四株乳桿菌作為口腔益生菌的特性研究

余意,王超越,吳正鈞,張佳,吳天賜

1(上海海洋大學 食品學院,上海,201306)2(光明乳業股份有限公司乳業生物技術國家重點實驗室,上海乳業生物工程技術中心,上海,200436)

齲齒在成人和兒童中是一種常見的慢性口腔疾病,主要表現為口腔細菌利用可發酵碳水化合物產酸導致的牙齒組織的脫鈣[1],其中恒牙齲齒最為常見[2]。根據第4次全國3～5歲兒童口腔健康調查,顯示齲齒患病率分別為50.8%、63.6%和71.9%[3]。由多種細菌、真菌和這些微生物分泌的黏性高分子聚合物組成的牙菌斑是自然界最復雜的生物膜系統之一,其覆蓋于牙齒表面,是導致齲齒發生的主要誘因[4]。

研究表明,變異鏈球菌(Streptococcusmutans)是一種重要的口腔致齲細菌[5-6]。在蔗糖存在的情況下,S.mutans可以合成一種不溶性胞外多糖,這種不溶性胞外多糖可作為牙菌斑擴展的支持性框架[7-9]。其除了保護所嵌入的微生物細胞外,還被認為具有促進其他微生物黏附于牙釉表面的作用等[10]。

乳桿菌是口腔微生物群的重要組成部分,與個體的口腔健康狀況有關[11];它們約占可培養口腔微生物群的1%,從口腔微生物群中分離的最常見的乳桿菌包括干酪乳桿菌、副干酪乳桿菌、植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、發酵乳桿菌、嗜酸乳桿菌和唾液乳桿菌[12]。與從活動性齲齒個體口腔分離的菌株相比,從無齲齒個體口腔中分離的乳桿菌菌株具有顯著抑制S.mutans生長的能力[13-14]。

益生菌被定義為“以活菌形式攝入足夠量后,對宿主健康具有明確的促進作用(WHO/FAO,2001)”。將益生菌作為膏劑或漱口液輸送到牙齒,可使益生菌集中在牙齒生物膜區域,從而消除或減少致病菌[15]。益生菌改善口腔健康的作用被認為與病原體爭奪生態位和營養有關,但大多數菌株的作用機制尚不明確,可能包括生產乳酸、過氧化物、細菌類抗菌物質以及調節宿主的免疫應答等[16]。姚沛琳等[17]從多個樣本中分離出97株乳酸菌,研究其對S.mutans生物膜各種結構的變化,最終發現1株韓國魏斯氏菌表現出潛在的預防齲齒的作用。有研究從四川泡菜中分離得到5株具有抑菌作用的植物乳桿菌,并綜合選育出植物乳桿菌K41,觀察K41與致病菌作用前后生物膜質構以及活菌數的變化,并進行動物實驗驗證了此菌對齲齒具有預防作用[18]。

在體外試驗中,發酵乳桿菌B44 (LimosilactobacillusfermentumCGMCC 17321)、植物乳桿菌ST-III (LactiplantiacillusplantarumCGMCC 0847)、干酪乳桿菌LC2W (LacticaseibacilluscaseiCGMCC 0828)和鼠李糖乳桿菌B6 (LacticaseibacillusrhamnosusCGMCC 13310)表現出抑制S.mutans生長的能力。本文通過細胞表面特性、自聚及與S.mutans共聚作用、對溶菌酶的耐受性、抑制S.mutans生長和生物膜形成等指標的測試,分析了這4株乳桿菌作為口腔益生菌的潛力。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗菌種及培養基

變異鏈球菌(StreptococcusmutansCGMCC 12499),中國普通微生物保藏中心;發酵乳桿菌B44 (LimosilactobacillusfermentumCGMCC 17321)、植物乳桿菌ST-III (LactiplantiacillusplantarumCGMCC 0847)、干酪乳桿菌LC2W (LacticaseibacilluscaseiCGMCC 0828)、鼠李糖乳桿菌B6 (LacticaseibacillusrhamnosusCGMCC 13310),乳業生物技術國家重點實驗室提供；保加利亞乳桿菌LB340(Lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricusLB340),丹麥漢森公司；MRS培養基,德國Merck公司;BHI培養基,Oxoid公司。

1.1.2 主要儀器與設備

Spectra M5型酶標儀,美國Molecular Devices公司；SPECORD分光光度計,德國耶拿分析儀器股份公司；Bioscreen C型全自動生長曲線分析儀,芬蘭OY Growth Curves公司；BX60熒光顯微鏡,日本OLYMPUS公司；NOVA NanoSEM 230低真空超高分辨場發射掃描電子顯微鏡,美國FEI公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 乳桿菌菌落形態和電鏡觀察

將L.fermentumB44、L.plantarumST-III、L.caseiLC2W和L.rhamnosusB6分別劃線接種于MRS固體培養基上,37 ℃厭氧培養24 h。挑取單菌落,收集菌體,用pH 7.0無菌磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)洗滌3次后,再用體積分數為2.5%的戊二醛置于4 ℃固定8 h以上,PBS洗滌3次,隨后用體積分數為50%、75%、95%和無水乙醇分級脫水后,進行臨界點干燥和掃描電鏡的觀察[19]。

1.2.2 不同乳桿菌菌體的制備

將新活化的4株乳桿菌和S.mutansCGMCC 12499分別接種于新鮮的MRS和BHI液體培養基中,37 ℃靜置培養24 h,在4 ℃、10 000 r/min條件下離心10 min后收集菌體,用無菌PBS洗滌3次,最后將菌體懸浮于少量PBS中,備用。

1.2.3 不同乳桿菌細胞表面疏水性和酸堿電荷的測定

細胞表面疏水性的測定采用SAMOT等[20]的方法,并稍作修改。乳桿菌過夜培養24 h后,于4 ℃、10 000 r/min下離心10 min后收集菌體,將菌體懸浮于pH 7.0的PBS中,在波長600 nm下調節吸光度為(0.6±0.2),記做A0,將1 mL二甲苯加入到上述已經調節過濃度的3 mL菌液中,在室溫下預先培養10 min后,振蕩2 min,再在室溫下孵育20 min后測定水相的OD600,記做A1。按公式(1)計算疏水率(R1)：

(1)

式中：R1,疏水率,%；A1,孵育后水相OD600；A0,初始水相OD600。

1.2.4 不同乳桿菌自聚集能力和共聚能力的測定

自聚集試驗[18]按照如下方式進行：將制備的乳桿菌懸液用PBS調整初始吸光度A0=0.6±0.02,室溫,靜置。在隨后的8 h內每隔2 h吸取菌懸液上層,測量吸光度At。按公式(2)計算自聚力(R2)：

(2)

式中：R2,自聚力,%；At,t時間的吸光度,t分別為2、4、6和8 h；A0,乳桿菌初始吸光度。

對于共聚試驗,將等量的乳桿菌和S.mutans混合,并在隨后的8 h內測量上懸浮液的吸光度。按公式(3)計算共聚力(R3)：

(3)

式中：R3,共聚力,%；At,t時間的吸光度,t分別為2、4、6和8 h；A0,乳桿菌初始吸光度；AS0,S.mutans初始吸光度。

1.2.5 不同乳桿菌對溶菌酶的耐受性

參考姚沛琳[17]的方法并稍作修改。分別挑取新鮮平板上的不同乳桿菌置于適量新鮮MRS液體培養基,培養24 h后于4 ℃、10 000 r/min離心10 min,收集菌體重懸于MRS液體培養基,以空白MRS為對照,調節OD600=0.1±0.02,取10 μL菌懸液分別接入100 μL不同質量濃度梯度的溶菌酶溶液(0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL),而后取20 μL處理后的菌懸液接入100孔板,分別加入180 μL空白MRS,37 ℃靜置培養24 h,用全自動微生物生長曲線分析儀每隔1 h測定OD600的值,共測24 h。試驗進行3次重復,每組設置3個平行組。

1.2.6 不同乳桿菌自身生物膜形成能力的測定

參照 KHAN等[21]的方法進行。將活化好的乳桿菌接種于含有 3 g/L蔗糖的BHI培養基中,37 ℃厭氧培養18 h,用空白的含有3 g/L蔗糖的BHI培養基調整OD600=0.5±0.02,然后取 0.2 mL菌懸液加入到96孔板中。37 ℃培養24 h,棄游離細菌,每孔用 0.2 mL 去離子水輕柔洗滌 3 次；自然干燥后每孔加入0.05 mL 10 g/L 的結晶紫溶液,室溫下染色 15 min,使黏附的細菌著色；傾去染色液后,用去離子水洗滌3次以上；干燥后每孔加入0.2 mL 乙醇/丙酮混合液,使孔內的結晶紫充分溶解,酶標儀600 nm波長處測定吸光度。以相同條件下S.mutans生物膜形成能力為對照組,各實驗組每次做3個以上平行,重復3次。

1.2.7 不同乳桿菌發酵上清液對S.mutans黏附性和生物膜消除作用的測定

乳桿菌無細胞發酵上清液的制備：將新活化的乳桿菌接種至MRS液體培養基中,37 ℃培養24 h,4 ℃、9 000 r/min離心15 min,去菌體。上清液用0.22 μm的膜過濾,獲得無細胞發酵上清液,-20 ℃ 貯藏備用。

利用96孔板,每孔加入200 μLS.mutans的菌懸液培養24 h后,棄除培養液,用PBS洗滌2次,去除孔內殘留培養液后每孔加入200 μL乳桿菌無細胞發酵上清液,其中每種上清液做3組平行,并以等量無菌MRS作對照,然后將96孔板放置于37 ℃培養24 h,采用結晶紫染色的方法測定乳桿菌無細胞發酵上清液對S.mutans生物膜的消除作用[22]。

在測定乳桿菌無細胞發酵上清液對S.mutans黏附作用時,在96孔培養板中每孔加入S.mutans菌懸液和乳桿菌無細胞發酵上清液各100 μL,37 ℃培養24 h,利用結晶紫染色法測定S.mutans黏附性的變化。

1.2.8 不同乳桿菌發酵上清液對S.mutans生長的影響

按照姚沛琳等[17]的實驗方法并稍作修改。將S.mutans接種于BHI液體培養基,厭氧培養18 h,用空白BHI調節OD600=0.5±0.02,取0.5 mLS.mutans菌懸液和等量的乳桿菌無細胞發酵上清液加入到1.5 mL新鮮的BHI液體培養基中,37 ℃培養24 h后測定OD600值,對照組以0.5 mL空白MRS培養基代替乳桿菌上清液。

2 結果與分析

2.1 菌落形態和電鏡觀察結果

L.rhamnosusB6、L.fermentumB44、L.caseiLC2W和L.plantarumST-III在固體MRS培養基上均呈現白色、圓形的菌落形態,表面濕潤光滑,邊緣規則,無色素產生。其中L.fermentumB44菌落較大且黏度強,結果見圖1。掃描電鏡觀察結果顯示,4株乳桿菌都呈現規則的桿狀結構,菌體表面光滑,邊緣清晰。但4株乳桿菌的粗細、長短略有區別,相比于其他3株菌,L.plantarumST-III呈現短而粗的桿狀形態(圖2)。

圖1 四株乳桿菌的菌落形態

圖2 四株乳桿菌的菌體形態

2.2 不同乳桿菌表面疏水性和酸堿電荷的測定

菌體表面疏水性和酸堿電荷跟菌株和宿主之間的非特異性黏附相關。當菌體表面具有較低的酸電荷和較高的堿電荷時不會促進生物膜的形成,而菌株的表面疏水性越高,更加有助于對上皮細胞的黏附[23]。如表1所示,以L.delbrueckii340為對照,B44、LC2W和ST-III 這3株乳桿菌疏水性顯著高于L.delbrueckii340,表明其在口腔內的黏附能力強。B6、B44、LC2W、ST-III 4株乳桿菌表面疏水性依次遞增,而它們的自聚集能力呈現出依次遞增趨勢,兩者間呈正相關(圖3)。有研究表明,月見草種子提取物在體外可降低S.mutans表面疏水性抑制其黏附,并降低該菌在動物模型中的致齲性[24]。在徐顯睿等[25]的研究中,分別以氯仿和乙酸乙酯作為路易斯酸和路易斯堿,測得鼠李糖乳桿菌LGG的靜電作用≥11.06%,表面疏水性在40%左右。在本實驗中,4株乳桿菌靜電作用高于鼠李糖乳桿菌LGG(表1),而靜電作用與對S.mutans黏附性的影響之間具有一定的相關性,菌株酸堿電荷越高,對S.mutans的黏附性的抑制作用越強(圖7-b)。

表1 待測菌株表面疏水性和酸堿電荷的測定

圖3 不同乳桿菌在2、4、6、8 h的自聚集能力

2.3 不同乳桿菌自聚集能力和共聚集能力的測定

益生菌的自聚集能力與其黏附宿主細胞的能力有一定的關系,菌體自聚集能力越強,其在口腔內定殖能力越好,對其在口腔內的存活起到重要作用,并且較高的自聚集能力,可以提高口腔環境內的益生菌濃度,使其發揮更好的功能[26]。但也有研究表明,高聚集能力也是一些口腔內致病菌引起口腔疾病的重要因素[27]。乳桿菌在與致病菌S.mutans共孵育過程中,如果共聚集能力強,可以隨著唾液流動和口腔清潔等行為,減少口腔內致病菌的數量,進而達到減少致病菌在口腔內荷載的效果。如圖3和圖4所示,在4個不同的時間段內,不同乳桿菌之間的自聚集能力和共聚能力均存在顯著性差異(P<0.05),同時4株乳桿菌的自聚集能力和共聚能力對孵育時間呈現依賴性關系,隨著孵育時間的延長,不同乳桿菌的聚集力越強。L.rhamnosusB6初期自聚集能力較弱,而其在6～8 h間共聚集能力顯著提高,說明菌株與致病菌S.mutans的交互凝集作用增強,此結果與張秋香等[28]的實驗結果相符。綜合而言,4株乳桿菌在測試時間內,都具有較好的自聚集和共聚集能力。

圖4 不同乳桿菌與S.mutans的共聚能力

2.4 不同乳桿菌對溶菌酶的耐受性

口腔唾液中含有豐富的溶菌酶,質量濃度為20～80 μg/mL[29],可有效殺死一些革蘭氏陽性菌。乳桿菌對溶菌酶的耐受性是衡量其能否在口腔內存活的重要因素。在不同濃度溶菌酶中孵育24 h后,盡管4株乳桿菌懸浮液的OD600值隨著溶菌酶濃度的增大出現輕微的波動,但并未出現明顯降低(圖5)。被測試的4株乳桿菌均能耐受質量濃度為1 mg/mL的溶菌酶,遠高于人類口腔中溶菌酶的質量濃度(1～57 μg/mL)[27],因而這些菌株具備在口腔中存活的能力。

圖5 不同乳桿菌對溶菌酶的耐受性

2.5 不同乳桿菌自身生物膜形成能力的測定

有研究表明,除了S.mutans菌外,部分乳桿菌和雙歧桿菌也可能與早期齲齒的發展有關聯[30]。因此,作為潛在的口腔益生菌,其自身形成生物膜的能力也是一種重要的衡量指標。為避免對口腔內生物膜的形成起促進作用,要求其自身生物膜形成能力較弱。4株乳桿菌形成生物膜的能力遠遠低于S.mutans(P<0.05),該結果與張秋香等[28]的結果相似,而L.bulgaricus340與這4株乳桿菌相比,自身生物膜形成能力相對較高(圖6)。

圖6 不同乳桿菌形成生物膜的能力

2.6 不同乳桿菌對S.mutans生物膜的消除作用和黏附性的影響

口腔內的S.mutans是導致齲齒發生的主要致病菌[7],該菌具有較強的耐酸性,并且能夠利用蔗糖合成不溶性胞外多糖,進而促進口腔內其他菌群在牙齒表面聚集,形成牙菌斑生物膜,導致齲齒。因而,消除S.mutans已形成的生物膜,可以起到一定的治療齲齒的作用。與空白MRS相比,4株乳桿菌的無細胞發酵上清液對S.mutans生物膜均具有顯著的消除作用(P<0.01),消除率分別為31.04%、53.82%、54.28%和31.69%。但L.delbrueckii340這株菌與4株菌相比,其無細胞發酵上清液對S.mutans生物膜的消除作用明顯減弱(P<0.01)(圖7-a)。同時,除L.delbrueckii340之外,其他4株乳桿菌的無細胞發酵上清液都可以顯著降低S.mutans對固型介質的不同乳桿菌黏附作用(圖7-b)。

a-對生物膜的消除作用；b-對黏附性的影響

2.7 不同乳桿菌發酵上清液對S.mutans生長的影響

S.mutans與不同乳桿菌發酵上清液混合培養后,與對照組(空白MRS)相比,除了L.delbrueckii340,其他4株乳桿菌都對S.mutans的生長有顯著抑制作用(P<0.01)。L.rhamnosusB6、L.fermentumB44、L.caseiLC2W和L.plantarumST-III對S.mutans生長的抑制率分別高達57.42%、37.57%、49.72%和61.92% (圖8)。而L.rhamnosusB6、L.fermentumB44、L.caseiLC2W、L.plantarumST-III和L.delbrueckii340上清液與S.mutans混合培養后pH無明顯差異,推測除了有機酸的影響外,還有其他因素對S.mutans的生長產生了顯著影響。

圖8 不同乳桿菌上清液對S.mutans生長的影響

3 結論

在體外試驗中,4株乳桿菌細胞都具備較好的疏水性和靜電作用,這有利于其在口腔內的黏附；能夠耐受高濃度的溶菌酶,具備在口腔環境中存活的能力；其次,它們表現出較強的自聚及與S.mutans共聚能力,有助于其在口腔的停留及減少口腔內致病菌的荷載。更重要的是,這4株乳桿菌可以抑制S.mutans的生長,其代謝產物可有效降低S.mutans的黏附性且對其形成的生物膜具有一定的消除作用,同時,自身生物膜形成能力較弱。因而,4株乳桿菌具備作為口腔益生菌的潛力。