植物乳桿菌CGMCC8198 β-羥脂酰-ACP脫水酶啟動子的克隆及其冷激調節作用分析

周成慧,趙陽,王德行,席茂盛,羅學剛*

1(天津科技大學 生物工程學院 工業發酵微生物教育部重點實驗室暨天津市工業微生物重點實驗室,天津,300457)2(天津市微生物代謝與發酵過程控制技術工程中心,天津,300457)

乳酸菌是目前最為公認的一大類益生菌,其食用安全,并可對人體發揮多種健康功能,在食品、醫藥、畜牧業等領域有著廣闊的應用前景[1-2]。溫度在乳酸菌的制備、儲存、應用中有重要的影響。乳酸菌作為最理想的功能蛋白質多肽類藥物的口服投遞載體,在對外源基因進行重組表達時,低溫誘導往往能有助于降低包涵體形成、減少重組蛋白的降解,提高重組蛋白的生物活性[3-5],且能夠降低能耗、減少工業生產成本。

β-羥脂酰-ACP脫水酶(fabz)是Ⅱ型脂肪酸合成途徑中的重要酶,它主要負責催化β-羥脂酰-ACP脫水生成反-2-烯酰-ACP,其編碼基因是fabZ。如果fabZ被抑制,細菌的生長和繁殖過程中的重要生物合成途徑將會受到阻斷,細菌無法生長[6]。目前基于fabZ基因的研究大多在于其具體結構與功能[7-9],尚未有文獻報道溫度與其轉錄調控間的關系。本研究在分析植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)CGMCC8198在不同溫度處理后的轉錄組測序結果時發現,fabZ基因在溫度降低時表達量明顯上調。為明確這一低溫誘導特性,本研究首先使用生物信息學方法對基因的啟動子區域進行了分析預測[10-13],再以綠色熒光蛋白為報告基因構建啟動子報告分析質粒,驗證了fabZ基因啟動子的轉錄活性及其受溫度影響的情況,以期為深入探究乳酸菌冷激應答與fabZ基因功能機理及構建乳酸菌低溫誘導表達載體奠定一定的基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株和載體

植物乳桿菌TCCC11824(CGMCC No.8198)、EscherichiacoliDH5α、E.coliBL21(DE3)、質粒pENTR223-CGREF1-EGFP、質粒pET28a+,均為本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑和儀器

質粒小提試劑盒,北京索萊寶科技有限公司；限制性內切酶,Fermentas公司；T4DNA連接酶,Thermo Scientific公司；PfuDNA聚合酶和dNTPs,北京康為世紀生物科技公司。本實驗選用PCR引物以及序列測序均由蘇州金唯智生物科技有限公司完成(表1)。5020 Arktik Thermal Cycler,美國Thermo公司；M200PRO 型光柵型多功能酶標儀,瑞士帝肯有限公司；BX53F型正置熒光顯微鏡,日本OLYMPUS會社。

表1 引物名稱與序列

1.2 實驗方法

1.2.1 細菌RNA的提取與逆轉錄

細菌總RNA提取后進行逆轉錄,逆轉錄與實時熒光定量PCR體系及條件為：2.5 μg RNA,1 μg隨機引物,2 μL 10 mmol/L的dNTPs,6.375 μL DEPC水；70 ℃放置5 min后,迅速冰浴2 min；依次加入5 μL的5×Buffer,5 μL 0.1 mol/L的dNTP,40 U/μL的RNA酶抑制劑0.625 μL,1 μL逆轉錄酶M-MLV(200 U/μL)混勻,37 ℃反應1 h；70 ℃放置15 min,-20 ℃保存。反應條件：95 ℃,5 min；95 ℃,30 s；退火溫度50 ℃,30 s；72 ℃,30 s,30個循環；72 ℃延伸10 min。

1.2.2fabZ基因序列系統進化分析

將fabZ基因在美國國家技術信息中心網站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上進行BLAST同源性分析與查找,然后利用MEGA 7.0軟件對所有fabZ基因進行分析,并構建系統進化樹。

1.2.3 基因序列分析

利用BPROM(http://www.softberry.com/berry.phtml?topic=bprom&group=programs&subgroup=gfindb)和BDGP(https://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)數據庫進行啟動子及轉錄因子結合位點預測；利用IPSW(https://home.jbnu.ac.kr/NSCL/PseDNC-DL.htm)數據庫鑒定啟動子真偽及其強度。使用WebLogo 3.0(http://weblogo.threeplusone.com)對預測的啟動子序列-10、-35區創建序列徽標圖。

1.2.4 載體的構建與鑒定

以質粒pENTR223-CGREF1-EGFP為模板,F-E、F-R為引物,擴增得到基因EGFP,反應條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 45 s；56 ℃ 45 s；72 ℃ 1 min；循環30次,72 ℃ 10 min。將EGFP目的片段插入pET28a載體的EcoRI和NotI酶切位點構建載體pET28a-EGFP。以L.plantarumCGMCC8198的cDNA為模板,F-Z、R-Z為引物擴增fabZ基因的啟動子區域,反應條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 45 s；55 ℃ 45 s；72 ℃ 45 s；循環35次,72 ℃,10 min。將啟動子區域插入pET28a-EGFP載體的BglII與XbaI酶切位點之間構建載體pET28a-PfabZ-EGFP。

1.2.5 熒光顯微鏡的檢測

提取構建成功的重組表達質粒pET28a-EGFP、pET28a-PfabZ-EGFP分別轉化E.coliBL21(DE3)感受態細胞。同時轉化空質粒pET28a+作為陰性對照。重組菌株接種于50 mL發酵培養基中,于37 ℃下,培養至OD600約為0.6～0.8時,將搖瓶置于14 ℃誘導培養6 h。離心收集菌體,PBS洗滌重懸,使用正置熒光顯微鏡檢測細胞EGFP熒光表達情況。

1.2.6 酶標儀檢測相對熒光強度

將含有重組表達質粒pET28a-EGFP、pET28a-PfabZ-EGFP的菌株接種于50 mL發酵培養基中,分別為T7-14、T7-37、fabZ-14、fabZ-37組。在37 ℃培養至OD600約為0.6～0.8時,將T7-14,fabZ-14組搖瓶放置于14 ℃低溫培養20、40和60 min,收集不同時間的菌液。T7-37、fabZ-37組放置于37 ℃,同14 ℃組進行取樣。PBS洗滌重懸菌體,使用熒光酶標儀檢測EGFP熒光強度(激發波長488 nm,發射波長510 nm)[14],同時測其OD600值,以空質粒pET28a+轉化E.coliBL21(DE3)誘導培養作為對照去除背景干擾,相對熒光強度(RFU/OD600)為熒光強度值比對應細胞密度OD600值。

2 結果與分析

2.1 低溫刺激后乳酸菌的基因相對表達情況

采用瓊脂糖凝膠電泳檢測所選擇的目的基因fabZ在乳酸菌接受冷刺激不同時間后的轉錄情況,結果如圖1所示。fabZ基因在低溫刺激后mRNA相對表達量上調,4 ℃低溫刺激20 min時其表達量大約是在37 ℃時的3.7倍;40 min時其差異達到最大為6倍;1 h后4 ℃時的mRNA相對表達量大約是37 ℃時的4倍,表明fabZ基因有低溫誘導轉錄上調的特點。

a-基因表達水平的電泳檢測圖;b-基因相對表達量

2.2 基于fabZ基因序列構建的分子進化樹

使用MEGA 7.0軟件,將L.plantarumCGMCC8198的fabZ基因與其他11個不同近緣物種的乳酸菌的fabZ基因進行聚類分析,建立其發育樹。結果如圖2所示,L.plantarumCGMCC8198fabZ基因與乳桿菌屬fabZ基因的親緣關系最近,同源性最高達到100%；與片球菌屬接近,基因同源性為76%；乳酸菌屬則聚為另一支為55%。同鏈球菌屬的遺傳距離相距較遠,是單獨的一個分支。而已有文獻報道顯示Lactococcusgarvieaestrain PAQ102015-99 A7X72的fabZ基因(ID:NZ_LXWL01000001.1)與促進冷加工有關[15],說明該基因可能更早起源于鏈球菌,且與低溫應答有一定關系。

圖2 fabZ基因的系統發育樹

2.3 生物信息學方法對啟動子主要元件的分析

生物信息學結果顯示fabZ基因前500 bp區域內存在潛在的啟動子。IPSW數據庫鑒定fabZ是一個強啟動子。其結果(圖3-a)顯示序列中有明顯的-10、-35區域,轉錄因子結合位點(TFBS)序列顯示與rpoD15轉錄因子的結合有關,WebLogo 3.0保守性鑒定(圖3-b)顯示-10區、-35區的6個核苷酸序列中的位置分別與經典的-10區(TATAAT)、-35區(TTGACA)相似。

a-fabZ基因啟動子序列;b-fabZ基因啟動子-10、-35區保守性鑒定

2.4 pET28a-PfabZ-EGFP重組表達載體的構建

圖4-a中pET28a-EGFP重組質粒通過EcoRI、NotⅠ雙酶切和PCR產物鑒定,pET28a-PfabZ-EGFP質粒通過BglII、XbaⅠ雙酶切和PCR產物鑒定(圖4-b),分別得到符合預期的目標條帶,表明質粒構建成功,再進行測序后,將測序正確的轉化子用于下一步試驗。

M-marker;1-pET28a+質粒；2-EGFP PCR產物；3-pET28a-EGFP采用EcoRI 和 NotI雙酶切；4-pET28a-EGFP質粒；5-PfabZ PCR產物；6-pET28a-PfabZ-EGFP采用BglII 和 XbaI雙酶切

2.5 綠色熒光蛋白檢測啟動子表達情況

使用熒光顯微鏡檢測重組細胞EGFP表達情況,在重組菌細胞內觀察到產生的熒光(圖5),不含綠色熒光蛋白的載體未出現熒光,結果說明啟動子PfabZ可調控綠色熒光蛋白的表達。確定插入的片段具有啟動子功能,證明構建所得的啟動子探針質粒成功分離并鑒定出fabZ基因的啟動子。

圖5 綠色熒光蛋白在重組菌株中表達

2.6 EGFP 熒光強度的定量檢測

利用多功能酶標儀檢測對數期含不同啟動子菌株的菌體密度以及EGFP的熒光相對表達強度。菌體生長如圖6-a所示,在14與37 ℃,2株菌生長趨勢相似,說明啟動子的改變未對菌株的生長造成影響。在14 ℃低溫環境下,含T7啟動子和fabZ啟動子的菌株緩慢生長,但含有fabZ啟動子的菌株的相對熒光強度卻明顯增加,說明啟動子效應增強。

a-低溫刺激1 h 重組菌的生長曲線；b-各啟動子在不同溫度下的相對熒光強度

被PfabZ啟動子誘導表達綠色熒光蛋白的大腸桿菌在14 ℃的蛋白表達量明顯高于37 ℃時的蛋白表達量,20 min時,是37 ℃的1.30倍；40 min時,差異最大達到2.38倍;1 h后差異變為1.42倍。且在14 ℃時的蛋白表達量與含PT7的重組菌的表達量相當(圖6-b)。推測PfabZ啟動子中可能含有與低溫誘導表達相關的結合位點,在低溫刺激后可啟動EGFP的表達。而被PT7誘導的大腸桿菌在14 ℃的蛋白表達量與37 ℃時的蛋白表達量由在20 min時的1.13倍的差異變為0.74倍,最后變為0.58倍,推測其在低溫下表達受到抑制。這些結果證實fabZ啟動子可用于構建低溫誘導型重組表達質粒。

3 結果與討論

低溫下誘導表達重組蛋白可以提高易凝集蛋白的可溶性,從而獲得活性高的蛋白質或者多肽。一些重要的低溫酶及功能性低溫蛋白基因在常溫下啟動子無法正常轉錄,或者即使被轉錄表達,也可能因為低溫蛋白的熱穩定性差、常溫下不正確折疊而失活。因此分離得到能在低溫下高效表達的啟動子具有重要意義。此前研究分別在低溫菌[16]和深海細菌[17]中成功篩到低溫啟動子,并在大腸桿菌成功表達。本研究從乳酸菌轉錄組中篩選出了低溫強啟動子PfabZ,在大腸桿菌體內進行誘導表達,其低溫誘導強度與T7啟動子相當,可用于構建適于熱不穩定蛋白質高效表達的低溫外源蛋白質表達系統。同時,本研究構建的啟動子報告分析質粒具有檢測靈敏度高、結果直觀、篩選過程簡單、迅速等優點,亦可應用于其調節劑的篩選及轉錄調控機理研究等工作,為其深入研究打下基礎。

乳酸菌低溫脅迫應激機制的研究已經取得了一定進展,但仍有許多難點未解決。目前,大部分的研究主要停留在細胞水平,從分子水平上闡述乳酸菌環境脅迫機制的研究還不是很充分。另一方面,隨著新一代測序技術的飛速發展,更多的生物基因組序列被逐步確定,但對大量涌現的基因功能的挖掘則遠遠不夠,探究乳酸菌基因組中的功能序列元件為闡明其轉錄調控分子機制、提升其應用水平具有重要價值[18]。本研究首次發現植物乳桿菌的fabZ是一個低溫上調基因,KEGG通路分析表明此基因參與脂肪酸的代謝及合成[19]。許多研究表明在各種不利環境下乳酸菌細胞膜脂肪酸含量與組成都會發生調整,從而使細胞膜能夠在較差環境下保持流動性,以提高細胞膜的抗逆性[20]。本研究提示fabZ也可能通過影響細胞脂肪酸代謝,在乳酸菌抵御低溫脅迫過程中發揮著重要作用,這些發現將為揭示乳酸菌在生產、儲存等過程中受到溫度影響下的應答機制及提升生產工藝,提供一些新的思路。