大豆分離蛋白/魔芋葡甘聚糖復合脂肪模擬物的制備及結構分析

雷愛玲,范盛玉,王亞楠,陳厚榮,張甫生

(西南大學 食品科學學院,重慶,400715)

超重和肥胖已成為我國乃至全球嚴重的公共衛生問題[1],消費者對健康低脂產品具有很高的需求,消費低脂類產品已成為一種生活方式[2]。如何在降低脂肪攝入量的同時不影響食品的風味和口感成為食品領域的研究熱點,基于此脂肪模擬物應運而生。大豆分離蛋白(soy protein isolate,SPI)是應用最廣泛的植物蛋白,其蛋白質含量在90%以上,具有膠凝、乳化、溶解、起泡、成膜等多種優良特性,還能加快脂肪與能量的新陳代謝,與多糖混合可提供一種類似于脂肪的味道[3],現已有SPI在低脂食品方面的研究。PAGLARINI等[4]利用SPI制備乳液凝膠替代豬背脂肪,發現替代物不影響法蘭克香腸的質地、流變和感官性能。SUN等[3]發現SPI和納米纖維素比例為7∶1時,作為脂肪替代物加入冰淇淋中,取代10%的奶油,其接受度最高。

魔芋葡甘聚糖(konjac glucomannan,KGM)是從魔芋塊莖中提取的一種天然高分子中性雜多糖[5],由D-甘露糖和D-葡萄糖通過β-1,4糖苷鍵聚合而成,其在C-6位置有一個低程度的乙?；?在C-3位置有一些分支,這決定了它在水中的溶解度。其吸水性強、膨脹率高、黏度大且成膜性能極強,已被證實對人體健康有顯著的益處,能有效抑制脂肪酸的合成,具有一定的減肥效果。此外,KGM還具有抗高血糖和高膽固醇血癥、抗炎癥、益生元活性、預防癌癥等[6]功能。正是這些特性使KGM有潛力作為脂肪模擬物應用到食品中。DAI等[7]用KGM作為脂肪替代品應用于馬蘇里拉奶酪中,發現KGM能提升馬蘇里拉奶酪的一些理化特性。LI等[8]將微?；в竽z作為蛋黃醬中的脂肪模擬物,制得的低脂蛋黃醬具有更低的熱量和更高的貯藏穩定性,然而脂肪模擬物的添加對蛋黃醬的外觀和顏色有不利影響,替代水平低于30%時,可被接受。

目前,菊糖[9]、KGM[7]、乳清蛋白[10]、改性淀粉[11]等單一碳水化合物或蛋白質已作為脂肪模擬物應用于食品中,但由于單一脂肪模擬物沒有較好的貯藏穩定性,限制了其在食品中的應用。植物蛋白和多糖是2種重要的天然高分子生物聚合物,也是影響食品風味和質地的主要成分,二者相互作用會改變體系的結構、質地甚至產生新的功能特性,研究表明蛋白多糖復合體系可改善產品的表面活性[12]、乳化性、質地特性[13]并增強其凝膠性[14]。而目前蛋白-多糖復合物作為脂肪模擬物還有待進一步的研究?；诖?本研究以SPI和KGM為研究對象,通過濕熱處理制備復合脂肪模擬物,并探究總固形物含量、KGM添加量、加熱溫度、加熱時間對其性能的影響,通過響應面試驗優化復合脂肪模擬物的制備工藝,最后觀察復合脂肪模擬物制備工藝過程中粒徑顆粒分布及微觀結構的變化,從而得到潤滑、細膩的脂肪模擬物,以期為復合脂肪模擬物的深入研究提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

大豆分離蛋白(食品級),蛋白質含量>90%,上海源葉生物科技有限公司；魔芋膠(食品級),葡甘聚糖含量≥92%,上海北連生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器、HH-ZK8型數顯恒溫水浴鍋,鞏義市予華儀器有限責任公司；MCR302型模塊化旋轉與界面流變儀,奧地利安東帕有限公司；78-1型磁力加熱攪拌器,常州溴華儀器有限公司；XHF-D型高速分散器、SCIENTZ-10 ND型真空冷凍干燥機,寧波新芝生物科技股份有限公司；METTLER TOLEDO型高精數顯電子天平,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；Mastersizer 3000激光粒度儀,英國馬爾文儀器有限公司；Phenom Pro型掃描電鏡,荷蘭Phenom World公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 SPI/KGM復合脂肪模擬物的制備

稱取一定量的SPI溶解于蒸餾水中,在室溫下磁力攪拌1 h,待SPI完全溶解形成SPI懸浮液,向其中慢慢加入已稱量好的KGM,使二者充分攪拌均勻。然后置于恒溫水浴鍋中進行濕熱處理,使蛋白適度變性,將濕熱處理后的復合物冷卻至室溫,于4 ℃冰箱放置過夜,使其完全水化,以形成穩定、柔軟的復合體系。最后使用高速剪切機作微?；幚砑纯傻肧PI/KGM復合脂肪模擬物。

1.3.2 單因素試驗設計

選取總固形物含量(4%、6%、8%、10%、12%,質量分數)、KGM添加量(0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%,質量分數)、加熱溫度(55、65、75、85、95 ℃)、加熱時間(5、15、25、35、45 min)為試驗因素,探究其對SPI/KGM復合體系膨脹率及黏度的影響。

1.3.3 響應面試驗設計

在單因素試驗結果的基礎上,采用Box-Behnken Design的設計原理進行響應面優化。以KGM添加量、總固形物含量、加熱溫度作為響應因素,SPI/KGM復合體系的膨脹率和剪切速率為0.1/s時的黏度為響應值,設計3因素3水平的響應面試驗,獲得SPI/KGM復合脂肪模擬物的最佳制備條件,所有試驗重復3次。響應面試驗設計如表1所示。

表1 響應面試驗因素與水平

1.3.4 SPI/KGM復合脂肪模擬物的性能測定

1.3.4.1 膨脹率的測定

稱取一定量的SPI/KGM復合體系于燒杯中,并記錄空燒杯的質量m1,用打蛋器打發2 min后記錄混合物的質量m2,然后在另一空燒杯m3中加入與打發后的混合物同樣體積的水,并記錄其質量為m4,SPI/KGM復合體系的膨脹率按公式(1)計算[15]。

(1)

1.3.4.2 黏度的測定

使用流變儀對樣品進行靜態剪切流變測試[16],測試條件：50 mm平行板夾具,測試間距1 mm,測試溫度25 ℃,穩態模式,加樣后平衡2 min,剪切速率為0.1～100/s,取點模式為對數取點,取點數30個,測定各樣品黏度隨剪切速率變化的情況。

1.3.5 粒徑的測定

采用激光粒度儀測定樣品的顆粒大小,向裝有水的燒杯中緩慢加入樣品,待遮光度顯示8%～20%時進行測定[17]。參數設置：SPI折射率1.589,吸收率0.001,水折射率1.333,攪拌速度2 400 r/min,遮光度為8%～20%。重復測定6次,記錄結果的D10、D50、D90和D[4,3]。

1.3.6 微觀結構的測定

將制備好的樣品倒入90 mm培養皿中,使樣品均勻地涂膜在培養皿內,隨后置于冰箱預冷凍24 h,使樣品完全結成冰,放入真空冷凍干燥機中48 h,使樣品完全干燥,待用。用固定膠將樣品黏于雙面導電的樣品銅臺上,噴金[18]。之后在300和1 000放大倍數下使用掃描電鏡觀察,并選取有代表性的視野進行拍攝。鍍金法：真空度10-2～10-3Torr(1 Torr=133.322 Pa),濺射電壓1.1～1.2 kV,鍍膜時間2～3 min。鍍膜后樣品放置10 min。

1.4 數據統計與分析

試驗數據均用Origin 2019、SPSS Statistics 25和Design-Expert 8.0.6進行處理與分析,每次試驗3次平行,試驗結果以“平均值±標準差”表示,顯著性分析以Duncan’tests進行方差分析(ANOVA),P<0.05被認為存在顯著差異。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 KGM添加量對SPI/KGM復合體系性能的影響

黏度一般指施加于流體的應力和由此產生的變形速率以一定的關系聯系起來的流體宏觀屬性,表現為流體的內摩擦。膨脹率是蛋白質起泡能力的表現。KGM添加量對SPI/KGM復合體系性能的影響如圖1所示,KGM添加量在0.2%～1.0%時,SPI/KGM復合體系黏度一直增加,并且隨著剪切速率的增加,復合體系的黏度均呈下降趨勢,表現出典型的剪切變稀的非牛頓流體特征[19]。KGM添加量為0.2%～0.8%時,其膨脹率逐漸增強,并在KGM添加量為0.8%時,膨脹率最大,為49.29%。當KGM添加量為1.0%時,其膨脹率降低8.56%。隨著KGM添加量的增加,SPI和KGM表現出較好的兼容性,使得二者的相互作用增強,分子間結構發生變化,膨脹率增強,黏度增加[20]。

a-黏度;b-膨脹率

當KGM添加量>0.8%時,形成的復合體系硬度較大,二者的協同作用達到極點,故膨脹率降低。因此,選擇KGM添加量0.8%為最佳參數。

2.1.2 總固形物含量對SPI/KGM復合體系性能的影響

如圖2所示，總固形物含量在4%～12%時,隨著總固形物含量增加,復合體系的黏度呈上升趨勢;在4%～8%時,膨脹率隨著總固形物含量的增加而增加,并在8%時達到最大值,相較于4%,其膨脹率增加了12.92%;而在10%和12%,其膨脹率較最大值分別降低了2.68%、29.67%。SPI成凝膠的臨界濃度是8%,當總固形物含量為4%和6%時,二者未形成凝膠,故其黏度變化不大,表現為牛頓流體特征。而在高濃度(>6%)下,表現為牛頓流體,與田少君等[21]的研究結果一致。隨著總固形物含量增加,分子間形成了更緊密的網狀結構,使體系的黏度增大。此外,蛋白質在受熱過程中,暴露出更多的疏水基團,增大了物質分子間相互作用力的位點[22],在高速攪打的情況下,復合體系吸收和保持空氣數量的能力增強,故而膨脹率增強。當總固形物含量>10%時,所形成的復合體系黏度過高,攪打困難,故膨脹率降低。因此,選擇總固形物含量為8%進行后續優化試驗。

a-黏度;b-膨脹率

2.1.3 加熱溫度對SPI/KGM復合體系性能的影響

如圖3所示,隨加熱溫度的增加,復合體系的黏度和膨脹率呈先增加后降低的趨勢。在55～85 ℃時,復合體系的黏度和膨脹率隨加熱溫度的增加而增加,且在85 ℃時達到極大值358.3 Pa·s;當加熱溫度為95 ℃,與85 ℃相比黏度降低了39.44%,膨脹率降低了7.56%。與此同時,在不同加熱溫度下,復合體系的黏度均隨剪切速率的增大而減小。究其原因可能是溫度的增加,蛋白質分子呈舒展狀態,原來包埋在卷曲結構內部的疏水基團暴露在外面,與多糖發生相互作用,分子間發生聚集[23],導致復合體系黏度增加。但較高的溫度會破壞蛋白質的內部結構,使得體系內分子間的相互作用減弱,從而黏度下降。當溫度為55 ℃時,蛋白質開始變性,兩分子間還未出現交聯,聚集現象尚未表露,結合較弱[24]。因此,攪打下吸入空氣的能力較弱,膨脹率較弱。隨著溫度的升高,分子間的作用力增強,內部結合更緊密,故膨脹率增強。而當溫度繼續升高至95 ℃時,蛋白質分子中氫鍵、疏水作用等非共價鍵被破壞,使得分子間結合能力減弱,膨脹率降低。綜合考慮,選擇加熱溫度為85 ℃作為下一步試驗的最優參數。

a-黏度;b-膨脹率

2.1.4 加熱時間對SPI/KGM復合體系性能的影響

如圖4所示，隨加熱時間的延長,復合體系的黏度呈現先增加后減小的變化。在5～25 min時,隨加熱時間的延長,復合凝膠的黏度一直處于增大趨勢,并在25 min達到黏度最大值337.8 Pa·s,可能是在加熱過程中,分子結構被逐漸打開,結合了更多的水分[25]。但加熱時間>25 min時,其黏度下降,到45 min時,降至254.8 Pa·s,這可能是由于長時間加熱會破壞蛋白-多糖分子間的相互作用以及與水分子間的結合[26],使復合體系變得松散,導致其黏度下降。復合體系的膨脹率隨加熱時間的延長先增加后基本趨于穩定。在5～35 min時,其膨脹率增加了55.56%,其原因在于加熱時間延長,蛋白質表面疏水基團逐漸暴露,與多糖結合形成了更穩定的復合結構,從而膨脹率增加。綜合考慮,固定加熱時間為25 min。

a-黏度;b-膨脹率

2.2 響應面試驗結果

2.2.1 響應面試驗設計及結果

響應面分析是設計試驗的一種數學和統計方法,它能使試驗的次數最小化,以滿足特定數量的因素及其水平按試驗設計進行試驗[27-28]。綜合單因素試驗結果,以總固形物含量、KGM添加量、加熱溫度為響應因素,SPI/KGM復合體系膨脹率和黏度為響應值進行Box-Behnken響應面優化試驗。試驗設計及結果見表2。

2.2.2 響應面方差分析結果

利用Design-Expert 8.0.6軟件對表2試驗結果進行二次多元回歸擬合,回歸模型的方差分析結果見表3。模型P<0.01為極顯著,失擬項P>0.05為不顯著,說明建立的回歸方程擬合度較高。

表2 響應面試驗設計及結果

表3 回歸方程方差分析

對于膨脹率模型,其擬合回歸方程為：

Y1=0.55+0.073A+0.092B+0.028C+0.045AB-0.010AC+5.000E-003BC-0.071A2-0.16B2-0.12C2,R2=0.929 0

3種因素對SPI/KGM復合體系膨脹率影響程度的大小順序為：KGM添加量>總固形物含量>加熱溫度。一次項B與二次項B2、C2影響極顯著(P<0.01),一次項A與二次項A2影響顯著(P<0.05)。

對于黏度模型,擬合回歸方程為：

Y2=235.62+124.99A+120.79B-46.45C+24.62AB-11.95AC-3.80BC+38.68A2+27.13B2-14.6C2,R2=0.995 1

3種因素對SPI/KGM復合體系黏度大小的影響程度為：總固形物含量>KGM添加量>加熱溫度。一次項A、B、C和二次項A2、B2以及交互項AB影響極顯著(P<0.01)。

續表2

2.2.3 響應面分析

由響應面圖和等高線圖可直觀地反映兩因素間的交互作用,如圖5所示,在交互項對膨脹率大小的影響中,各因素間交互作用的響應面圖坡度較平緩,等高線較為松散,交互作用不顯著,與方差分析結果一致。如圖6所示,總固形物含量和KGM添加量交互作用的等高線較為密集,響應面圖坡度較為陡峭,說明兩者的交互作用顯著,與方差分析結果一致。而總固形物含量和加熱溫度,KGM添加量和加熱溫度間交互作用的等高線松散,響應面圖坡度平緩,說明其交互作用對SPI/KGM復合體系的黏度影響較弱。

a-總固形物含量和KGM添加量;b-總固形物含量和加熱溫度;c-KGM添加量和加熱溫度

a-總固形物含量和KGM添加量;b-總固形物含量和加熱溫度;c-KGM添加量和加熱溫度

2.2.4 SPI/KGM復合體系最優工藝的確定

通過Design-Expert 8.0.6軟件設計,得到的SPI/KGM復合體系的膨脹率和黏度的預測值分別為55%和237 Pa·s。考慮實際方便,調整模型最優制備工藝參數為：總固形物含量8%、KGM添加量0.8%、加熱溫度87 ℃。在此優化條件下對SPI/KGM復合體系進行3次平行試驗,測得SPI/KGM復合體系的膨脹率為53%,黏度為233.3 Pa·s。與預測值的相對誤差分別為3.64%、1.56%,均在可接受的范圍內。說明利用響應面優化法得到的回歸模型制備工藝參數能較準確地預測SPI/KGM復合體系膨脹率和黏度的大小,其結果真實可靠,具有重現性。

2.3 SPI/KGM復合脂肪模擬物粒徑的變化

蛋白質基脂肪模擬物的制備是基于蛋白質在加熱的條件下變性,使得疏水基團和區域暴露在分子表面,模擬油脂的疏水性狀,然后經微粒化處理降低顆粒直徑[29]。人體口腔黏膜對一定大小和性狀的顆粒的感知程度有一定的閾值,當粒徑<10 μm時已無法分辨出顆粒,從而能模擬出脂肪滑膩、柔軟的感覺[30-31]。脂肪模擬物制備過程的粒徑分布見表4和圖7所示,SPI/KGM復合體系在加熱前,其顆粒大小在83.4 μm左右；經熱處理后,其粒徑顆粒增加至105 μm左右,原因在于樣品受熱膨脹,顆粒明顯變大；隨著破碎時間的延長,粒徑分布各項參數呈下降趨勢。當微粒化處理20 min時,50%的樣品顆粒直徑在8.75 μm左右,符合以蛋白質為基質制備脂肪模擬物的顆粒要求(<10 μm)。此外,破碎時間越長,樣品的峰形越細,顆粒分布越均勻[32]。因此選擇破碎20 min作為SPI/KGM復合體系的微粒化條件。

表4 脂肪模擬物制備過程粒徑分布

圖7 不同處理方式對SPI/KGM復合體系粒徑大小的影響

2.4 掃描電鏡結果分析

分別對加熱前、加熱后、微粒化后的樣品做掃描電鏡觀察,得到其微觀結構(300×和1 000×)見圖8。SPI/KGM混合物(圖8-a)呈球狀顆粒,混合物分散狀態較好,顆粒較小且均勻。經加熱變性后(圖8-b),分子顆粒受熱膨脹,且SPI和KGM相互運動,使得顆粒之間發生交聯,形成了較為致密的海綿狀三維網狀結構[33],且連接處的支架結構變厚,說明體系的強度和彈性增強。樣品經真空冷凍干燥后存在小孔隙,與粗大孔隙結構相比,具有小孔隙結構的體系具有更好的吸水能力和保水能力[34]。這些孔隙被SPI/KGM復合體系緊緊的包圍,從而截留大量的水和營養物質的損失[35],被截留的水具有一定的流動性,感覺類似脂肪。然而蛋白質分子經濕熱處理后,疏水基團和區域暴露在外,分子的親水性降低,疏水性增強。

a-SPI/KGM復合物;b-加熱后SPI/KGM復合物;c-微粒化后SPI/KGM復合物

另一方面,濕熱處理過程中,物料之間發生復雜的締合作用,形成大分子絡合物,增強了脂肪模擬物的性質穩定性。但其樣品表面呈粗糙,砂樣質構的凝膠體,無法模擬脂肪細膩、潤滑的口感。經微?；夹g處理后的SPI/KGM復合體系(圖8-c)片狀結構明顯,表面細膩光滑,顆粒變小(<10 μm),主要是由于在高速剪切作用力下,樣品顆粒變小,從而減小了食品與舌頭感知的摩擦力,此時可作為脂肪模擬物。

3 結論

隨著現代人對健康低脂食品的追求,脂肪模擬物得到廣泛的關注。通過濕熱處理制備SPI/KGM復合體系,利用單因素和響應面試驗研究了制備工藝參數對復合體系膨脹率及流變特性的影響,確定最佳總固形物含量為8%、KGM添加量為0.8%、加熱溫度為87 ℃,在此優化條件下SPI/KGM復合體系的膨脹率可達53%,黏度可達233.3 Pa·s。試驗表明,SPI/KGM復合體系的膨脹率及流變特性表現出較理想的脂肪模擬物性狀,且都呈現假塑形流體特性。最后用微?；夹g處理得到的脂肪模擬物粒徑<10 μm,低于人體口腔黏膜的感覺閾值,樣品表面變得光滑細膩,具有良好的脂肪性狀,可拓展其在低脂低熱量食品的應用。復合脂肪模擬物是脂肪替代品的發展趨勢,為達到更好的替代脂肪效果,在脂肪模擬物的保濕技術、香氣保持、抑菌技術等方面的研究還應做進一步探索。