常壓室溫等離子體誘變選育產單寧酶炭黑曲霉及發酵參數優化

董弦弦,吳曉江,張鈺龍,巫小丹,萬茵,劉成梅,付桂明*

1 (食品科學與技術國家重點實驗室(南昌大學),江西 南昌,330000)2 (南昌大學 食品學院,江西 南昌,330000)3 (南昌大學 國際食品創新研究院,江西 南昌,330000)

單寧酶(tannase,EC 3.1.1.20),又稱單寧酰基水解酶,可以催化水解單寧中的酯鍵與縮酚羧鍵生成葡萄糖、沒食子酸等化合物[1-2],被廣泛應用于食品、動物飼料、速溶茶、釀造、制藥等工業領域[3-6]。單寧酶是一種胞外誘導酶,由真菌、細菌等多種微生物誘導產生,如GOVINDARAJAN等[7]使用陰溝腸桿菌進行液態發酵產酶,并進行發酵條件優化,其單寧酶酶活力為2.26 U/mL；SHARMA等[8]以茶渣作為發酵底物,使用黑曲霉固態發酵產酶,30 ℃下培養96 h后,單寧酶酶活力達1.86 U/g,并探究其在番石榴汁中的應用。目前主要選擇絲狀真菌作為單寧酶的工業化生產菌株,但存在產酶活力低、生產成本高的缺點[9]。因此,采用誘變選育技術提高菌株單寧酶產量是降低生產成本的可行途徑。常見的誘變方法有紫外誘變[10]、N+注入[11]、甲基磺酸乙酯[12]等,但這些誘變方法存在對操作人員有危害、突變庫容量小、菌種遺傳穩定性差等缺點。

常壓室溫等離子體 (atmospheric room temperature plasma,ARTP)是一種新型微生物誘變育種技術[13],具有安全性高、突變率高等優勢,目前已經成功應用于細菌、放線菌、真菌、微藻等近60種微生物[14]。例如,LIU等[15]采用ARTP誘變技術與實驗室適應性進化相結合的方法,提高了凝結芽孢桿菌的pH耐受性和細胞膜通透性；毛斌等[16]為獲得高產中性蛋白酶菌株,使用ARTP對米曲霉進行處理,篩選得到1株高產突變株,其中性蛋白酶活力提高21.0%。

本研究以實驗室前期分離獲得的1株產單寧酶能力較強的炭黑曲霉AspergilluscarbonariusFCYN212為研究對象,進行ARTP誘變選育高產單寧酶菌株,并利用5 L全自動發酵罐進行發酵參數優化,為單寧酶的大規模發酵生產及在食品發酵中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

出發菌株：炭黑曲霉(Aspergilluscarbonarius)FCYN212(GenBank No.KX912228)由本實驗室前期篩選獲得。

1.1.2 培養基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato detrose agar,PDA)培養基：稱取200 g馬鈴薯,加入1 L水,煮沸20 min,冷卻過濾后補足水至1 L,加入20 g葡萄糖和20 g瓊脂,pH自然。121 ℃ 20 min滅菌。

初篩培養基：3 g NaNO3、1 g K2HPO4、0.5 g KCl、0.5 g MgSO4、0.01 g FeSO4·7 H2O、30 g蔗糖、0.04 g溴酚藍、10 g單寧酸,蒸餾水1 L,調節pH 至4.5～5 (固體培養基外加30 g瓊脂)。121 ℃ 15 min滅菌。

液體發酵培養基：3 g NaNO3、1 g K2HPO4、0.5 g KCl、0.5 g MgSO4、0.01 g FeSO4·7 H2O、30 g蔗糖,調pH為5.0；添加10 g單寧酸。121 ℃ 15 min滅菌。

1.1.3 儀器與設備

SP-756P可見分光光度計,上海光譜儀器有限公司；ARTP-Ⅱ型ARTP誘變育種儀,無錫源清天木生物科技有限公司；BioCore QF-5全自動發酵罐,上海楚怡生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 孢子懸浮液的制備

將炭黑曲霉A.carbonariusFCYN212接種于PDA斜面培養基,28 ℃培養 4 d,用預先滅菌的0.9%的生理鹽水沖洗孢子,得到單孢子懸液。

1.2.2 炭黑曲霉生長時間與產單寧酶關系

將1 mL孢子懸浮液(108CFU/mL)接種到液體培養基中,28 ℃、180 r/min培養24、48、72、96、120 h,抽濾菌絲,105 ℃烘干至恒重；發酵液4 ℃透析后,測定胞外單寧酶酶活力[17]。

1.2.3 ARTP誘變

將10 μL炭黑曲霉菌懸液涂布于無菌金屬載片上,設置處理功率120 W,氣量10 SLM,誘變處理時間分別為60、120、180、210、240、300、360 s。將金屬載片放入裝有1 mL無菌生理鹽水的離心管中,振蕩1 min。取100 μL稀釋涂布于初篩培養基,28 ℃培養4 d,以未經ARTP處理的懸浮液作為對照。計算不同處理時間的致死率,如公式(1)所示：

(1)

式中：A,菌液處理時間0 s(對照組),稀釋涂布菌落計數；B,菌液處理一定時間(實驗組),稀釋涂布菌落計數。

1.2.4 初篩

將誘變后的菌懸液,稀釋涂布于初篩培養基,測定菌落周圍顯色圈直徑(H)與菌落直徑(D),以H/D值衡量菌株產單寧酶能力。

1.2.5 復篩

選取H/D值較大的菌株,按照1.2.2的方法進行液體發酵復篩,篩選出產單寧酶能力提高的突變菌株。

1.2.6 單寧酶活性的測定

參考MONDAL等[17]的檢測方法。酶活力定義：每分鐘水解1 μmol單寧酸底物所需要的酶量定義為1個酶活力單位 (U)。

1.2.7 遺傳穩定性實驗

將復篩得到的突變株在初篩斜面培養基中28 ℃連續傳代8次,液態發酵測定傳代后菌株產酶能力。

1.2.8 炭黑曲霉突變株發酵產酶條件優化

以單寧酶酶活力為評價指標,以誘導物濃度、接種量、培養時間、溶氧量、誘導物添加時間為單因素變量,利用全自動發酵罐進行產酶優化實驗。

1.2.8.1 種子液培養

按照1.2.2的方法,培養2 d為種子液,將種子液按照體積分數1%接種于全自動發酵罐中,進行發酵參數優化。

1.2.8.2 誘導物濃度對突變株發酵產酶的影響

以單寧酸為誘導物,改變其質量濃度為20～70 g/L,設置轉速180 r/min、培養溫度28 ℃、溶氧濃度按體積分數控制為40% (溶氧濃度與轉速、氣體偶聯),接種后發酵3 d,測定發酵液中酶活力,確定最優濃度。

1.2.8.3 接種量對突變株發酵產酶的影響

按照上述優化后發酵參數,將接種量(體積分數)設置為0.5%、1%、2%、3%、4%,發酵完成后,測定發酵液中酶活力,確定最優接種量。

1.2.8.4 發酵時間對突變株發酵產酶的影響

按照上述優化后發酵參數,于2、3、4、5 d取樣,測定發酵液中酶活力,確定最優發酵時間。

1.2.8.5 溶氧體積分數對突變株發酵產酶的影響

設置溶氧體積分數為30%、35%、40%、45%、50% (溶氧體積分數與轉速、氣體偶聯),按照上述優化后參數,發酵完成后,測定發酵液中單寧酶酶活力,確定最優溶氧體積分數。

1.2.8.6 誘導物添加時間對突變株發酵產酶的影響

按照上述優化后參數,設置誘導物添加時間為24、36、48、60 h,發酵完成后,測定發酵液中酶活力確定最優添加時間。

1.2.9 數據處理

采用Excel 2016和Origin 9.0對實驗數據進行處理與分析,結果以平均值±標準偏差形式表示。采用SPSS 24.0軟件進行單因素方差分析,P<0.05時表示數據間具有顯著差異。每組實驗重復測定3次。

2 結果與分析

2.1 炭黑曲霉生長時間與產單寧酶關系

如圖1所示,炭黑曲霉在培養48 h后進入對數生長期末期,此時酶活力增加最快；在培養96 h時進入穩定期,此時酶活力最高達到了(0.095 3±0.003 6) U/mL,趨于穩定。對數生長期的菌體生長活躍、細胞密度大,能提高誘變效率[18]。因此選擇生長48 h的菌體進行誘變處理,選擇培養96 h作為酶活力對比的時間點,進行后續篩選工作。

圖1 炭黑曲霉生長時間與產單寧酶關系

2.2 炭黑曲霉致死率

炭黑曲霉致死率如圖2所示。菌體的致死率在前120 s急劇上升,處理120 s時致死率接近90%;處理120～240 s時,呈現逐漸平穩的趨勢,這可能是因為微生物的自我修復功能發揮作用,此時易發生回復突變；處理420 s致死率接近100%。據文獻報道,當致死率處于85%～95%時,可獲得最大程度的正突變[19],結合正突變率曲線,選擇誘變時間為180 s。

圖2 ARTP誘變時間對炭黑曲霉的致死率和正突變率的影響

2.3 炭黑曲霉突變株初篩實驗結果

如圖3所示,誘變后的陽性突變株顯色圈顯著大于初始菌株,說明ARTP誘變顯著提高了炭黑曲霉的產單寧酶能力。

a-誘變前；b-誘變后

如表1所示,以H/D值衡量菌株產單寧酶能力,挑選100株H/D值較大的菌株。初始菌株H/D值為1.356,誘變后最小值為1.405,最大值1.847。

表1 誘變后的陽性突變株顯色圈 (初篩結果)

續表1

菌株編號顯色圈直徑H/mm菌落直徑D/mmH/D菌株編號顯色圈直徑H/mm菌落直徑D/mmH/D2961.240.81.5008059.739.91.4963056.438.11.4808164.141.51.5453164.540.21.6048261.237.91.6153263.839.41.6198362.738.11.6463368.439.41.7368460.739.51.5373457.234.51.6588562.439.61.5763558.341.51.4058665.741.51.5833656.737.51.5128759.837.21.6083767.543.21.5638860.837.91.6043859.138.71.5278961.439.81.5433963.442.81.4819064.741.61.5554061.733.41.8479163.536.41.7454167.245.21.4879258.935.71.6504258.435.51.6459360.534.61.7494362.541.21.5179461.339.41.5564461.540.51.5199559.738.11.5674563.742.41.5029663.439.51.6054659.438.51.5439758.638.61.5184758.436.41.6049861.739.41.5664862.839.51.5909962.439.21.5924965.940.51.62710065.440.11.6315063.441.71.521

2.4 炭黑曲霉突變株的復篩

將初篩得到的100株菌進行搖瓶發酵復篩,復篩結果如圖4所示,篩選得到1株產單寧酶能力較高的突變株,酶活力為0.212 U/mL,與原始菌株酶活力0.135 U/mL相比提高了57%,遠高于KUMAR等[20]所報道的0.062 5 U/mL。將得到的單寧酶高產菌株命名為NCUF M8。

圖4 100株炭黑曲霉突變株搖瓶發酵復篩結果

2.5 高產菌株的傳代穩定性分析

如圖5所示,菌株經過8次傳代并進行液態發酵,單寧酶平均酶活力為 (0.208±0.002 5) U/mL。結果表明炭黑曲霉突變株NCUF M8具有較好的穩定性,能高效生產單寧酶。

圖5 突變株NCUF M8的遺傳穩定性

2.6 炭黑曲霉突變株發酵產酶條件的優化

2.6.1 誘導物濃度對菌株產單寧酶的影響

如圖6所示,隨著誘導物單寧酸濃度的逐漸升高,菌株NCUF M8產單寧酶酶活力逐漸升高,在單寧酸質量濃度為60 g/L時達到最高,為 (0.752±0.019) U/mL；當單寧酸質量濃度>60 g/L,酶活力有所降低,這可能是高濃度的單寧酸對微生物生長有著一定的抑制作用[21]。

圖6 誘導物濃度對突變株產單寧酶能力的影響

2.6.2 接種量對菌株產單寧酶的影響

如圖7所示,當接種量為2%時,發酵液中的單寧酶酶活力最高為(0.783±0.017 6) U/mL。在發酵產酶過程中,接種量過高,營養物質消耗過快,積累的代謝物會影響細胞的生長,從而影響酶的產量[22]；接種量過低,細胞生長緩慢,從而延長了發酵周期,使產酶量偏低。

圖7 不同接種量對突變株產單寧酶能力的影響

2.6.3 發酵時間對菌株產單寧酶的影響

如圖8所示,當發酵時間為4 d時,菌株產單寧酶能力最高,酶活力達(0.815±0.018) U/mL,此后酶活力趨于平穩。這是因為進入發酵后期,培養基中營養物質消耗殆盡,微生物開始衰老,導致酶產量降低[23]。發酵時間確定為4 d。

圖8 發酵時間對突變株產單寧酶能力的影響

2.6.4 溶氧體積分數對發酵產單寧酶的影響

發酵液中的溶氧體積分數對微生物的繁殖和代謝物形成有著重要的影響。炭黑曲霉為好氧微生物,發酵液的溶氧體積分數直接影響其產單寧酶能力。如圖9所示,當溶氧體積分數為45%時,單寧酶酶活力最高達到 (0.882±0.011) U/mL,此后酶活力開始下降。

圖9 溶氧體積分數對突變株產單寧酶能力的影響

2.6.5 誘導物添加時間對發酵產單寧酶的影響

如圖10所示,當誘導物添加時間為24 h時,對菌株產單寧酶能力影響不明顯；當添加時間為36 h時,菌株產酶能力最高,酶活力達 (1.377±0.029) U/mL,此后添加誘導物菌株產酶能力顯著下降。這是由于炭黑曲霉突變株NCUF M8生長速度較快,在36 h時達到對數生長末期,此時添加誘導物有益于菌株生產單寧酶[24]。

圖10 單寧酸添加時間對突變株產單寧酶能力的影響

3 結果與討論

本研究利用ARTP誘變技術對炭黑曲霉FCYN212進行誘變,結合溴酚藍顯色圈法的初篩和搖瓶發酵復篩,選育出產單寧酶能力較高的突變株NCUF M8。突變菌株NCUF M8于28 ℃、180 r/min搖瓶發酵96 h,胞外酶活力達到0.212 U/mL,較原始菌株提高57%。經過8次的傳代培養,突變株產單寧酶能力穩定。優化后發酵工藝為：發酵時間4 d、接種量2%、單寧酸質量濃度60 g/L、溶氧體積分數45%、誘導物添加時間36 h,此時胞外單寧酶酶活力達到最大,為1.377 U/mL,與優化前相比發酵參數提高了549%。本研究通過誘變育種提高單寧酶酶活力,進一步通過工藝優化，將炭黑曲霉產酶能力提高了920%,為進一步開發該菌株產單寧酶的工業化奠定了基礎。