培養至18 d。發酵完成后檢測Monacolin K的含量。

1.3.2.4 外加碳源類型對Monacolin K產量的影響

將紅色紅曲菌9901的液態種子,以10%(mL∶g)的接種量,接入裝有干重為10 g柚子囊的100 mL發酵瓶中,調節初始含水量為45%。額外添加碳源,種類分別為甘油、葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖,添加量為總質量的5%(質量分數)。30 ℃發酵培養2 d；然后25 ℃發酵培養至18 d。發酵完成后檢測Monacolin K的含量。

1.3.2.5 乳糖添加量對Monacolin K產量的影響

將紅色紅曲菌9901的液態種子,以10%(mL∶g)的接種量,接入裝有干重為10 g柚子囊的100 mL發酵瓶中,調節初始含水量為45%。額外添加乳糖,添加量分別為總質量的1%、3%、5%、7%、9%(質量分數)。30 ℃發酵培養2 d；然后25 ℃發酵培養至18 d。發酵完成后檢測Monacolin K的含量。

1.3.2.6 外加氮源類型對Monacolin K產量的影響

將紅色紅曲菌9901的液態種子,以10%(mL∶g)的接種量,接入裝有干重為10 g柚子囊的100 mL發酵瓶中,調節初始含水量為45%。添加的氮源分別為硫酸銨、硝酸鈉、玉米粉、酵母膏、蛋白胨,添加量為總質量的2%(質量分數)。30 ℃發酵培養2 d；然后25 ℃發酵培養至18 d。發酵完成后檢測Monacolin K的含量。

1.3.2.7 發酵時間對Monacolin K產量的影響

將紅色紅曲菌9901的液體種子,分別以10%(mL∶g)的接種量,接入裝有干重為10 g柚子囊的100 mL發酵瓶中,初始含水量為45%,30 ℃發酵培養2 d；25 ℃條件下,分別檢測發酵12、14、16、18、20、22、24 d時Monacolin K的含量。

1.3.2.8 響應面試驗優化

為進一步研究變量之間交互作用的影響關系,使用響應面分析法篩選最佳發酵條件。每個單因素的初步研究是響應面優化的指導范圍,基于Box-Behnken采樣原理,選擇對Monacolin K含量有影響的3個因素：初始含水量A、乳糖添加量B、接種量C進行3因素3水平的響應面分析試驗。響應面試驗因素水平見表1。

表1 響應面試驗因素水平設計

1.3.3 Monacolin K含量檢測方法

1.3.3.1 液相色譜檢測條件

儀器：Waters 2487；色譜柱型號,20 RBA×SB-C18；流動相V(乙腈)∶V(水)=55∶45,磷酸調pH值至2.5；流速1.5 mL/min,柱溫30 ℃；檢測器,紫外檢測器；檢測波長238 nm；進樣量20 μL。

1.3.3.2 內酯型Monacolin K標準曲線繪制

取Monacolin K標準品4.0 mg,置于10 mL容量瓶中,用甲醇定容至10 mL,超聲,使溶液完全溶解,得到400 μg/mL的標準母液,分別配制質量濃度為10、25、50、80、100、150、200 μg/mL的標準溶液,經0.22 μm的有機濾膜過濾后,通過高效液相色譜進行測定,根據峰面積與Monacolin K濃度的對應關系,以濃度為橫坐標,峰面積為縱坐標,繪制出內酯型Monacolin K的標準曲線,得到回歸方程及相關系數。

1.3.3.3 酸型Monacolin K標準曲線繪制

取內酯型Monacolin K標準品2.0 mg,置于10 mL容量瓶中,用0.1 mol/L的NaOH(用50%的乙腈配制)溶液定容至10 mL,得到200 μg/mL的標準母液,于50 ℃水浴1 h,超聲1 h,用1 mol/L的HCl調pH至中性。

將標準母液逐級稀釋后得到質量濃度為10、25、50、80、100、150、200 μg/mL的標準溶液,經0.22 μm的有機濾膜過濾后,通過高效液相色譜進行測定,根據峰面積與Monacolin K濃度的對應關系,以濃度為橫坐標,峰面積為縱坐標,繪制出酸型Monacolin K的標準曲線,得到回歸方程及相關系數。

1.3.3.4 樣品的測定

將紅曲菌利用固態食品副產物發酵結束的產品,放于45 ℃電熱鼓風干燥箱中烘干,之后用研磨機打碎至粉末狀,將每份樣品的粉末混勻,并過100目篩子,取0.5 g樣品于50 mL比色管中,用70%(體積分數)乙醇定容至50 mL,55 ℃水浴1 h,每20 min振蕩1次,水浴結束后冷卻至室溫,靜置后過0.22 μm有機濾膜,通過高效液相色譜測定。根據內酯型Monacolin K和酸型Monacolin K標準曲線計算Monacolin K總含量。

2 結果與討論

2.1 Monacolin K標準曲線的繪制

以HPLC測得的內酯式Monacolin K峰面積為縱坐標,以內酯式Monacolin K標準液濃度為橫坐標,用Origin擬合,經計算得到內酯式Monacolin K標準曲線回歸方程為：y=0.723 2x+0.578 9。試驗表明內酯式Monacolin K質量濃度在0～200 mg/L,具有良好的線性關系。

以HPLC測得的酸式Monacolin K峰面積為縱坐標,以酸式Monacolin K標準液濃度為橫坐標,用Origin擬合,經計算得到酸式Monacolin K標準曲線回歸方程為：y=0.753 97x+0.178 67。試驗表明酸式Monacolin K質量濃度在0～200 mg/L,具有良好的線性關系。

2.2 食品副產物固態基質的確定

不同的固態發酵基質的組織結構、密度、通氣性能以及比表面積,對微生物的生長環境及傳質、傳熱造成很大影響[14-15]。故選取有發酵潛力的食品副產物作為基質進行固態發酵,對紅色紅曲菌9901發酵產Monaconlin K的能力進行檢測,考察不同食品副產物固態基質對Monaconlin K產量的影響,如圖1所示。

圖1 食品副產物種類對紅色紅曲菌9901產Monacolin K的影響

在所選的食品副產物固態發酵基質中,Monacolin K的產量,由高到低的排列順序為：柚子囊>麩皮>麥糟>橘子核>香菇腿>陳皮。Monacolin K產量最高的為柚子囊,產量平均可達6 187.9 mg/kg。Monacolin K產量最低的為陳皮,產量僅有1 763.6 mg/kg。用柚子囊作為固態發酵基質Monacolin K產量,是以陳皮作為固態發酵基質時Monacolin K產量的3.5倍。柚子囊是一種多孔的介質,同時其本身具有一定營養成分(總糖含量9.3%,蛋白質含量1.7%),因此可以提供適宜紅曲菌生長的條件,用于紅曲菌9901固態發酵產Monacolin K。

2.3 基質初始含水量的確定

固態發酵基質的水分含量一般在40%～60%[16],過高或者過低均不利于菌絲生長以及次級代謝的正常進行[17-18]。因此調節不同的初始含水量,來研究初始含水量對紅色紅曲菌9901固態發酵產Monacolin K的影響。由表2可知,隨著初始含水量的增加,紅色紅曲菌9901固態發酵產Monacolin K的產量先增加后減少。初始含水量過多過少時均不利于Monacolin K的生產,可能是由于當含水量過高時,基質間的氧傳遞不足,且易出現結團現象,菌絲無法深入基質內部生長,因此營養利用不充分。而當含水量過低時,雖基質松散,但基質內部未被水滲透,從而菌體不易生長到柚子囊內部。初始含水量為45%時,發酵產物中Monacolin K含量最高達到最高。因此,采用初始含水量為45%的條件進行后續實驗。

表2 初始含水量對紅色紅曲菌9901固態發酵產Monacolin K的影響

2.4 接種量的確定

接種量會直接影響菌體生長進而影響次級代謝產物的合成,因此研究了接種量對紅色紅曲菌9901固態發酵產Monacolin K的影響。由圖2可知,隨著接種量的增加,發酵產物中Monacolin K含量先升高后降低,當接種量為10%時發酵產物中Monacolin K含量最高。這是因為接種量太少菌體生長較慢,但過大的接種量會使菌體生長過快,營養物質迅速消耗,同樣不利于Monacolin K的合成。因此選取10%(mL∶g)的接種量,作為紅色紅曲菌9901固態發酵產Monacolin K的最適接種量。

圖2 接種量對紅色紅曲菌9901固態發酵產Monacolin K的影響

2.5 外加碳源類型的確定

碳源是構成菌體和產物的碳架及其能量來源,不同的碳源種類會影響Monacolin K的產量,參考相關文獻報道[19-23],本試驗選用以下5種碳源進行比較：乳糖、甘油、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖。由圖3可知,添加不同的碳源種類對紅色紅曲菌9901固態發酵產Monacolin K有較大差異。通過實驗現象觀察,額外添加葡萄糖的實驗組中,菌絲體的生長較其他實驗組更快更多。葡萄糖是最易利用的碳源,從而使得更多的營養物質用于菌體生長,反而不利于后期Monacolin K的積累。添加乳糖、甘油、蔗糖、麥芽糖的實驗組,菌絲體適度生長,發酵后期能正常積累Monacolin K。添加乳糖后,紅曲菌9901生產Monacolin K的含量最高,因此乳糖為紅色紅曲菌9901固態發酵產Monacolin K的最適外加碳源。

圖3 碳源類型對紅色紅曲菌9901固態發酵產Monacolin K的影響

2.6 乳糖添加量的確定

由于碳源是紅曲菌發酵產生Monacolin K的限制性底物,碳源含量是決定細胞生長和產物積累量的主要因素之一。由圖4可知,隨著乳糖質量濃度的逐漸增加,Monacolin K的產量不斷增加。乳糖在添加量為占總質量的3%時,紅曲菌9901生產Monacolin K的含量最高。當乳糖添加量繼續增加時,菌體細胞滲透壓不斷增大,會對菌絲體代謝產物的合成及氧的傳遞過程造成較大影響[24],Monacolin K的產量不斷降低。從Monacolin K的產量和原料利用率等因素綜合考慮,選擇占總質量的3%的乳糖,作為紅色紅曲菌9901固態發酵產Monacolin K的最適碳源添加量。

圖4 乳糖添加量對紅色紅曲菌9901固態發酵產Monacolin K的影響

2.7 外加氮源類型的確定

氮源不足會導致菌體生長緩慢,氮源過多,則微生物生長過于旺盛,不利于代謝產物的積累。本試驗選取了5種常見的碳源：NaNO3、蛋白胨、酵母膏、(NH4)2SO4、玉米粉進行發酵實驗。由圖5可知,對照組的含量最高,不需要添加氮源,即可生產出較多的Monacolin K,從優化發酵工藝、降低成本等方面來考慮,選擇不額外添加碳源,進行紅色紅曲菌9901固態發酵產Monacolin K的后續實驗。

圖5 氮源類型對紅色紅曲菌9901固態發酵產Monacolin K的影響

2.8 發酵時間的確定

紅曲菌固態發酵使用不同的菌株,不同的培養方式,產Monacolin K的周期不同[23,25],且固態發酵周期較長。為確定紅色紅曲菌9901利用柚子囊發酵產Monacolin K的最佳時間,進行了發酵時間的確定實驗。由圖6可知,從第12～18天,隨著發酵時間的增加,Monacolin K的含量迅速增加,Monacolin K開始大量積累。發酵20 d時,Monacolin K積累速度減緩,產量達到最大。隨著發酵時間的增加,而22 d時,Monacolin K的含量開始有所下降,可能是固態發酵后期,培養基基質營養物質的消耗完畢,菌體已經不能合成Monacolin K,而且Monacolin K開始分解造成的。因此,紅色紅曲菌9901固態發酵柚子囊的發酵周期選為20 d。

圖6 發酵時間對紅色紅曲菌9901固態發酵產Monacolin K 的影響

2.9 響應面試驗優化結果及分析

根據Box-Behnken中心組合實驗設計原理和單因素試驗的結果,選取初始含水量、乳糖添加量及接種量作為自變量,設計了3因素3水平的響應面分析實驗。以Monacolin K產量作為考核指標進行實驗,相關的設計與結果如表3所示。

表3 響應面試驗設計與結果

利用Design-Expert 10.0.1軟件對實驗數據進行分析,得到紅色紅曲菌9901固態發酵產Monacolin K的二次多項回歸方程：

Y=6 804.58+691.26A-81.605B-511.123C+1 093.58AB+246.885AC-453.99BC-1 547.22A2-873.719B2-837.394C2

表4 響應面擬合回歸方程的方差分析結果

各因素之間的交互作用,對紅曲菌9901利用柚子囊發酵生產Monacolin K的影響,可以通過多元回歸方程所作的三維空間的曲面圖及等高線圖直觀的反映出來[26]。從圖7中3個響應面圖,可以看出曲面最高點均在響應面上,故各因素的最優水平在所選范圍之內。各因素對Monacolin K產量影響越大,其響應面圖越為陡峭,從以上結果可以看出,A(初始含水量)、B(接種量)對紅色紅曲菌9901固態發酵柚子囊生產的Monacolin K積累量影響更大。結合表3、表4可以看出,實驗所選的3種因素均具有很好的交互作用,且交互作用的強弱分別為：AB>AC>BC。為進一步準確確定全局最優解,以最大化Monacolin K含量為優化目標,根據Design-Expert 10.0.1 軟件運行結果,Monacolin K含量在初始含水量A、乳糖添加量B、接種量C的共同影響下的最優工藝為：初始含水量A為46.4%、乳糖添加量B為3.4%、接種量C為8.5%,在此條件下模型預測的最大Monacolin K含量為6 970.8 mg/kg。按照此條件進行驗證,Monacolin K 產量達到6 984.9 mg/kg。與模型預測結果基本吻合,說明該模型預測值與實驗值具有良好的擬合性。

a-乳糖添加量和初始含水量的3D圖；b-接種量和初始含水量的3D圖；c-接種量和乳糖添加量的3D圖；d-乳糖添加量和初始含水量的等高線圖；e-接種量和初始含水量的等高線圖；f-接種量和乳糖添加量的等高線圖

3 結論

本實驗以具有降脂功效的Monacolin K為目標產物,通過對不同的食品副產物固態發酵基質進行篩選,最終選擇了柚子囊作為固態發酵基質。并確定紅曲菌9901利用柚子囊固態發酵產Monacolin K的最佳發酵條件為：初始含水量A為46.4%、乳糖添加量B為3.4%、接種量C為8.5%,在30 ℃培養2 d后,變溫到25 ℃培養至22 d,Monacolin K的產量可達6 984.9 mg/kg。

本實驗使用常見的食品副產物,原料易得且價格低；固態發酵對設備要求低、能耗低、水消耗量少、無污染、無廢料產生；發酵產物無需復雜的提取分離過程,可全部利用,進一步降低生產成本,對柚子產業深加工和開發下游的柚子系列產品都具有重要的指導意義。