不同強化方式對濃香型白酒大曲特性的影響

陳曉茹,黃鈞,周榮清*,張宿義,董異,王超,王小軍,吳重德,金垚

1(四川大學 輕工科學與工程學院,四川 成都,610056) 2(四川省瀘州市瀘州老窖股份有限公司,四川 瀘州,646000)

作為我國獨特的酒精飲料,白酒生產過程主要包括大曲生產、發酵、蒸餾和貯存與勾兌等主要步驟[1]。大曲,被譽為“酒之骨”,既是后續發酵過程的粗酶和微生物菌劑,又是釀酒過程中必不可少的原料之一[2]。優質大曲為白酒提供重要的呈香物質及風味前體成分。隨著對大曲微生物菌群功能的深入了解[3-4],篩選及分離菌株在強化大曲中的應用已是目前關注的熱點之一。如LI等[5]將片球菌、酵母菌等不同種屬的菌株接種到大曲坯中,提高了成曲的微生物群落豐度,改善了發酵穩定性,接種分離株謝瓦散囊菌(Eurotiumchevalieri)強化大曲發酵改善了其風味性能[6],接種短小芽胞桿菌(Bacilluspumilus)則使大曲液化力提高了125%[7]。基于產已酸乙酯能力強的酵母菌株及菌群對大曲群落及代謝組分影響的研究結果表明,菌株及菌群的強化對大曲群落及代謝組分的貢獻差異顯著[8]。上年陳曲接種在曲坯調控醬、清香型大曲群落及代謝的傳統工藝由來已久,但迄今未見陳曲強化濃香型大曲生產的報道。

本文以分離株地衣芽胞桿菌(B.licheniformis)和陳曲強化濃香型大曲為研究對象,對其主要理化性質、微生物群落及揮發性組分的影響規律進行研究,旨在為濃香型大曲的定向調控奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 微生物及培養基

微生物菌株：Bacilluslicheniformis,從瀘州老窖濃香型大曲中分離,經形態生理生化及分子生物學鑒定為地衣芽孢桿菌,保藏于本實驗室。

種子培養基(g/L)：蛋白胨10,牛肉膏3,NaCl 5,pH(7.4±0.2)。

1.2 主要藥品與試劑

辛酸甲酯,北京百靈威化學試劑有限公司；其他化學試劑均為分析純,本地化學商品試劑供應商提供。

1.3 主要儀器和設備

TSQ9000 ΙΙ氣相色譜-質譜聯用儀,美國賽默飛世爾公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭,美國Supelco公司。

1.4 實驗方法

強化大曲生產：B.licheniformis菌懸液和陳曲粉分別以7.2×106CFU/g(以菌體濕重記)和1% (質量分數)接種到大曲坯中,在瀘州老窖股份有限公司制曲中心發酵。功能菌株強化的大曲樣品縮寫為C,相應地在同曲房的對照樣為B-1；陳曲強化的大曲樣品為S,同曲房同批次的對照樣為B-2。貯存6個月,按參考文獻[9]所述方法取樣,送至本實驗室保藏于-20 ℃冰箱待分析檢測。

1.5 分析檢測方法

1.5.1 感官檢測

大曲感官評價參照文獻[10],在自然光下對曲塊的外觀、斷面和香味由10名專業人士組成的品評小組進行綜合評定。

1.5.2 理化參數分析

大曲理化指標的測定：參照QB/T 4257—2011《釀酒大曲通用分析方法》[11]檢測,每組樣品取3組平行樣。

1.5.3 揮發性組分測定

樣品的前處理：參考DING等[12]所述方法稍作修改。稱取樣品1.00 g于25 mL頂空瓶中,加入10 μL的辛酸甲酯(0.0 079 g/100 mL)作為內標。置于恒溫攪拌器中500 r/min、(60±1)℃預熱平衡15 min,吸附提取50 min。結束后,將SPME纖維插入GC進樣口解吸5 min,檢測揮發性組分。

GC-MS檢測操作條件：40 ℃保持5 min,以4 ℃/min升至100 ℃不保持,再以6 ℃/min升至230 ℃保持10 min,進樣口溫度為270 ℃。離子源溫度為300 ℃,質譜掃描范圍為m/z35～400。

檢測質譜數據通過與標準譜庫(NIST2017)對照進行組分鑒定,對匹配度大于800的物質予以分析。采用峰面積歸一化法確定揮發性組分的相對含量。

1.5.4 大曲微生物群落組成檢測

按照Fast DNA SPIN提取試劑盒提得基因組DNA,用1%瓊脂糖凝膠電泳測其純度,取3 μL經NanoDrop ND-1000分光光度計測定A260/A280值,檢驗是否有RNA和蛋白質污染。用338F和806R對細菌的16S rRNA基因高變區V3～V4區域和真菌的ITS5和ITS1區域進行擴增。擴增的操作條件：25 μL,5×reaction buffer和5×GC buffer 各5 μL,0.25 μL DNA聚合酶(5 U/μL,Q5 High-Fidelity),2 μL dNTPs(2.5 mmol/L),正反引物各1 μL(10 μmol/L),2 μL DNA模板,8.75 μL ddH2O。細菌擴增程序為98 ℃預熱2 min,98 ℃變性15 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,一共25個循環,最后72 ℃保持5 min。真菌擴增程序：95 ℃預熱3 min,95 ℃變性30 s,61 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s,共32個循環,最后72 ℃保持10 min。PCR產物瓊脂糖凝膠進行目的片段純化回收。送派森諾生物科技有限公司在2×300 Illumina Miseq平臺上測序。

原始序列使用QIIME pipeline進行處理,依據CAPORASO等[13]描述的方法去除一些低質量序列。最后使用UCLUST把高質量的序列聚成不同的操作性分類單元(operational taxonomic units,OTU)[14]。多樣性是指某個群落或生境內部的物種多樣性,Chao1和Observed species指數用于反映菌群豐度,Shannon和Simpson指數用于表征菌群多樣性。

1.5.5 數據處理

顯著性分析：使用IBM SPSS Statistics 19軟件對理化和風味數據進行顯著性分析,方法采用單因素ANOVA分析的Duncan檢驗法(P<0.05,n=3)。冗余分析(redundancy analysis,RDA)：使用Canoco 5.0軟件尋找出微生物群落與特征風味組分之間的關系。

2 結果與分析

2.1 微生物組成的差異

Illumina MiSeq測序結果中高質量有效序列的覆蓋度均大于99%,說明測序結果準確可靠。樣品間細菌和真菌的微生物多樣性指數的差異如表1所示。2種不同強化方式均改變了群落的多樣性。純培強化提高了細菌和真菌的豐富度,細菌的多樣性無顯著變化,而真菌的多樣性增高。陳曲強化提高了大曲細菌的豐富度和多樣性,但降低了真菌的豐富度和多樣性。強化擾動對細菌群落的豐富度影響更顯著,且陳曲強化則對細菌和真菌都有顯著的影響。

表1 四種大曲微生物群落α-多樣性指數

測序的OTU的細菌和真菌分別歸類到106和52個不同屬,其中豐富度>0.5%的群落組成輪廓如圖1所示。對照大曲(B-1和B-2)聚類在同簇(圖1-a),魏氏斯菌屬(Weissella)分別是31.34%和75.20%。樣品B-1的糖多孢菌屬(Saccharopolyspora)、嗜熱放線菌屬(Thermoactinomyces)分別是23.26%、13.17%。此外,曾報道的是優勢細菌的乳酸桿菌屬(Lactobacillus)和芽胞桿菌屬(Bacillus)在2個樣品中比例類似。C曲中Bacillus的豐度是88.28%,而在S曲中Kroppenstedtia、海洋桿菌屬(Oceanobacillus)的豐度分別是48.02%和14.76%,曾報道是特香型大曲中的優勢細菌[15],且前者在白酒釀造中的作用報道甚少[16]。在古井中溫大曲中豐度高達84%的枝芽胞桿菌屬(Virgibacillus)[17],在S曲中僅為8.91%。如圖1-b所示,散囊菌目(Eurotiales)是對照曲的優勢真菌,嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)和毛霉屬(Rhizomucor)在B-1中的豐度分別是36.60%和31.68%,而曲霉屬(Aspergillus)和畢赤酵母屬(Pichia)分別是18.96%和8.62%。在B-2中Aspergillus的相對豐度是78.01%,Thermoascus和Pichia次之。在C曲中曲霉科(Aspergillaceae)的相對豐度是75.73%,而在S曲中Pichia為優勢真菌,豐度為82.06%,該菌是賦予獨特風味特征的主要貢獻者[18],且Hyphopichia(3.34%)與乙酸乙酯呈正相關[19]。

a-細菌；b-真菌C-功能菌株強化的大曲樣品;B-1-相應在同曲房的對照樣；S-陳曲強化的大曲樣品,B-2-相應同批次的對照樣

2.2 強化方式對大曲感官和理化性質的影響

依據大曲相關標準對該實驗中的4種大曲從外觀、斷面和香味3個方面進行評價。傳統大曲B-1和B-2類似,菌絲生長較好,只有單純的曲香味。C曲樣有一些雜菌菌斑,酸味重,且有刺鼻的焦香味,這可能與樣品中吡嗪類含量高有關。而S曲樣的色澤均衡,同時香味濃郁無刺鼻味。

如表3所示,C曲的淀粉酶、糖化酶和酯化酶的活力較對照的低,而S曲與相應的對照無顯著的差異,這與S曲樣中有更高豐度的高溫放線菌科(Thermoactinomycetaceae)有關,有研究報道[20]該菌能產高溫淀粉酶能促進原料的糖化和液化。S曲的酯化力顯著高于相應的對照,可能與其酯含量及后續白酒中酯類組分含量正相關的作用[21]。C曲的酸度高于相應的對照曲,但S曲則相反,可能與接種的Bacillus降解蛋白質等組分能力較強,并且有益產酸細菌如Lactobacillus、Weissella和明串珠菌屬(Leuconostoc)等的繁殖有關[22]。相比對照,強化發酵大曲的發酵力降低,可能與其真菌豐度增高,淀粉等底物水解率減少,且淀粉降解與降解物代謝能力等多邊發酵失衡有關[23]。大曲中的發酵力、糖化力和液化力間的平衡關系是維系大曲的釀造學特性的重要參數,較這些參數的高低更能揭示其大曲對白酒產率和品質的貢獻[24]。

表2 不同大曲感官特征比較

表3 不同方式強化大曲和傳統大曲理化性質表

2.3 揮發性組成的異同

從這些樣品中檢出的揮發成分數量與含量因大曲類型不同而異。檢出揮發成分在50～90種,C曲的總量為(920 152.11±2 029.47)μg/kg,S曲則為(11 719.55±159.47)μg/kg,相應的對照樣品分別是(3 586.40±851.16)μg/kg和(5 185.45±907.95)μg/kg。這些成分根據其化學結構特征分為8類不同組,包括酯、醇、酸、醛、吡嗪、酮、酚和其他類。

接入Bacillus使C曲的醇和吡嗪類顯著提高,含量高達14 349.60 μg/kg,占總揮發性的71.21%。吡嗪類中主要由四甲基吡嗪、三甲基吡嗪和2,3-二甲基吡嗪等組分,分別較對照樣品增加了5 422.57%、1 042.85%和684.43%,醇類也提高了5.41倍,主要是2,3-丁二醇含量增高所致。該成分具有濃郁的果香[25],賦予白酒入口香甜、綿長的特色[26]。酯類成分則降至(3 692.24±624.63)μg/kg。

C-功能菌株強化的大曲樣品;B-1-相應在同曲房的對照樣；S-陳曲強化的大曲樣品;B-2-相應同批次的對照樣

接入陳曲強化的S曲樣則使酯類成分含量增至(5 111.21±309.76)μg/kg,己酸乙酯增高106.50%。類似C曲,吡嗪類的含量也增高了,四甲基吡嗪高達(2 143.44±321.92)μg/kg,是主要的共獻者,該成分可賦予白酒堅果、焦香味等芳香特色[25]。同時,僅在S曲中檢出石竹烯和杜香醇,賦予其辛香、樟腦香、木香[27]及桃香味[28]等獨特風味。

2.4 揮發性與微生物的相關性

RDA解析群落中優勢種屬與特征風味組分相關性的結果如圖3所示。C曲中吡嗪類、醇類及芳香族組分與Bacillus呈顯著的正相關,尤其是四甲基吡嗪、2,3-丁二醇、1,3-二甲基苯和1,2,4-三甲基苯是分離株強化的優勢揮發性成分。類似曾報道的結果[29],分離株強化,增高了其豐度,相應的優勢成分的含量顯著提高。相反地,陳曲強化濃香型大曲的酯、醇、酸等優勢組分含量均衡增高,吡嗪的含量也增加。這些組分與根霉屬(Rhizopus)[30]、Pichia[15]等豐度呈正相關,如異戊酸和己酸乙酯,這與2個種屬的相應的酸的分泌能力和產酯能力較強有關。S曲豐度較高的kroppenstedtia、Oceanobacillus具備產石竹烯和杜香醇等能力,所以與其豐度呈正相關。石竹烯和杜香醇雖在白酒釀造中被檢出,但對白酒風味的特征貢獻待深入研究[16]。此外,對照曲中的Aspergillus的豐度較高,且與3-辛酮、1-辛烯-3-醇和棕櫚酸乙酯呈正相關。

圖3 基于微生物群落與風味代謝物的冗余分析

3 結論

分離功能菌株和優質陳曲強化大曲發酵,對大曲理化性質、微生物群落多樣性及揮發性組分的影響差異顯著。分離功能菌株強化提高了細菌和真菌的豐度,但使細菌多樣性降低,真菌多樣性增高,理化參數降低,顯著提高了功能菌的目標產物的含量。優質陳曲強化大曲發酵,提高細菌的豐富度和多樣性,但降低了真菌的豐富度和多樣性,但理化性質幾乎相同,主要揮發成分的組成亦類似,但含量顯著提高,且新檢出了石竹烯和杜香醇等獨特芳香成分。由此可見功能菌強化主要提高了目標代謝組分的含量,改變大曲群落及理化性質,而陳曲強化發酵的大曲理化等各種參數與傳統大曲相似性更高,為白酒釀造提供了更多的可能性。