HPLC 測定甲基硫菌靈可濕性粉劑中有效成分的方法研究*

李建兵，喬海清，劉 黎，李世全，王曉濱

（1.青島市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院，山東 青島 266101；2.國家海洋精細化工及其生物制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心，山東 青島 266101；3.青島市黃島區(qū)檢驗檢測中心，山東 青島 266555）

農(nóng)藥是確保農(nóng)業(yè)高收豐產(chǎn)的重要農(nóng)資之一，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)離不開農(nóng)藥[1]。我國是農(nóng)藥生產(chǎn)和使用大國，也是農(nóng)藥出口大國。農(nóng)藥產(chǎn)品質(zhì)量事關(guān)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)安全、農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全和生態(tài)環(huán)境安全，然而農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公布的近3 年農(nóng)藥產(chǎn)品質(zhì)量總體合格率為88.7%，不合格產(chǎn)品主要集中于有效成分不合格和隱性農(nóng)藥的添加[2]。農(nóng)藥有效成分及含量的監(jiān)管面臨著嚴峻的考驗，關(guān)鍵在于農(nóng)藥中有效成分和隱性成分的準確定量測定。

各類農(nóng)藥及其制劑產(chǎn)品中有效成分的液相色譜檢測方法大多選用甲醇或者甲醇水作為溶劑，可濕性粉劑在加工過程中一般會加入載體和助劑，甲基硫菌靈的測定一般用甲醇提取[3,4]，外標法具有操作簡單，分析快速的優(yōu)點，但在復(fù)雜組分中可能存在基質(zhì)效益的影響；標準加入法能夠有效消除基質(zhì)干擾，但操作略為復(fù)雜，結(jié)果更加準確[5]。本文選取常見的甲基硫菌靈可濕性粉劑為研究對象，采用高效液相色譜法進行分析，采用外標法和標準加入法兩種定量測定方法進行比較研究，為在以后的農(nóng)藥產(chǎn)品仲裁檢驗、產(chǎn)品復(fù)檢、標準制修訂時提供依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

1200 高 效 液 相 色 譜 儀（Agilent）；ML204T/02，0.1mg 電子天平（METTLER）。

甲醇（色譜純CNW 安譜）。

標準物質(zhì)：甲基硫菌靈（Dr.Ehrenstorfer）。

1.2 液相色譜條件

Thermo Hypersil Gold C18柱（250mm×4.6mm，粒徑5μm），流動相甲醇∶水=60∶40，流速1.0mL·min-1，進樣體積10μL，紫外檢測器，檢測波長269nm。

1.3 標準溶液配置

1.3.1 標準儲備液 稱取0.1g（精確至0.0001g）甲基硫菌靈標準物質(zhì)于50mL 容量瓶中，加入甲醇溶解，并定容至刻度線，配制成2mg·mL-1的標準儲備液。

1.3.2 標準中間液 準確移取5.0mL 1.3.1 標準儲備液于50mL 容量瓶中，加入甲醇定容至刻度線，配制成0.2mg·mL-1的標準中間液。

1.3.3 外標法標準工作液 取1.3.1 標準儲備液和

1.3.2 標準中間液用甲醇逐級稀釋成0.02～0.6mg·mL-1的標準工作液。

1.4 樣品前處理

共選取3 個不同廠家甲基硫菌靈可濕性粉劑產(chǎn)品，標稱濃度為70%。

1.4.1 外標法前處理 分別稱取0.1、0.143、0.2、0.4g 樣品于50mL 容量瓶中，然后準確移取5.0mL于50mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度線，稀釋10倍，過濾待測。

1.4.2 標準加入法前處理 分別稱取0.1、0.143g 各3 組樣品于50mL 容量瓶中，加入甲醇溶解定容至刻度線。準確移取5.0mL 于50mL 容量瓶中，第2、3 組樣品再準確加入2.5 和5.0mL 0.2mg·mL-1標準使用液（1.3.2），用甲醇定容至刻度線。過濾待測。

2 結(jié)果與討論

2.1 外標法標準曲線繪制

外標法配制0.02～0.6mg·mL-1的標準曲線，以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標進行線性回歸分析，線性回歸方程為y=30916.4x+14.15。標準加入法曲線按照1.4.3 處理，以0 倍、1 倍、2 倍加標量峰面積為縱坐標，加標量為橫坐標擬合曲線并進行樣品檢測。外標法和標準加入法曲線線性相關(guān)系數(shù)R2均大于0.99，結(jié)果表明，在所測定濃度范圍內(nèi)，標準曲線線性良好。

2.2 方法精密度

取其中一個70%甲基硫菌靈可濕性粉劑樣品連續(xù)測定8 次，外標法和標準加入法精密度分別為0.83%和1.49%（見圖1），表明外標法和標準加入法精密度良好。

圖1 外標法和標準加入法精密度Fig.1 Precision of external standard method and standard addition method

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)是農(nóng)藥測定時不可忽視的一個重要問題，采用t 檢驗比較外標法和標準加入法標準曲線斜率來考察甲基硫菌靈可濕性粉劑的基質(zhì)效應(yīng)。標準加入法與外標法斜率比較的t 值根據(jù)公式（1）計算。標準加入法與外標法斜率統(tǒng)計量t 值為96.24（＞t（11）0.05臨界值=2.20）。統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，對于甲基硫菌靈可濕性粉劑，標準加入法的斜率與外標法的斜率存在顯著差異（置信水平α=0.05）。標準加入法的斜率遠小于外標法斜率，這表明，甲基硫菌靈可濕性粉劑的基質(zhì)效應(yīng)為強的抑制效應(yīng)，標準加入法定量甲基硫菌靈可濕性粉劑的檢測結(jié)果更可靠。

式中 t：標準加入法與外標法斜率的統(tǒng)計量；X：標準加入法斜率平均值；μ：外標法斜率；σX：標準加入法斜率標準差；n：標準加入法斜率測定次數(shù)。

2.4 外標法及標準加入法的檢出限和定量限

以3 倍和10 倍信噪比作為外標法和標準加入法的檢出限和定量限。外標法檢出限和定量限分別為4mg·kg-1和14mg·kg-1，標準加入法檢出限和定量限23mg·kg-1和78mg·kg-1。外標法和標準加入法的檢出限和定量限差別較大可能是由于標準加入法的抑制基質(zhì)效應(yīng)產(chǎn)生的。

2.5 外標法和標準加入法的統(tǒng)計學(xué)分析

依照1.4 樣品處理和1.2 液相色譜條件，對3 個不同廠家的產(chǎn)品分別用外標法和標準加入法進行了檢測，3 個產(chǎn)品標準加入法定量結(jié)果分別為70.09%、70.11%、70.91%；外標法定量結(jié)果分別為73.34%、73.73%、74.11%。采用F 檢驗對標準加入法和外標法定量結(jié)果進行比較，標準加入法與外標法（p<0.001）有顯著差異（見表1）。對任意兩種不同定量方法測試結(jié)果的一致性采用t 檢驗方法進行比較，有顯著差異的兩種定量方法，采用異方差假設(shè)的t 檢驗方式。統(tǒng)計結(jié)果表明，標準加入法與外標法檢測結(jié)果間存在顯著差異（顯著性水平α=0.05）；而標準加入法檢測的結(jié)果更接近企業(yè)按照配方生產(chǎn)的甲基硫菌靈可濕性粉劑的標稱濃度，間接說明標準加入法檢測的結(jié)果更加準確和可靠。

表1 甲基硫菌靈可濕性粉劑兩種定量方法測定結(jié)果（采用F 檢驗）Tab.1 F test of two different quantitative methods of thiophanate-methyl in wettable powder

表2 甲基硫菌靈可濕性粉劑兩種定量方法測定結(jié)果（采用t-檢驗）Tab.2 t-test of two different quantitative methods of thiophanate-methyl in wettable powder

3 結(jié)論

本文利用HPLC 法對不同的70%甲基硫菌靈可濕性粉劑農(nóng)藥產(chǎn)品進行測定，通過對外標法和標準加入法分別定量分析比較，兩種方法線性好，精密度高，外標法測定甲基硫菌靈可濕性粉劑時存在基質(zhì)效應(yīng)，F(xiàn)-檢驗和t-檢驗進一步證實標準加入法和外標法在測定甲基硫菌靈可濕性粉劑時存在顯著差異，在實際檢測中建議采用標準加入法獲得更加準確可靠的結(jié)果。